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La synthèse des ribosomes entraîne la formation du nucléole
Les ribosomes sont des complexes ribonucléoprotéiques (RNP), constitués d’ARN ribosomiques (ARNr) et de protéines ribosomiques (PRs). Deux sous-unités (une grande et une petite) forment ce complexe, dont le rôle est de traduire les ARN messagers (ARNm) en enchaînement d’acides aminés dans les cellules de tous les organismes vivants. La traduction étant un processus vital pour la cellule, les séquences des ARNr comme des PRs ont été extrêmement conservées au cours de l’évolution. Chez les procaryotes, la grande sous-unité 50S est composée d’ARNr 23S, ARNr 5S et de 34 PRs et la petite sous-unité 30S est constituée d’ARNr 16S et de 21 PRs. Chez les eucaryotes, la petite sous-unité 40S est constituée d’un ARNr 18S associé à 33 protéines ribosomiques. La grande 60S elle est constituée des ARNr 5S, 5.8S et 25S (chez la levure et les végétaux) ou 28S (chez les métazoaires), associés à environ 47 PRs (Weis et al. 2015). La petite sous-unité (30S ou 40S) contient les sites où les ARN de transfert se ixent sur l’ARNm. La grande sous-unité contient le centre peptidyl-transférase, qui catalyse la synthèse de la liaison peptidique entre les acides aminés consécutifs de la protéine (Weis et al. 2015).
Les ARNr constituent le squelete des ribosomes et sont également responsables de leur activité catalytique. En efet, ces ribozymes se replient dans l’espace pour former les sites actifs responsables de la synthèse de protéines, comme le centre peptidyltransférase (Anderson et al. 2007). Les organismes procaryotes possèdent un ou plusieurs opérons codant pour les ARN ribosomiques 16S, 23S et 5S (Klappenbach, 2001). Chez les eucaryotes, les gènes codant pour le précurseur d’ARNr 35S (chez la levure), 45S (chez les végétaux et une grande partie des métazoaires) ou 47S (chez les mammifères), sont répétés en tandem (des centaines voire des milliers de fois en fonction de l’organisme) dans une ou plusieurs régions spéciiques du génome (Garcia et al. 2014 ; Sochorová, 2018). Ces régions s’appellent NORs pour «Nucleolus Organizer Regions» (McClintock, 1934).
Au sein des NORs, les gènes d’ARNr 35S/45S/47S sont séparés entre eux par un espaceur intergénique non transcrit (IGS) et possèdent la séquence codant pour les ARNr 18S, 5,8S et 25S/28S . Ces ARNr sont transcrits par l’ARN Polymérase I (ARN Pol I) en un seul précurseur polycistronique dans le nucléole (Saez-Vasqez et Delseny, 2019 ; Weis et al. 2015). Au microscope électronique, les gènes d’ARNr 35S/45S/47S en cours de transcription peuvent être visualisés grâce à la présence de structures en «arbre de Noël» (Miller et Beatty, 1969). Le tronc de chaque arbre représente l’ADNr et les branches désignent les pré-ARNr en cours de transcription. Les sphères localisées à l’extrémité de chaque branche correspondent aux complexes de maturation et d’assemblage des sous unités ribosomiques. Les gènes d’ARNr 5S sont également organisés en séquences répétées et leur localisation au sein du génome est variable en fonction de l’espèce (Garcia et al. 2014 ; Sochorová, 2018). Ils sont transcrits par l’ARN polymérase III (ARN Pol III). Chez les eucaryotes, les PRs sont produites dans le cytoplasme puis relocalisées dans le nucléole (Weis et al. 2015).
L’ultrastucture du nucléole relète les étapes de biogenèse des ribosomes
Au sein du nucléole, les facteurs impliqués dans les diférentes étapes de la biogenèse des ribosomes sont organisés dans l’espace en fonction de leur rôle. Cete organisation induit la formation de trois compartiments distincts : le composé granulaire (GC), le composé ibrillaire dense (DFC) et le centre ibrillaire (FC) . Cete structure interne du nucléole est due à des diférences de miscibilité entre les protéines des diférents compartiments. La nature tripartite du nucléole est donc également maintenue par séparation de phase liquide-liquide (Feric et al. 2016). Cete coniguration tripartite relète les grandes étapes de la biogenèse des ribosomes.
L’ARN Pol I transcrit les gènes d’ARNr 35S/45S/47S entre la périphérie du FC et la zone interne du DFC. Des événements de maturation précoces des ARNr et le début de l’assemblage avec les PRs ont lieu dans le DFC. D’autres événements plus tardifs de maturation des ARNr ainsi que d’assemblage des pré sous-unités ribosomiques ont lieu dans le GC, où des structures granuleuses peuvent être observées et correspondent aux préribosomes (Stępiński, 2014 ; Weis et al. 2015). Chez de nombreuses espèces, surtout végétales, un quatrième composant nommé cavité nucléolaire, dont le rôle reste méconnu, est parfois visible selon le type cellulaire observé (Stępiński, 2014 ; Weis et al. 2015).
Le nucléole, un organelle multifonctionnel
Cependant, la description du nucléole comme lieu uniquement dédié à la biogenèse des ribosomes a évolué ces dernières années. Une multitude d’études ont révélé l’implication du nucléole dans d’autres processus, comme la réponse au stress, la régulation du cycle cellulaire ou encore le métabolisme d’ARN non ribosomiques. Cete partie va traiter quelques uns des nouveaux rôles atribués à cet organelle.
