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Les transporteurs au glutamate
Les transporteurs au glutamate (EAAT, excitatory amino acid transporter) sont composés de cinq types : EAAT1 (GLAST), EAAT2 (GLT-1), EAAT3 (EAAC1), EAAT4 et EAAT5. EAAC1 est exprimé par les neurones glutamatergiques et GABAergiques. EAAT4 est exprimé par les cellules de Purkinje du cervelet et EAAT5 par les cellules de Muller de la rétine (Danbolt 2001).
Nous parlerons plus précisément des transporteurs GLAST et GLT-1 qui sont responsables de plus de 80% de la recapture du glutamate (Rothstein, Dykes-Hoberg et al. 1996).
Structure et localisation
Les transporteurs au glutamate sont des protéines de 500 à 600 acides aminés, composées de six domaines transmembranaires avec leurs parties N et C terminales intracellulaires. La forme active de ces transporteurs est homotrimèrique (Haugeto, Ullensvang et al. 1996). Ils forment des oligomères liés de façon non covalente (Shigeri, Seal et al. 2004) et présentent 50 à 60% d’homologie. GLAST et GLT-1 sont localisés à 90% au niveau de la membrane plasmique et sont enrichis au niveau des membranes accolées aux synapses (Chaudhry, Lehre et al. 1995).
GLAST est présent dans toutes les régions du cerveau avec d’importantes variations. Il est majoritaire dans la glie de Bergmann dans le cervelet (Lehre and Danbolt 1998). Il présente des taux élevés d’expression dans l’hippocampe, le bulbe olfactif, le cortex cérébral. Il apparaît dès les stades embryonnaires et son expression augmente jusqu’à l’âge adulte (Figure 3). Il est exprimé à la membrane des astrocytes, par les cellules de Müller de la rétine (Lehre, Davanger et al. 1997), sur des progéniteurs gliaux (Maragakis, Dietrich et al. 2004) et dans la glie radiaire pendant le développement (Shibata, Yamada et al. 1997).
GLT-1 est indétectable avant la naissance et atteint une expression stable après cinq semaines (Furuta, Rothstein et al. 1997). C’est le transporteur majoritaire du cerveau, il représenterait 1% des protéines totales du cerveau (Sheldon and Robinson 2007) (Figure 3). Il est fortement exprimé dans l’hippocampe, le cortex et le striatum (Lehre, Levy et al. 1995). GLT-1 est exprimé dans les astrocytes et les neurones bipolaires de la rétine (Rauen 2000). De nombreuses études montrent la spécificité astrocytaire de GLT-1 (Danbolt, Storm-Mathisen et al. 1992 ; Levy, Lehre et al. 1993; Rothstein, Martin et al. 1994; Lehre, Levy et al. 1995). Mais l’ARNm de GLT-1 est présent dans les neurones du cortex et de l’hippocampe (Torp, Danbolt et al. 1994; Schmitt, Asan et al. 1996; Berger and Hediger 1998; Chen, Mahadomrongkul et al. 2004; Berger, DeSilva et al. 2005), et le transporteur serait faiblement exprimé dans les terminaisons synaptiques des neurones de l’hippocampe (Chen, Mahadomrongkul et al. 2004; Furness, Dehnes et al. 2008). GLT-1 possède un variant d’épissage alternatif appelé GLT-1v ou b. Ce variant est exprimé dans neurones du SNC et de la rétine (Reye, Sullivan et al. 2002; Schmitt, Asan et al. 2002). Ces transporteurs sont également exprimés dans les neurones en condition hypoxique (Pow, Naidoo et al. 2004), pathologique (Scott, Pow et al. 2002) ou pendant le développement (pour revue (Danbolt 2001). Cependant son expression neuronale en condition physiologique reste faible et son rôle reste encore à éclaircir. D’autre part, GLT-1 est exprimé par les cellules microgliales (Nakajima, Yamamoto et al. 2008).
Rôle des transporteurs
Nous allons parler dans cette partie du rôle des transporteurs dans la capture du glutamate. Leur rôle dans le métabolisme cérébral sera évoqué dans la partie « Implications des transporteurs dans les interactions neurones-astrocytes ».
