L’hyperméthylation du promoteur du gène RASSF1, un biomarqueur des cancers à différents égards 

La perte d’expression de RASSF1A : intérêts et place en clinique

Les mécanismes moléculaires de l’inactivation de RASSF1A 

La perte d’expression de RASSF1A par les cellules cancéreuses est un évènement précoce et fréquent dans de nombreux cancers (1). Elle est due à la délétion du bras court du chromosome 3 (comprenant le locus du gène RASSF1 (3p21.3) (2)) et à la méthylation de novo des îlots CpG de la région du premier promoteur de RASSF1 de l’allèle restante (2). Dans la pathogénie du cancer du poumon, la délétion du bras court du chromosome 3, est également un événement de survenue précoce, puisqu’elle est retrouvée à la fois dans les lésions prénéoplasiques et néoplasiques infiltrantes, avec des fréquences de 78% et 96% respectivement (3).
Les mutations inactivatrices du gène RASSF1A sont quant à elles rares (4). En revanche, certains microARNs, tels les miR-602, miR-181a/b et miR-214-3p, peuvent également inhiber l’expression de RASSF1A dans différents cancers (5–7).

L’hyperméthylation du promoteur du gène RASSF1, un biomarqueur des cancers à différents égards 

Si la méthylation de novo des îlots CpG de la région du premier promoteur du gène RASSF1 est fréquemment retrouvée dans de nombreux cancers, elle l’est rarement dans les tissus normaux ; elle constitue de fait, un biomarqueur diagnostique des cancers (1,8).
Dans certains cancers, tel le cancer bronchique non à petites cellules, la méthylation du promoteur de RASSF1 constitue également un biomarqueur pronostique et prédictif. En effet, la méthylation du promoteur de RASSF1 est associée à des caractéristiques clinico-pathologiques d’agressivité, comme le caractère peu différencié de la tumeur, le stade avancé, la survenue de récurrence locale ou de métastase à distance et la faible survie globale et sans progression, définissant un sous-groupe plus agressif susceptible de progresser vers un stade métastatique (8,9).
Enfin, la méthylation du promoteur de RASSF1 a été rapportée comme prédisant la réponse aux chimiothérapies à base de platine, notamment dans des cohortes de patients atteints de carcinome bronchique non à petites cellules (9–11).

Intérêt clinique de l’identification de la méthylation du promoteur de RASSF1 

Malgré le développement de nouvelles thérapies, le cancer du poumon représente encore un problème majeur de santé publique, avec une mortalité qui reste élevée, du fait que la majorité des patients (environ 75%) présente au moment du diagnostic, un stade localement avancé ou métastatique, non opérable. La chirurgie étant le traitement le plus efficace, la détection des stades précoces est indispensable pour améliorer la mortalité de la maladie (12). C’est pourquoi la communauté scientifique discute de la pertinence du dépistage organisé du cancer du poumon. La tomodensitométrie à faible dose chez des personnes fortement exposées au tabac, ou l’ayant été, est l’un des tests de dépistage envisagé, qui a démontré son efficacité en réduisant la mortalité des patients dépistés (13). Cependant, la sensibilité et la spécificité de ce test de dépistage, ne semble pas optimale, puisqu’il persiste un risque de surdiagnostic, de faux positif (conduisant à des procédures diagnostiques invasives) et que les effets d’expositions répétées à des intervalles réguliers d’un tel test de dépistage ne sont pas connus. Pou r ces raisons, l’intérêt de la tomodensitométrie à faible dose comme test de dépistage organisé du cancer du poumon ne fait pas l’objet d’un consensus au niveau international, et particulièrement en Europe.
Ainsi, l’identification de nouveaux biomarqueurs, telle la méthylation du promoteur de RASSF1, pourrait permettre non seulement de détecter ces lésions plus précocement, mais aussi d’adapter la prise en charge de ces lésions susceptibles d’évoluer vers une maladie métastatique.
Dans le cadre d’un dépistage de lésions débutantes, chez des personnes fortement exposées au tabac ou l’ayant été, pour lesquelles l’imagerie peu spécifique est prise à défaut, et afin d’augmenter la proportion de patients opérables au moment du diagnostic, la recherche de la méthylation du promoteur de RASSF1 pourrait se faire à partir d’un prélèvement sanguin (biopsie liquide). Certaines études ont en effet démontré une association entre la détection de la méthylation du promoteur de RASSF1 dans le sang et depuis la pièce de carcinome bronchique non à petites cellules, avec une sensibilité et spécificité élevée, respectivement de 85,7% et 100% (14). Ce test présenterait une bonne sensibilité et une spécificité, un coût acceptable, peut être répété à intervalle régulier en toute innocuité, et s’applique à une pathologie grave et fréquente, pouvant faire l’objet d’un traitement efficace.
En termes d’intérêt pronostic et théranostic, l’identification de la méthylation du promoteur de RASSF1 sur matériel biopsique, chez les patients de stade précoce, s’intégrant à la démarche diagnostique et théranostique préexistante, permettrait d’identifier un sous-groupe de patients de mauvais pronostic et d’adapter la prise en charge en discutant une chimiothérapie adjuvante. Dans ce sens, de Fraipont et al. (9) rapporte dans une cohorte de 528 patients atteints de carcinome bronchique non à petites cellules de stade précoce, une meilleure réponse au paclitaxel-carboplatine comparé au gemcitabine-cisplatine, chez les patients méthylés pour le promoteur de RASSF1. Cependant, s’agissant d’une étude rétrospective, des études prospectives (avec comme critère de jugement principal la survie globale) apparaissent nécessaire afin d’évaluer l’efficacité du doublet paclitaxel-carboplatine chez les patients atteints d’une tumeur présentant une hyperméthylation du promoteur de RASSF1, en comparaison au vinorelbine-cisplatine, traitement actuel de référence en adjuvant dans les stades précoces possédant le meilleur niveau de preuve (15) ; mais également en comparaison aux autres molécules du doublet à base de platine (étoposide, gemcitabine) encore largement utilisées en pratique, du fait de leurs toxicités moindres, permettant par la suite l’inclusion des patients dans d es essais thérapeutiques novateurs, dont le bénéfice attendu serait supérieur.

