IBTSS-05-OMM
SCREENING TOXICOLOGIQUE
INTRODUCTION
Depuis de nombreuses années, la compréhension de l’être humain a préoccupé les plus grands esprits. Différentes études ont été menées afin de mettre le doigt sur des questions existentielles sur l’homme et ce qui le compose. Ces études ont pu être réalisées grâce à la création et l’utilisation de technologies récentes qui ont pu affirmer certaines observations.
En 1590, Hans et Zacharias Hansen inventèrent le premier instrument donnant accès à l’infiniment petit, le microscope [1]. Suite à cette découverte, la nécessité d’observer des éléments de plus en plus petits a conduit à pousser toujours plus loin les limites de l’observation et inventer de nouveaux appareillages toujours plus performants [2]. L’introduction de l’imagerie a permis d’évoluer dans le domaine de la biologie et de la médecine en passant d’une étude globale à une analyse moléculaire permettant d’observer des substances telles que des protéines, des peptides ou des métabolites. La recherche s’est orientée ainsi progressivement vers des investigations dites « omiques » telles que la génomique, la protéomique et plus récemment la métabolomique.
Parallèlement, les progrès et les innovations dans la spectrométrie de masse (MS), en termes de sensibilité et de sélectivité, ont également entraîné le développement de ces nouvelles études [3]. La MS est ainsi devenue le constituant essentiel de la plate-forme analytique. Dans ce contexte, de nombreuses stratégies MS ont été élaborées pour mettre en évidence ou surveiller des molécules d’intérêt dans des biomatrices [4]. Parmi elles, l’une des approches les plus innovantes et stimulantes a été le développement de technologies d’imagerie.
Ainsi, un nouvel outil puissant a fait son apparition dans le secteur du diagnostic par MS, l’imagerie par spectrométrie de masse (IMS). L’IMS est une technique analytique qui permet de cartographier la distribution de divers analytes dans des sections tissulaires, allant des protéines vers des molécules plus petites telles que les lipides, les drogues ou les médicaments. L’instrument enregistre les spectres de masse pour chacun des points disposés de manière régulière sur l’ensemble du tissu. Ces deux informations importantes (spectre et coordonnée) permettent de reconstruire des images ioniques au moyen d’outils informatiques. A partir d’une seule acquisition, il est alors possible d’observer autant d’images qu’il y a de molécules associées et voir leur localisation sur le tissu (figure A) [5]. Cette technique offre une grande sélectivité car la distinction entre les composés et les métabolites se fait facilement grâce à la spectrométrie de masse. Il est ainsi possible également de localiser la distribution d’un médicament parallèlement à un marqueur d’une maladie en progression comme le cancer [https://www.chatpfe.com/].
Dans la dernière décennie, de nombreux efforts ont été entrepris pour développer des méthodologies et des instruments pour l’IMS [7,8]. Ces efforts ont conduit à sa reconnaissance dans le monde entier en raison de son potentiel clinique pour le diagnostic et le pronostic. Cependant, l’IMS est encore un nouvel outil qui est actuellement en cours de développement pour pousser la technologie vers l’avant et la rendre plus régulièrement accessible aux utilisateurs. Dans ce contexte, l’amélioration de la vitesse d’imagerie, la résolution spatiale et la sensibilité sont des questions et des défis techniques particulièrement importants dans le domaine de l’IMS [9].
MATERIEL
Echantillons
L’échantillon de foie de rat utilisé pour la première partie du projet provient du laboratoire de toxicologie et chimie forensique de Genève. Les échantillons humains de foie et cortex cérébrale contaminés à la MDMA, à la quétiapine, à la trazodone, au midazolam et le cerveau dopé à la cocaïne employés pour l’imagerie et le screening toxicologique sont issus d’autopsies réalisées au coeur du centre universitaire romand de médecine légale (CURML) sous les n° d’autopsies 288/15, 160133-M, 160178-M et 308/15.
Appareillages
Les différents appareils employés tout au long de ce travail se trouvent dans le laboratoire de toxicologie et chimie forensique (UTCF) du centre universitaire romand de médecine légale de Lausanne et sont décrits ci-dessous.