La recapture se fait par transport facilité secondaire. Un glutamate est transporté avec trois ions Na+et un ion H+ dans la cellule tandis qu’un ion K+ est transporté en sens inverse (Tzingounis and Wadiche 2007). Les transporteurs au glutamate permettent également le passage d’ions Cl- de façon non couplée dont le rôle reste inconnu. Le cycle de transport est lent (environ 70 ms) mais la liaison du glutamate est rapide (1-2 ms) ce qui lui procure un grand pouvoir tampon (Wadiche, Arriza et al. 1995) et donc une protection rapide contre la toxicité du glutamate. En effet, lorsqu’une seule vésicule synaptique de glutamate est exocytée, la synapse reçoit environ 4000 molécules de glutamate. Ces molécules rencontreraient alors dans la milliseconde qui suit, jusqu’à 10000 transporteurs au glutamate, beaucoup plus que le nombre de récepteurs AMPA qu’elles activeraient (environ 25) (Marcaggi and Attwell 2004). Grâce à leur pouvoir tampon, ces transporteurs permettent de limiter l’activation de récepteurs au glutamate et sont donc impliqués dans la transmission synaptique en permettant un raccourcissement de la durée des courants NMDA et AMPA (Tzingounis and Wadiche 2007). Ils évitent également la diffusion du glutamate hors de la synapse donc la stimulation des synapses voisines (Tsvetkov, Shin et al. 2004) et des récepteurs extrasynaptiques (Huang and Bergles 2004; Huang, Sinha et al. 2004; Volterra and Meldolesi 2005; Zheng, Scimemi et al. 2008). Leur inhibition peut induire, selon les synapses, une augmentation de la durée des PPSE et une diminution du seuil de déclenchement d’une activité épileptique (Barbour, Keller et al. 1994; Takahashi, Kovalchuk et al. 1995; Campbell and Hablitz 2004; Campbell and Hablitz 2008) de façon NMDA dépendante. Ils jouent également un rôle important dans la LTP (long term potentiation) (Katagiri, Tanaka et al. 2001) en atténuant l’activité des récepteurs NMDA. Les souris invalidées pour GLT-1 présentent un taux extracellulaire de glutamate augmenté, des crises d’épilepsie spontanées et une létalité progressive (Tanaka, Watase et al. 1997). Dans des préparations de synaptosomes de cortex de ces souris, la capacité de recapture du glutamate est diminuée de 95%. Les souris invalidées pour GLAST présentent une sensibilité excitotoxique accrue aux lésions cérébelleuses et une mauvaise coordination motrice (Watase, Hashimoto et al. 1998). Ces données montrent donc que ces transporteurs ont un rôle important dans la transmission synaptique et la plasticité.
Pour résumer, ces transporteurs maintiennent un taux extracellulaire de glutamate permettant une stimulation efficace mais non excitotoxique des neurones. C’est pourquoi la régulation de ces protéines est assurée par des mécanismes divers et complexes.
Régulation de la recapture
L’activité de transport du glutamate n’est pas constante. Elle est contrôlée par différents mécanismes de régulation agissant à de nombreux niveaux : de la synthèse des ARNm à la synthèse et l’adressage des protéines en passant par des mécanismes de modulation directe de l’activité (pour revue, Danbolt 2001). Ces régulations peuvent se faire à court terme comme les modifications post-traductionnelles et par des changements de localisation (Robinson 2002) ou à long terme comme les mécanismes transcriptionnels modulant l’expression des protéines (Figure 4). GLAST et GLT-1 ne sont ni régulés de la même façon ni par les mêmes composés. Par exemple, les glucocorticoïdes induisent l’expression de GLT-1 (Zschocke, Bayatti et al. 2005), tandis que le PACAP stimule l’expression de GLAST à des concentrations différentes de celles de GLT-1 (Figiel and Engele 2000).
La régulation de l’expression des transporteurs au glutamate est un exemple des interactions neurones-glie. En effet, les neurones produisent des facteurs diffusibles, comme le PACAP, qui augmentent l’expression de GLAST et surtout de GLT-1 (Gegelashvili, Danbolt et al. 1997; Swanson, Liu et al. 1997; Figiel and Engele 2000), tandis que les astrocytes induisent l’expression de EAAC1 par les neurones (Canolle, Masmejean et al. 2004).
