Ligands d’ADN quadruplexe. Méthodes biophysiques d’étude

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Les méthodes covalentes de marquage d’ADN.

Les techniques de marquage non covalentes ont la caractéristique intrinsèque de ne pas assurer que l’ADN et la sonde restent liés. Le marquage covalent assure au contraire un lien stable entre l’ADN et la sonde. Celle-ci peut alors être choisie uniquement pour ses propriétés de fluorescence, sans se préoccuper de son affinité pour l’ADN. Si les techniques de synthèse sur support solide permettent relativement facilement de greffer un fluorophore sur un oligonucléotide, le marquage d’acides nucléiques de longue taille pose plus de difficultés. Plusieurs méthodes existent, toutes ont des avantages et des inconvénients. Nous présentons ici les plus courantes, sans constituer une liste exhaustive.

Les méthodes non sélectives.

Les agents alkylants.

Plusieurs agents alkylants ont été utilisés pour attacher de façon covalente divers composés à l’ADN. D’une manière générale, il s’agit de dérivés de composés très réactifs ou générant des espèces réactives et déjà connus pour leur capacité à établir des liaisons avec les acides nucléiques. Le développement de composés alkylant un seul brin de l’ADN permet de marquer des plasmides en limitant l’altération de leur structure et de leurs fonctions. La figure 6 donne un exemple d’un composé de ce type.

les sels de platine

La capacité des sels de platine à se fixer au niveau de la position N-7 des guanines a été largement étudiée. Cette propriété a été utilisée pour le marquage fluorescent des acides nucléiques.13 L’approche repose sur l’utilisation de complexes monofonctionnels de Pt(II) dérivatisés par des fluorophores. Les composés ainsi obtenus (figure 7), contrairement aux dérivés bifonctionnels du platine (par exemple le cis-platine), ne forment plus qu’une seule liaison avec l’ADN évitant ainsi la création de ponts entre chaînes, ce qui doit minimiser les perturbations de l’activité du plasmide.

les p-azoture d’aryles

Les dérivés para-azotures d’aryles sont activés par irradiation autour de 350 nm pour conduire à des espèces intermédiaires qui réagissent de préférences avec des nucléophiles (résidu actif ou solvant), selon le schéma présenté figure 8. Les dérivés perfluorés des azotures d’aryles sont plus réactifs que leurs homologues non fluorés. Cette technique a été utilisée pour lier de manière covalente des fluorophores aux plasmides.14

L’incorporation de dérivés fluorescents de nucléotides.

En parallèle des méthodes chimiques présentées ci-dessus, différentes méthodes enzymatiques assurant la réplication ou l’amplification d’une molécule d’ADN, comme par exemple la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction) permettent l’incorporation de nucléotides fluorescents, ou de nucléotides modifiés (souvent par une fonction aminoallyl) pouvant ensuite être marqués par un fluorophore. Cette technique est toutefois assez dépendante de la séquence à répliquer.

Les approches sélectives pour le marquage d’ADN natif.

Les méthodes précédentes, si elles sont relativement simples à mettre en œuvre, ne permettent pas de contrôler les positions de marquage et n’offrent qu’un contrôle limité du nombre de fluorophores introduits sur l’ADN, via la stœchiométrie de la réaction de marquage. Des systèmes de marquage plus sélectifs ont donc été développés.

La stratégie triplexe.

Le couplage de fluorophores à un TFO, présentée précédemment, peut être adapté pour obtenir un marquage, qui bien que non covalent au sens strict du terme s’avère extrêmement robuste. Dans ce cas, l’oligonucléotide utilisé pour le marquage comporte une séquence formant un triplexe et des extrémités susceptibles d’être refermées par catalyse enzymatique après formation du triplexe (figure 9). Il se forme ainsi un « cadenas » par caténation de l’oligonucléotide autour de sa cible, ce qui assure une fixation très robuste. Un nombre variable de fluorophores peut-être greffé sur la « tige » reliant le cadenas au triplexe, par l’une ou l’autre des méthodes non spécifiques décrites plus haut.16,17

Synthèse sur les extrémités.

La synthèse sur les extrémités (3’ ou 5’) des acides nucléiques est envisageable dans le cas particulier des plasmides linéaires. Les méthodes de synthèse classiques des oligonucléotides peuvent a priori être envisagées ou bien celles employant des enzymes de ligation pour insérer des oligonucléotides fonctionnalisés. Ces méthodes ne permettent que d’introduire un nombre limité de signaux de manière très localisée.