Faisabilité de la recherche « en routine » du statut de méthylation du promoteur du gène RASSF1 

La recherche du statut de méthylation du promoteur du gène RASSF1 peut aisément être réalisée en routine dans les laboratoires par PCR spécifique de méthylation (MS-PCR), puisqu’il s’agit d’une technique peu onéreuse, reproductible, rapide et facile à mettre en œuvre (ne nécessitant pas d’équipements lourds).
Toutefois, cette technique présente plusieurs limites.
En effet, alors que de nombreux travaux de la littérature confèrent une fonction de biomarqueur des cancers à la présence d’une méthylation du promoteur de RASSF1, certaines études ne retrouvent pas d’association significative entre cancer et méthylation du promoteur de RASSF1 (16–19). Or, dans ces études, i) le statut “méthylé” ou “non méthylé” du promoteur de RASSF1, déterminé par MS-PCR, ne s’intéressait pas strictement aux mêmes ilots CpG puisque le couple d’amorce utilisé pour amplifier la séquence méthylée différait de celui utilisé dans les études rapportant un impact pronostic et/ou prédictif de la perte d’expression de RASSF1A et ii) l’appréciation de la présence de la méthylation n’est que qualitative, évaluée subjectivement sur gel d’agarose, sans contrôle de la réelle perte d’expression de RASSF1A (8,20). Ces deux points constituent des biais majeurs.
Afin d’envisager la recherche en routine du statut de méthylation du promoteur du gène RASSF1, il est donc crucial i) de clarifier les îlots CpG du promoteur de RASSF1 responsables des caractéristiques clinico-pathologiques observées, d’autant plus que le promoteur de RASSF1 est relativement grand, et comporte de nombreux îlots CpG (8), et ii) d’harmoniser la méthodologie et le choix des techniques à mettre en œuvre. Il convient ainsi d’envisager l’utilisation de technique plus spécifique et précise que la MS-PCR, tel le pyroséquençage, qui représente une technique de choix, permettant de quantifier cette fois la méthylation (20), et ayant fait ses preuves dans une précédente étude s’intéressant à la méthylation du promoteur de RASSF1 dans le cancer du poumon (9). Dans un avenir proche, les séquenceurs haut débit de 3 ème génération pourront également nous permettre des analyses robustes du méthylome.
En pratique à Caen, le pyroséquençage apparaît à ce jour, être la méthode appropriée, d’autant plus qu’il s’agit d’une méthode maîtrisée et utilisée en routine dans le service d’Anatomie et Cytologie Pathologique du CHU, pour la recherche de méthylation du promoteur de MGMT, chez les patients de plus de 55 ans porteurs d’un glioblastome. Sa mise au point et sa mise en place en pratique de routine, à la fois sur matériel biopsique (bloc de paraffine) et sur prélèvement sanguin, paraît relativement simple.

Pourquoi la méthylation du promoteur de RASSF1 n’est pas déjà utilisée en routine ?