L’expression de ces transporteurs est également régulée par l’activité neuronale, le degré d’innervation et par les neurotransmetteurs comme la dopamine (Nieoullon, Kerkerian et al. 1983; Kerkerian, Dusticier et al. 1987; Genoud, Quairiaux et al. 2006).
Le glutamate peut agir via les récepteurs ionotropiques et métabotropiques astrocytaires afin d’augmenter à long terme l’expression de GLAST et GLT-1 (Gegelashvili, Civenni et al. 1996; Thorlin, Roginski et al. 1998). Un surplus d’activation pouvant être excitotoxique l’activation de ces récepteurs va entrainer, à long terme, une augmentation de l’expression des transporteurs au glutamate qui pourront ainsi protéger les neurones. Cette relation est un autre exemple des interactions neurones-astrocytes. Le glutamate peut également agir indépendamment des récepteurs via l’influx sodique lié au fonctionnement des transporteurs, et ainsi permettre une redistribution de GLT-1 (Nakagawa, Otsubo et al. 2008).
D’autres facteurs peuvent réguler l’expression des transporteurs astrocytaires comme les facteurs de croissance EGF, TGF-α, PDGF et FGF2 (Zelenaia, Schlag et al. 2000) (Figiel, Maucher et al. 2003). Leur influence est variable selon les types de transporteurs, leur effet passerait par l’implication de voies signalisation impliquant certaines kinases. In vivo, l’expression de GLT-1 est augmentée par les antibiotiques du type β-lactames (Rothstein, Patel et al. 2005), le ligand des neuroimmunophilines (Ganel, Ho et al. 2006) ou encore les liposacharides (O’Shea, Lau et al. 2006). La cytokine TNF-α inhibe l’expression de GLT-1 via le facteur de transcription NKκB (Sitcheran, Gupta et al. 2005).
Les agents oxydo-réducteurs peuvent également réguler les transporteurs. Une oxydation des groupements thiols entraine une diminution de leur activité (Trotti, Danbolt et al. 1998), ce qui en fait des cibles importantes en cas de stress oxydatif.
De nombreuses protéines kinases peuvent agir sur les transporteurs par phosphorylation. Cette phosphorylation peut avoir pour conséquence : un effet direct rapide sur l’efficacité de transport (Gonzalez, Kazanietz et al. 2002; Robinson 2002) et/ou un changement de localisation à la membrane (Guillet, Velly et al. 2005). La stabilisation des transporteurs à la membrane a pour conséquence l’augmentation de la vitesse de transport (Gonzalez, Bannerman et al. 2003).
Une des voies importantes de régulation est la localisation subcellulaire des transporteurs. GLT-1 et GLAST sont situés à près de 80% au niveau de la membrane plasmique, EAAC1 est présent en proportion à 70% dans le cytosol (Danbolt 2001) (Sheldon, Gonzalez et al. 2006). Le recrutement ou l’internalisation des transporteurs peut être alors un bon moyen d’augmenter rapidement la recapture du glutamate. Comme pour la régulation de l’expression et de l’activité des transporteurs, les voies de signalisation impliquant des kinases/phosphatases (protéines kinases C et B, phosphoinositol-3-kinase, phospholipase C, kinases inductibles par le sérum et les glucocorticoïdes et de la calcineurine ; pour revue Beart and O’Shea 2007) sont impliquées dans ce phénomène de régulation de la localisation subcellulaire. Le rôle des différents acteurs dans ces mécanismes est très variable et dépend du type de transporteur. Par exemple, l’activation de la PKC diminue l’expression de GLT-1 à la membrane (Kalandadze, Wu et al. 2002) via l’internalisation et la dégradation par ubiquitination (Sheldon, Gonzalez et al. 2008) et a l’effet inverse sur EAAC1 (Davis, Straff et al. 1998; Guillet, Velly et al. 2005).