La méthode de Smiling DNA

Le Smiling DNA (pour Sequence-specific Methyltransferase Induced Labeling of DNA) est une méthode enzymatique qui permet de coupler un cofacteur synthétiquement modifié au niveau de la séquence de reconnaissance d’une méthyltransférase (figure 10).18,19 La méthode repose sur l’utilisation de méthyltransférases et d’un cofacteur synthétique comportant un fluorophore et une fonction aziridine qui permet l’alkylation, suivant l’enzyme utilisée, de la position N-6 de l’adénosine ou la position N-4 ou C-5 de la cytosine suivant la séquence de reconnaissance. Le nombre de fluorophores greffés sur un plasmide est donc déterminé par le nombre de séquences de reconnaissance présentes sur ce plasmide, qui varie avec la méthyltranférase utilisée. Cette méthode présente l’avantage d’associer l’efficacité d’une catalyse enzymatique à un contrôle précis du nombre et de la position des sites de marquage.

Diversité structurale due à la séquence.

L’arrangement des boucles connectant les tétrades du quadruplexe varie suivant l’oligonucléotide. Ces boucles peuvent ainsi être latérales (figure I-1-4A), diagonales (figure I-1-4B) ou externes (figure I-1-4C). Ceci peut être illustré par trois études RMN. L’une a été menée sur l’oligonucléotide de séquence d(G2T2G2TGTG2T2G2), aptamère de la thrombine, qui adopte en présence d’ions potassium une forme « chaise » antiparallèle avec uniquement des boucles latérales (figure I-1-4A).24 De même, l’oligonucléotide mimant les répétitions de la séquence télomérique de Oxytricha (d(GGGG(TTTTGGGG)3)) adopte une forme « panier » antiparallèle (figure I-1-4B).25 Enfin, un oligonucléotide mimant les répétitions de la séquence télomérique de Tetrahymena (d(TTGGGG)4) adopte une structure antiparallèle dite « double loop hybrid » (figure I-1- 4C).26

Polymorphisme d’une même séquence.

La nature du cation joue un rôle fondamental dans la structuration de l’ADN quadruplexe. Ainsi, pour l’oligonucléotide mimant les répétitions de la séquence télomérique humaine (TTAGGG), la structure déterminée par RMN en présence d’ions sodium sur le 22-mer Tel22 (d(AGGG(TTAGGG)3)) par Patel et al. est une forme « panier » antiparallèle (figure I-1-5A).29 En revanche, en présence d’ions potassium, une forme parallèle de type « hélice » (« propeller » en anglais, figure I-1-5B) a été déterminée par cristallographie par Neidle et al..30 De nombreuses études, parfois contradictoires, employant des techniques biophysiques et biochimiques variées,5,31-35 sur ce 22-mer ou sur le 21-mer correspondant (d(GGG(TTAGGG)3)) ont ensuite montré qu’en solution cette structure était beaucoup plus polymorphique et qu’il existait probablement un équilibre entre plusieurs formes. Très récemment, une étude par dichroïsme circulaire sur des oligonucléotides modifiés (des 22- mers où certaines guanines sont remplacées par des 8-bromoguanines)36 et deux études RMN, l’une sur le 24-mer Tel24 de séquence d(TTGGG(TTAGGGG)3A),28 l’autre sur le 26-mer Tel26 de séquence d(AAAGGG(TTAGGGG)3AA),37 ont mis en évidence une forme « hybride » mixte parallèle / antiparallèle (figure I-1-5C) prédominante en présence d’ions K+, qu’il y ait ou non des ions Na+ dans la solution.
Il faut noter l’importance des extrémités (bases non appariées) des oligonucléotides sur la structure quadruplexe adoptée : ainsi, Yang et al. mettent en évidence une forme hybride en présence d’ions K+ pour l’oligonucléotide Tel26 mais observent, par RMN et par CD, un mélange de deux formes bien distinctes (probablement de la forme hybride et de la forme « panier » antiparallèle) pour Tel22 en présence d’ions K+. Or, en milieu cellulaire il faut s’attendre à des structures plus complexes dues à l’empilement de plusieurs quadruplexes. La stabilité d’un tel empilement influence l’équilibre entre les différentes conformations possibles pour un quadruplexe. La forme « panier » antiparallèle serait ainsi défavorisée stériquement puisque les extrémités 5’ et 3’ et la boucle diagonale se trouvent du même côté du quadruplexe. Ceci est cohérent avec le fait que Yang et al. n’observent pas une forme bien définie pour l’oligonucléotide Tel26 en présence de Na+ alors que l’oligonucléotide sans bases non appariées en 3’ adopte une forme « panier » stable.37
Par ailleurs, Vorlickova et al. ont étudié différents oligonucléotides contenant un nombre variable de répétitions télomériques humaines (d(G3(TTAG3)n n=1-16) et ont montré que le quadruplexe le plus stable et donc celui le plus susceptible de se former in vivo était celui constitué de trois tétrades.38
Enfin, plusieurs études ont montré qu’un ligand d’ADN quadruplexe était susceptible d’induire une conformation préférentielle. Ainsi, Hurley et al. ont montré par dichroïsme circulaire que l’ajout de télomestatine (figure I-1-6) à une solution d’oligonucléotide mimant la séquence télomérique humaine en présence de potassium induisait préférentiellement une forme quadruplexe « panier » alors que l’ajout de la porphyrine modifiée Se2SAP induisait la forme mixte hybride.31