La méthylation du promoteur de RASSF1 n’étant pas exclusive vis à vis des principales altérations moléculaires retrouvées dans le CBNPC (8), son identification n’a de sens qu’en parallèle du profilage moléculaire (déjà effectué dans les stades métastatiques).
En effet, devant l’efficacité relative des chimiothérapies adjuvantes (ne permettant qu’une amélioration de 5% de la survie globale à 5 ans) et le succès des thérapies ciblées et de l’immunothérapie dans les stades métastatiques, plusieurs études évaluent l’intérêt de telles thérapies en adjuvant dans les stades précoces (21).
Ainsi, intégrer l’identification de la méthylation du promoteur de RASSF1 au profilage moléculaire dans les stades précoces, permettrait de balayer l’ensemble des altérations moléculaires et de proposer une thérapie adjuvante adaptée (dont l’efficacité reste à prouver en adjuvant).
Cependant, cette approche soulève en pratique la problématique de la quantité de matériel disponible pour effectuer ce profilage moléculaire, d’autant plus vraie dans ces lésions précoces difficilement accessibles. La biopsie liquide (prélèvement sanguin), déjà indiquée dans la détection des mutations de résistance de l’EGFR dans les stades métastatiques (15), pourrait représenter une bonne alternative à la biopsie tissulaire (22). Ainsi, elle permettrait de réaliser le profilage moléculaire de la tumeur en recherchant les principales mutations oncogéniques “drivers”, des facteurs prédictifs de réponse à l’immunothérapie (notamment la charge mutationnelle), mais également d’évaluer ou de conforter la pertinence de nouveaux biomarqueurs, et notamment de la méthylation du promoteur de RASSF1.

Quelles cibles thérapeutiques faut-il envisager chez les patients porteurs d’une tumeur avec hyperméthylation du promoteur de RASSF1 ?

La perte d’expression de RASSF1A est responsable de l’altération de deux voies de signalisation : la voie des RhoGTPases et la voie Hippo, pour lesquelles des cibles thérapeutiques ont déjà été identifiées, offrant une perspective thérapeutique pour les patients atteints de CBNPC méthylé pour le promoteur de RASSF1.
Parmi ces cibles thérapeutiques, des inhibiteurs pharmacologiques de ROCK, l’un des effecteurs majeurs de RhoA, sont actuellement développés et testés chez des patients atteints de pathologies variées (23) ; des inhibiteurs de YAP sont également en développement (24,25).
Cependant, aucun médicament pouvant endiguer les effets de l’altération concomitante de ces deux voies de signalisation n’a été identifié. C’est pourquoi, nous recherchons une nouvelle cible thérapeutique, notamment parmi les acteurs de la communication intercellulaire, puisque les voies de signalisation Hippo et des Rho GTPAses contribuent à réguler le trafic cellulaire/vésiculaire (26,27). Rechercher une cible thérapeutique parmi les acteurs de cette communication et notamment des TnTs constitue une approche originale et innovante ; l’implication de la communication intercellulaire dans la carcinogenèse étant encore peu évaluée.
Après avoir discuté de la place et de l’intérêt en pratique clinique de l’hyperméthylation du promoteur de RASSF1 comme biomarqueur des cancers, à visée diagnostique, pronostique et théranostique, nous allons discuter de l’intérêt de l’identification des TnTs dans les cancers, indépendamment de l’expression deRASSF1A.

Tunneling nanotubes : vers une utilité en clinique ?

Implication des TnTs dans la carcinogenèse 

Bien que la communication intercellulaire via les TnTs ne soit pas spécifique aux cellules cancéreuses, le fait qu’ils soient retrouvés en nombre augmenté dans ces dernières, plaide en faveur de leur implication dans la carcinogenèse. En effet, la formation des TnTs est favorisée par un environnement hostile (inflammation, hypoxie…), permettant à la cellule tumorale, en adressant différents signaux aux cellules avoisinantes, de modifier son environnement de prime abord hostile afin de le rendre plus propice à la formation d’une niche tumorale (28,29).
Plusieurs types de signaux/cargos transitent par les TnTs (30). Les cellules du microenvironnement tumoral et notamment les cellules souches mésenchymateuses, transfèrent par exemple, des mitochondries aux cellules cancéreuses, via ces TnTs.
Ce transfert de mitochondries aux cellules tumorales, leur permettent de développer une plasticité métabolique, décrite comme une des caractéristiques des tumeurs, afin d’acquérir des propriétés de migration, de prolifération et de résistance au traitement, notamment au cisplatine et au paclitaxel (31,32). Autre exemple : le transfert horizontal, via les TnTs, de protéines KRAS mutées entre des cellules de cancer colorectale KRAS mutées et sauvages. Ce second type d’échange via les TnTs contribuerait à l’hétérogénéité tumorale observée vis à vis du mutant KRAS dans les cellules receveuses comportant un gène KRAS endogène sauvage et serait responsable de l’acquisition d’un phénotype invasif de ces cellules receveuses (33).
L’ensemble de ces données rapporte l’implication des TnTs dans la carcinogenèse, indépendamment de l’expression de RASSF1A et supporte le concept que la présence de TnTs dans une tumeur pourrait avoir une valeur pronostique péjorative, et ainsi constituer une caractéristique clinico-pathologique d’agressivité (au même titre que le caractère peu différencié d’une tumeur).