Cette régulation entre pool intracellulaire et pool membranaire se ferait grâce à des protéines qui feraient le lien entre les transporteurs et les protéines du cytosquelette (Zagami, O’Shea et al. 2005; O’Shea, Lau et al. 2006). Ces protéines sont des protéines de structure : Ajuba et GTRAP (glutamate transporter associated protein). GLT-1 interagit avec la protéine Ajuba (Marie, Billups et al. 2002). Les GTRAP auraient des liens avec le réseau d’actine associé à EAAC1 (Jackson, Song et al. 2001 ; pour revue Beart and O’Shea 2007). L’importance de l’interaction des transporteurs avec le cytosquelette est confirmée par le fait que des souris invalidées pour le gène de la GFAP présentent une baisse de 25% de la capacité de transport du glutamate dans le cortex et l’hippocampe (Hughes, Maguire et al. 2004). De plus, l’interaction de GFAP avec GLAST serait essentielle à son maintien à la membrane et à sa fonctionnalité (Sullivan, Lee et al. 2007). Les protéines du cytosquelette sont également importantes pour la formation de ‘clusters’ dynamiques de GLT-1 à la membrane des astrocytes en culture (Zhou and Sutherland 2004). L’activité des transporteurs est également influencée par leur position à la membrane. En effet, les transporteurs sont rassemblés dans des domaines spécifiques de la membrane : les rafts. GLT-1 et, dans une moindre mesure, GLAST sont enrichis dans les rafts in vitro et in vivo (Butchbach, Tian et al. 2004). Ces rafts forment des microdomaines membranaires enrichis en cholestérol et sphingolipides. Si l’intégrité des rafts est détruite par une déplétion en cholestérol, la recapture de glutamate est rapidement et drastiquement diminuée (Butchbach, Tian et al. 2004).
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Table des matières
I. Introduction générale
II. L’importance des astrocytes dans le système nerveux central
A. Organisation et morphologie
B. Les astrocytes et le glutamate
1. Le glutamate et l’excitotoxicité
2. Les transporteurs au glutamate
a. Structure et localisation
b. Rôle des transporteurs
c. Régulation de la recapture
C. Implication des transporteurs au glutamate dans les interactions neurones- astrocytes
1. Homéostasie du glutamate
2. Le couplage neurométabolique
3. Couplage neurovasculaire
D. Implication des astrocytes et des transporteurs au glutamate dans les maladies neurodégénérati
1. La sclérose latérale amyotrophique (SLA)
2. La maladie de Huntington
3. Les transporteurs au glutamate comme cibles thérapeutiques
III. Utilisation du transfert de gène dans l’étude des astrocytes
A. Le transfert de gène
1. Principe du transfert de gène
2. Les outils de transfert de gènes dans le système nerveux central
a. Les vecteurs non viraux
b. Les vecteurs viraux
– Les vecteurs dérivés de l’Herpès virus
– Les vecteurs dérivés des adénovirus
– Les vecteurs dérivés des virus adéno-associés
– Les vecteurs dérivés des lentivirus
B. Les vecteurs lentiviraux
1. Les séquences nécessaires à l’obtention d’un vecteur lentiviral
2. La production virale
3. Transduction de la cellule cible par le vecteur lentiviral
C. L’étude des astrocytes in vivo grâce aux vecteurs lentiviraux
1. Pseudotypage
2. Changement de promoteur
3. Régulation post-transcriptionnelle : Les microARN (miR)
a. Découverte et importance des microARN
b. Synthèse des microARN et mode d’action
c. Mécanisme de dégradation de l’ARNm
d. Mécanismes d’inhibition de la traduction
e. Expression des miR dans le système nerveux central
f. Utilisation des miR pour le ciblage cellulaire
4. Utilisation des petits ARN interférents
IV. Matériels et méthodes
1. Clonage des promoteurs
2. Clonage des plasmides contenant la cible du miR124
3. Clonage des plasmides GLAST et GLT-1
4. Clonage des siGLAST et siGLT-1
B. Production des lentivirus
C. Injections stéréotaxiques
1. Comparaison de l’infection des enveloppes VSV, Mokola et Rabbies
2. Choix de la dose de Mokola
3. Comparaison des promoteurs
4. Efficacité de la cible du miR124 in vivo
5. Ciblage astrocytaire dans le striatum
6. Ciblage astrocytaire dans le cervelet et l’hippocampe
7. Effet de la surexpression des transporteurs GLAST et GLT-1
8. Effet de l’inhibition des transporteurs GLAST et GLT-1