Ligands d’ADN quadruplexe. Méthodes biophysiques d’étude.

Principaux ligands d’ADN quadruplexe.

Différentes familles de composés ont été testées pour leurs propriétés d’interactions spécifiques avec les quadruplexes de guanine. Parmi ces composés, on peut tout d’abord citer plusieurs macrocycles (figure I-1-8) tel que la télomestatine,55,66 produit naturel isolé chez Streptomyces anulatus, mais aussi les porphyrines cationiques TmPyP467 et Se2SAP,27 et le macrocycle BOQ1 développé au laboratoire.68

On peut ensuite citer plusieurs ligands possédant une large surface aromatique plane (figure I-1-9), tels que l’anthraquinone BSU1051,45 les acridines di- ou tri-substituées (tel que le BRACO19),69 le perylene diimide ou PIPER,70 les dibenzophénanthrolines ou quinacridines (par exemple MMQ3 représenté ici),52 les dérivés d’éthidium (tel que 1),71 les triazines (telle que la 111405)56 et les pyridodicarboxamides (360A).53,72 Récemment, Neidle et al. ont montré que le complexe de nickel 2 stabilisait fortement la structure quadruplexe.73

Tous ces composés possèdent une large surface aromatique plane, qui peut interagir par interaction de π-stacking avec les tétrades de guanine terminales et par interactions non covalentes (π-stacking ou électrostatiques suivant les ligands) avec les boucles. Ce mode de fixation par stacking sur les tétrades externes semble le plus probable étant donnée le coût en énergie de l’intercalation entre deux tétrades de guanine.

Une étude cristallographique sur un quadruplexe bimoléculaire formé par deux brins de la séquence télomérique d’Oxytricha (d(T4G4T4)) cocristallisé avec une acridine disubstituée (figure I-1-10A)74 ainsi que plusieurs études RMN, avec le PIPER,70 la quinacridine MMQ1,75 l’acridine RHPS4 (figure I-1-10B),76 la distamycine, qui forme un complexe où deux molécules se fixent sur chacune des deux tétrades externes,77 la quinobenzoxazine QQ58,78 et la porphyrine TMPyP4,79 viennent confirmer ce mode de liaison. Le polymorphisme des quadruplexes et l’interconversion possible entre différentes formes compliquent l’analyse RMN des complexes quadruplexes / ligands, ce qui peut expliquer qu’assez peu de données structurales sont disponibles sur ces complexes.

Dans le cas du ligand organométallique 2, outre les interactions de π-stacking avec les tétrades et les interactions électrostatiques avec les boucles ou les sillons, il est supposé que le cation métallique stabilise la structure quadruplexe en se substituant à un des cations métalliques normalement présent dans la structure. De la même façon, il a été proposé que dans le cas des acridines une protonation in situ de l’azote intracyclique, qui joue alors le rôle de pseudo-cation, participe à la stabilisation du quadruplexe par le ligand.