Le nucléole et le métabolisme d’ARNs non ribosomiques
Il a été montré qu’un grand nombre d’ARN transitent dans le nucléole avant d’être exportés vers le cytoplasme (Boisvert et al. 2007 ; Brown et Shaw, 2008 ; Pederson, 1998 ; Pederson et Politz, 2000). Parmi ceux-ci, des ARN transcrits par l’ARN Pol III, tels que les ARN de transfert (ARNt), ont été identiiés. Chez la levure, le nucléole est le lieu de transcription et d’étapes de maturation précoces des ARNt (Phizicky et Hopper, 2010).
Le nucléole est également impliqué dans le métabolisme des ARNm à travers plusieurs étapes de leurs vie, via la maturation des complexes snRNP de l’epissage ou lors de leur dégradation (Brown et Shaw, 2008 ; Pendle et al. 2005). Aussi, chez Arabidopsis thaliana (Heynh, 1842), des protéines appartenant au complexe protéique Exon Junction Complex (EJC), ont été identiiées dans le nucléole (Pendle et al. 2005). Ce complexe se forme sur la jonction entre deux exons d’un ARNm en cours d’épissage et est exporté vers le cytosol avec ce dernier. Là, il joue un rôle primordial dans la régulation post-transcriptionnelle de l’ARNm. Il est probable que cete localisation permete l’assemblage correct de l’EJC ou bien qu’elle participe à sa régulation fonctionnelle.
Le nucléole et la maturation de complexes snRNP et snoRNP
Le nucléole participe aussi à l’assemblage et/ou maturation de diférents complexes ribonucléoprotéiques nucléaires (snRNP pour small nuclear RNP) et nucléolaires (snoRNP). Tels que le splicéosome, un snRNP intervenant dans l’épissage des ARNm, ou encore le snRNP TR/TRET ou Télomérase. La Télomérase catalyse l’addition de la séquence télomérique à l’extrémité des chromosomes, en utilisant son petit ARN nucléaire (snARN) comme matrice pour la synthèse (Boisvert et al. 2007 ; Brown et Shaw, 2008). De plus, chez Arabidopsis thaliana, les télomères sont regroupés autour du nucléole (Fransz et al. 2002). Lorsque la fonction (et structure) de ce dernier est perturbée, on observe un perte d’association avec le nucléole accompagnée d’un raccourcissement des télomères (Pontvianne et al. 2016b). Ce lien pourrait donc être important dans la synthèse ou réplication des télomères chez cete espèce.
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Table des matières
Introduction générale
1 Le Nucléole
1.1 La synthèse des ribosomes entraîne la formation du nucléole
1.1.1 La stucture du nucléole
1.2 Le nucléole, un organelle multifonctionnel
1.2.1 Le nucléole et le métabolisme d’ARNs non ribosomiques
1.2.2 Le nucléole et la maturation de complexes snRNP et snoRNP
1.2.3 Le nucléole en tant que senseur de stress et dans la réponse au stress
1.2.4 Le nucléole dans la régulation du cycle cellulaire
1.3 Le Nucléole et l’architecture de la chromatine
1.3.1 Diférents niveaux d’organisation chromatinienne
1.3.1.1 Nucléosome, modiications épigénétiques et la compaction de l’ADN
1.3.1.2 L’architecture tridimensionnelle de la chromatine
Les interactions intra- et inter- chromosomiques
Les Compartiments A et B du Génome et Les Domaines
Chromatiniens
1.3.1.3 La localisation spatiale
1.3.2 Les Domaines chromatiniens associés au nucléole
1.3.2.1 La périphérie nucléaire et nucléolaire comme lieu d’ancrage de l’hétérochromatine
2 L’ADN ribosomique
2.1 Structure et localisation de l’ADNr
2.2 La variabilité du nombre de copies de gènes d’ARNr
2.3 L’instabilité de l’ADNr
2.4 L’ADNr et la stabilité génomique
2.4.1 Le nombre de copies de gènes d’ARN ribosomique n’est pas lié au besoin transcriptionnel
2.4.2 Importance de l’ADN ribosomique hétérochromatique dans la stabilité du génome
Résultats
3 La hromatine associée au nucléole d’A. thaliana
3.1 Contexte et objectifs
3.2 L’étude des NADs chez Arabidopsis thaliana
3.2.1 FANS, FANoS et analyse bioinformatique pour l’identiication des NADs
3.2.2 Comparaison des NADs entre deux échantillons
3.2.3 Développement de nouvelles lignées FIB2 ::YFP pour l’étude des NADs
3.3 Les NADs en condition de choc thermique
3.4 Identiication des NADs suite à la transition lorale
3.5 Rôle des gènes d’ARNr 45S dans la composition des NADs
3.6 Discussion
4 L’ADN ribosomique et la stabilité du génome
Discussion générale
Matériel et Méthodes
6.1 Conditions de culture des plantes
6.2 Création de lignées transgéniques FIB2 ::YFP
6.3 Identiication des NADs chez Arabidopsis thaliana
6.4 Visualisation de noyaux et immunolocalisation de protéines nucléaires au microscope confocal
6.5 Analyse de l’expression des gènes
6.6 Identiication des régions diférentiellement méthylées (DMRs)
6.7 Séquençage Nanopore
Bibliographie
Annexes
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