D. Quantification des ARN par RT- PCR en temps réel
1. Extraction des ARNm
2. Reverse transcription
3. PCR en temps réel
4. Quantification du miR124
E. Transfection transitoire au chlorure de calcium des cellules 293T
F. Mesure de l’uptake d’aspartate tritié
G. Immunoblots
1. Préparation des homogénats de cerveaux
2. Electrophorèse, transfert et immunoblot
H. Cultures primaires
1. Cocultures primaires de striatum
2. Cultures de neurones purs
3. Cultures d’astrocytes purs
I. Analyse en cytométrie de flux
J. Immunohistologie
1. Obtention des coupes
2. Protocole d’immunohistochimie
3. Protocole d’immunofluorescence
4. Immunofluorescence sur cultures
K. Analyse des immunomarquages
L. Mesure autoradiographique de la consommation cérébrale de 2-deoxy-D-[14C]glucose (2DG)
M. Analyses statistiques
Résultats et discussion
V. Développement d’un vecteur lentiviral ciblant les astrocytes in vivo
A. Changement de pseudotype : VSV, Rabies et Mokola
1. Résultats du pseudotypage
a. Effet du pseudotypage in vitro
b. Effet du pseudotypage in vivo
– Effet du pseudotypage sur l’efficacité d’infection
– Effet du pseudotypage sur le tropisme
Tropisme in vivo chez le rat
Tropisme in vivo chez la souris
Amélioration de l’efficacité d’infection des vecteurs pseudotypés avec Mokola
2. Discussion sur le pseudotypage
a. L’efficacité de transduction reflète la capacité d’entrée dans la cellule cible
b. Les facteurs influençant l’efficacité de transduction et le tropisme
– Avant toute comparaison
– La production virale influence la transduction
– Les récepteurs spécifiques aux glycoprotéines virales influencent le tropisme et la capacité de transduction d’un vecteur
– Les facteurs de restriction cellulaires influencent le tropisme des vecteurs
B. Association avec différents promoteurs : PGK, CMV et EAAT1
1. Résultats : Changement de promoteur
a. Influence du promoteur in vitro
b. Influence du promoteur in vivo
-Effet du promoteur sur l’expression du transgène
-Effet du promoteur sur le tropisme
Tropisme in vivo chez le rat
Tropisme in vivo chez la souris
2. Discussion sur les promoteurs
C. Incorporation d’une cible du miR124 pour restreindre l’expression du transgène dans les neurones
1. Résultats concernant l’insertion de la cible du miR124
a. Efficacité in vitro des différentes constructions
– Influence du nombre de copies et d’une adénosine dans l’efficacité de régulation du miR124T
-Spécificité de régulation du miR124T
b. Caractérisation du mécanisme d’action
c. Efficacité du miR124T in vivo
2. Discussion sur le ciblage astrocytaire grâce au microARN
a. Efficacité de répression et mécanismes de régulation
b. Les conséquences de l’insertion des cibles du miR124 dans la cellule…
D. Nouvel outil de ciblage astrocytaire : combinaison Mokola et microARN
1. Résultats concernant la combinaison Mokola et miR124T
a. Ciblage des astrocytes chez le rat
b. Ciblage des astrocytes chez la souris
c. Absence de toxicité de notre vecteur
d. Ciblage astrocytaire dans l’hippocampe et le cervelet
2. Discussion sur ce nouvel outil de ciblage astrocytaire in vivo
a. Un outil particulièrement flexible et efficace
b. Un outil à améliorer
VI. Applications du vecteur à l’étude des astrocytes
A. Visualisation de la morphologie des astrocytes in vivo
B. Surexpression des transporteurs GLAST et GLT-1 et effets en condition excitotoxique
1. Mise au point de vecteurs exprimant les transporteurs GLAST et GLT-1
2. Surexpression des transporteurs GLAST et GLT-1 in vivo et effets en condition excitotoxique
C. Inhibition de l’expression des transporteurs GLAST et GLT-1 in vivo par ARN interférence
1. Validation de la fonctionnalité des siARN
2. Inhibition de l’expression des transporteurs in vivo
3. Effet sur la consommation de glucose
D. Discussion
1. Morphologie des astrocytes
2. Conséquences d’une inhibition des transporteurs au glutamate
3. Une surexpression des transporteurs modérée pour un effet neuroprotecteur important
4. La surexpression des transporteurs dans les maladies neurodégénératives
5. Perspectives d’études
VII. Conclusion
Références bibliographiques
Annexes
Article
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