La stœchiométrie du complexe ligand / quadruplexe varie suivant le ligand et le quadruplexe. Les deux tétrades externes constituent deux sites potentiels, mais l’interaction spécifique d’un ligand avec une boucle peut conduire à l’existence d’un site d’interaction préférentiel. C’est le cas par exemple pour certaines acridines di- ou tri-substituées,80 ou pour la Se2SAP.31 D’autres ligands, au contraire, (par exemple le BOQ168) possèdent deux sites d’interaction équivalents. Un complexe 3 / 1 entre la daunomycine et un quadruplexe parallèle a même été caractérisé à l’état solide.81

Les études menées jusqu’à présent sur la reconnaissance de l’ADN quadruplexe par des petites molécules tendent ainsi à montrer que pour cibler spécifiquement l’ADN quadruplexe, un ligand doit posséder une large surface aromatique plane, permettant le stacking sur les tétrades externes. Des interactions entre le ligand et les sillons ou les boucles du quadruplexe viennent améliorer cette reconnaissance, ou peuvent éventuellement permettre de cibler une structure quadruplexe particulière.

Comment évaluer l’affinité d’un ligand pour l’ADN quadruplexe ?

L’objectif de ce paragraphe et du suivant est d’exposer succinctement le principe, les avantages et les limitations éventuelles des méthodes biophysiques les plus communément utilisées jusqu’à présent pour l’étude des ligands d’ADN quadruplexe.

La mesure de dénaturation thermique par FRET.

Le chauffage d’une solution d’ADN structuré (en double hélice, triplexe, quadruplexe…) entraîne la perte de la structure secondaire par rupture des liaisons hydrogène (dénaturation). On définit la température de fusion (Tm) comme étant la température de demi-dissociation de l’ADN. L’ajoute à la solution d’un composé se fixant préférentiellement sur la structure d’ADN étudiée retarde la fusion : l’interaction entre l’ADN et le composé déplace l’équilibre ADN structuré / ADN dénaturé. Ainsi, plus l’affinité du composé est importante, plus l’effet stabilisant (∆Tm, différence entre les températures de fusion de l’ADN en présence du composé et de l’ADN seul), est grand. On peut donc mesurer par cette méthode l’affinité d’un composé pour une structure d’ADN donnée.

Dans le cas d’un ADN en double hélice, l’empilement des bases a pour conséquence une forte diminution de leur absorption UV (hypochromisme) : la dénaturation se traduit par une augmentation de la densité optique à λ=260 nm. Le suivi des variations de la densité optique à 260nm constitue ainsi une méthode standard pour mesurer la température de fusion d’un duplexe. Dans le cas d’un G-quadruplexe, la mesure de la température de fusion par UV (à 295 nm) est possible mais moins précise, les courbes présentant des profils élargis difficilement exploitables, surtout en présence de ligands. Cette difficulté a conduit au développement par Mergny et al.52 d’une méthode de dénaturation thermique suivie par FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer ou Transfert d’énergie de fluorescence par résonance).

Cette méthode utilise l’oligonucléotide F21T, un 21-mer contenant 3 répétitions de la séquence télomérique humaine, de séquence d((GGGTTA)3GGG), susceptible de se structurer en G-quadruplexe et portant deux fluorophores : la fluorescéine (donneur) en 5’ et la tétraméthylrhodamine (accepteur) en 3’ (figure I-1-11). Lorsque l’oligonucléotide est sous forme simple brin, les deux fluorophores sont trop éloignés l’un de l’autre pour que le FRET ait lieu. Lorsque l’oligonucléotide est structuré en G-quadruplexe, la distance entre les deux fluorophores est suffisamment faible et il y a transfert d’énergie : l’excitation de la fluorescéine entraîne la fluorescence de la tétraméthylrhodamine. La mesure est effectuée en excitant le système à 470 nm et en suivant la restauration de la fluorescence de la fluorescéine (515 nm) avec l’augmentation de la température. La température de fusion (T1/2) est définie comme la température où l’intensité relative de fluorescence est de 0,5. La mesure peut aussi être effectuée en utilisant une paire fluorophore / inhibiteur (« quencher » en anglais), ici la paire fluorescéine / dabcyl. Par ailleurs, la méthode de mesure de ∆T1/2 par FRET a été récemment adaptée pour une mesure simultanée de 96 échantillons.82