Lames de microscope ThermoFisher Scientific SuperfrostTM Plus 75 x 25 x 1mm
Microcentrifugeuse (Techne Cambridge force 16, witec Ag)
Cryostat (Leica CM1860 UV)
Sprayer MALDI spotter Suncollect (SunChrom)
Spectromètre de masse MALDI LTQ XL (Thermo Scientific)
Logiciels: Thermo Tune Plus, ImageQuest, Xcalibur data system, MsiReader
Conditions de base
Les conditions de base regroupent les conditions nécessaires à la détection des quatorze drogues étudiées sans optimisation. Les conditions exigées sont une déposition homogène de la solution de drogues pour obtenir une détection dans l’entier du tissu analysé et avoir ainsi un modèle expérimental. Une application homogène de la matrice est aussi nécessaire afin d’optimiser la limite de détection et la qualité des images ioniques obtenues. Afin de répondre à ces exigences, plusieurs expériences ont été réalisées en variant différents paramètres dans le but d’obtenir les conditions requises.
Imagerie de cas réels
En utilisant les paramètres optimaux, il a été possible d’acquérir des images entières tissulaires pour quatre cas réels L’acquisition d’une image entière de tissu s’effectue de la même manière que pour l’acquisition de 100 pixels lors de l’optimisation des facteurs de préparation (voir point 3.2). Les paramètres d’analyses ne changent pas (mode positif avec une résolution de 60’000, en full scan, avec une gamme de masse allant de 100 à 500 m/z, une énergie de laser de 5.0μJ et avec 4 coups de laser pour chaque point analysé en raster avec une résolution de 100m). Les conditions testées pour le recouvrement du tissu sont la matrice DHB 30mg/ml à 50%MeOH / 50% H2O/ 0.1% TFA sans et avec lavage tampon, 60% MeOH / 40% H2O / 0.1% TFA sans lavage et 70% MeOH / 30% H2O / 0.1% TFA sans lavage.
CONCLUSION
L’imagerie par spectrométrie de masse MALDI est une méthode de choix pour la détection simultanée de plusieurs molécules dans diverses sections tissulaires offrant ainsi une grande spécificité. Elle permet la détection des grandes molécules telles que les protéines ainsi que récemment de plus petites substances comme les drogues et médicaments grâce à la haute résolution. Contrairement à d’autres méthodes d’imagerie existantes, elle est dotée d’une préparation simple et efficace. En effet, la préparation de l’échantillon est le point clef en imagerie MALDI, elle est constituée de trois étapes (1. Manipulation de l’échantillon (approvisionnement, congélation et découpe de section) 2. Traitement du tissu (lavage) et 3. Application de la matrice) et va jouer un rôle important dans la détection en influençant la sensibilité et la résolution spatiale de l’analyse. Pour optimiser la détection de petites molécules, on peut donc jouer sur différents paramètres tels que le choix de la matrice, le pourcentage de solvant de dilution, le pourcentage de TFA ainsi que sur les lavages d’extraction acido-basique avec un tampon d’acétate d’ammonium.
Cependant, pour optimiser dans le but de visualiser la distribution de molécules sur un tissu, il est important si possible de travailler directement sur des cas réels et d’acquérir des images entières de sections tissulaires car elles montrent directement une possible délocalisation des analytes. Les paramètres de préparation varient en fonction des drogues et des tissus. Les propriétés physico-chimiques de la molécule, la variété des tissus, leur composition cellulaire et leurs histologies sont des facteurs qui vont jouer sur l’absorption des analytes et changer ainsi le protocole de préparation.
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Table des matières
1. INTRODUCTION
2. MATERIEL
2.1 ECHANTILLONS
2.2 APPAREILLAGES
2.3 PRODUITS
3. METHODES
3.1 CONDITIONS DE BASE
3.2 OPTIMISATION DE LA DETECTION
3.3 IMAGERIE DE CAS REELS
3.4 SCREENING TOXICOLOGIQUE
4. RESULTATS ET DISCUSSION
4.1 CONDITIONS DE BASE
4.2 OPTIMISATION DE LA DETECTION
4.3 IMAGERIE DE CAS REELS
4.4 SCREENING TOXICOLOGIQUE
5. CONCLUSION
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