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Table des matières

Introduction générale
Partie I. Marquage non covalent par reconnaissance structurale. Exemple de l’ADN quadruplexe
Chapitre 1 : l’ADN quadruplexe. Eléments bibliographiques
I. L’ADN quadruplexe – structure
A. Tétrades de guanines et ADN quadruplexe
B. Une grande diversité structurale
II. Rôles biologiques
A. Existence in vivo
B. Implications dans la structure des télomères
C. Autres rôles biologiques supposés
III. Ligands d’ADN quadruplexe. Méthodes biophysiques d’étude
A. Principaux ligands d’ADN quadruplexe
B. Comment évaluer l’affinité d’un ligand pour l’ADN quadruplexe ?
C. Comment évaluer la sélectivité d’un ligand pour l’ADN quadruplexe ?
IV. Marquage d’ADN quadruplexe par des fluorophores. Etat de l’art
V. Objectifs
Chapitre 2 : Conception de ligands fluorescents d’ADN quadruplexe
I. Conception structurale
II. Synthèse
A. Synthèse du noyau quinacridine
B. Synthèse de la partie fluorescente – cas du Bodipy
C. Synthèse des conjugués
III. Propriétés de fluorescence et d’interaction avec l’ADN
A. Conjugués quinacridine-dansyle 1 et quinacridine-MANT 22
B. Conjugués quinacridines-Bodipy 23, 24, 25
IV. Conclusions et perspectives
Chapitre 3 : Mise au point d’un test FID (Fluorescent Intercalator Displacement) pour l’ADN quadruplexe
I. Interaction Thiazole Orange / ADN quadruplexe
A. Le Thiazole Orange : propriétés de fluorescence, interaction avec l’ADN
B. Thiazole Orange et ADN quadruplexe
II. Principe du FID. Eléments bibliographiques
III. Le test G4-FID.
Evaluation de l’affinité de ligands potentiels d’ADN quadruplexe
A. Conception du test
B. Résultats obtenus
– 3 -IV. « FID Comparatif ». Evaluation de la sélectivité quadruplexe Vs duplexe
A. Conception du test
B. Validation par des ligands connus
V. Conclusions et perspectives
A. Avantages et limites du test
B. Perspectives
Chapitre 4 : Un système FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfert) spécifique de l’ADN quadruplexe
I. Le phénomène de FRET
A. Principe du FRET
B. FRET et ADN. Eléments bibliographiques
II. Une paire FRET sélective de l’ADN quadruplexe
A. Choix du système de chromophores
B. Phénomène de FRET résultant du complexe ternaire BOQ1/TO/22AG
C. Vers une signature de l’ADN quadruplexe ?
III. Conclusions et perspectives
Partie II. Synthèse et étude de fluorophores à deux photons pour le marquage covalent d’ADNs natifs
Chapitre 1 : La fluorescence excitée à deux photons
I. Principe de la fluorescence sous excitation biphotonique
A. Principe de l’absorption biphotonique
B. Section efficace d’absorption à deux photons
C. Fluorescence excitée à deux photons
II. La microscopie de fluorescence à deux photons
A. La microscopie de fluorescence : bref rappel
B. Le microscope de fluorescence à deux photons
III. Fluorophores optimisés pour l’absorption à deux photons.
Relations structure / propriétés
A. Structures quadrupolaires
B. Structures octupolaires
C. Systèmes divers
D. Applications à la biologie
IV. Objectifs
Chapitre 2 : Synthèse de fluorophores dérivatisables optimisés pour la fluorescence à deux photons
I. Stratégies de synthèse envisagées
II. Synthèse des triphénylamines de type 46, 47
A. Réactions d’amination arylique
B. Réactions d’halogénation
C. Obtention des intermédiaires aldéhydes
III. Fonctionnalisation par des groupes électroattracteurs.
A. A partir des intermédiaires halogénés
B. A partir des intermédiaires aldéhydes
C. Groupements électroattracteurs chargés
IV. Obtention d’un linker fonctionnel pour le couplage à des biomolécules
A. Réaction de couplage peptidique
B. A partir de l’intermédiaire méthoxy
V. Conclusions et perspectives
Chapitre 3 : Propriétés des composés obtenus
I. Stabilité et solubilité en milieu aqueux
A. Stabilité
B. Solubilité
II. Propriétés optiques linéaires
A. Dérivés neutres
B. Dérivés cationiques
III. Absorption à deux photons des composés obtenus
A. Mesure de fluorescence excitée à deux photons : montage expérimental
B. Résultats obtenus
IV. Marquage d’ADN par les dérivés vinylpyridinium
A. Etudes in vitro
B. Etudes en microscopie
V. Conclusions et perspectives
Conclusions et perspectives
Références bibliographiques.