Identification de marqueurs de TnTs : où en sommes-nous ?

Les TnTs ont été rapportés in vitro, in vivo et ex vivo, notamment dans des prélèvements tumoraux de patients atteints de mésothéliome pleural malin (MPM) et d’adénocarcinome (34), mais leur identification reste fastidieuse, reposant principalement sur l’identification visuelle de caractéristiques morphologique et/ou fonctionnelle (par la mise en évidence d’un transfert de cargo intercellulaire). La difficulté dans leur identification réside dans le fait i) qu’il s’agisse de structure fragile, sensible à la lumière, au stress oxydatif et à la fixation chimique (35) et ii) qu’aucun marqueur spécifique et universel n’ait encore été rapporté, s’expliquant par l’hétérogénéité de ces structures, révélée par le nombre croiss ant de publications sur le sujet, dans lesquelles la plupart des candidats moléculaires étudiés était probablement plus spécifique du type cellulaire que des TnTs (36).
Cependant, la description de protéines retrouvées dans plusieurs type cellulaire et impliquées dans la formation des TnTs, plaide en faveur de leur spécificité envers les TnTs. Ainsi, l’identification de plusieurs protéines, constituant une signature moléculaire, témoignant de la présence des TnTs, apparaît plus appropriée. Parmi ces protéines, deux d’entre elles ont retenu notre attention : la connexine 43 et la vimentine.

Identification de marqueurs de TnTs : approche in vitro 

Par une approche in vitro, nous avons démontré que parmi les protéines présentes au sein des TnTs (26), la connexine 43 et la vimentine étaient impliquées dans leur formation.
En effet, l’expression de la connexine 43 et de la vimentine augmentait significativement avec la capacité des cellules bronchiques humaines (HBEC-3) à former des TnTs (Figure 6A) (capacité induite par la perte d’expression du gène suppresseur de tumeur RASSF1A (26)).
De plus, la capacité de ces mêmes cellules à former des TnTs était perdue lorsque l’expression de ces protéines était inhibée ( à l’aide de siARN ciblant les messagers de la connexine 43 ou de la vimentine et/ou de RASSF1A) (Figure 6B).

Évaluation de l’impact pronostic de la présence de TnTs dans le MPM : approche ex-vivo 

Afin d’évaluer l’impact pronostic de la présence de TnTs intra-tumoraux, par une approche ex vivo, nous avons caractérisé l’expression immunohistochimique, des protéines connexine 43 et vimentine (marqueurs indirects de TnTs), sur des prélèvements tumoraux de patients atteints de MPM, et enrôlés dans l’essai clinique MAPS (Mesothelioma Avastin plus Pemetrexed-cisplatin Study) de phase 3. Les résultats révèlent sur cette cohorte de 197 patients atteints de MPM que la surexpression de vimentine était un facteur indépendant de mauvais pronostic sur la survie globale (HR 3 (2 ; 4.6) (variation de 200 du score-H) ; p<0.0001) et sans progression (HR 2 (1.5 ; 2.7) (variation de 200 du score-H) ; p<0.0001) en analyse multivariée (Figure 7A), c’est à dire ajustée sur les principales caractéristiques clinicobiologiques (Tableau 1 en Annexe). Bien que l’expression de connexine 43 (et quel que soit son niveau) ait également une valeur pronostique péjorative en analyse multivariée (Figure 7B), l’analyse bivariée révèle qu’elle est dépendante du niveau d’expression de vimentine (Figure 7C-D).

Comment expliquer la disparité pronostique entre ces deux marqueurs de TnTs : connexine 43 et vimentine ?

Nous avons démontré que la connexine 43 et la vimentine constituaient des marqueurs indirects de TnTs, et qu’il existait bien une relation significative entre les immunomarquages connexine 43 et vimentine (chez les patients atteints de MPM) (r de Spearman = 0,22 ; p-value = 0,0019)

Table des matières

CHAPITRE 1 – INTRODUCTION GENERALE 
1. Les tunneling nanotubes (TnTs)
2. Les cancers pleuro-pulmonaires
2.1. Le cancer broncho-pulmonaire (CBP)
2.2. Le mésothéliome pleural malin (MPM)
3. RASSF1A et la carcinogenèse broncho-pulmonaire
4. Objectifs
Références
CHAPITRE 2 – ARTICLE
Abstract
Background
Methods and Materials
Results
Discussion
Conclusions
Abbreviations
Declarations
References
Figure
Supplementary data
CHAPITRE 3 – DISCUSSION GÉNÉRALE 
1. La perte d’expression de RASSF1A : intérêts et place en clinique
1.1. Les mécanismes moléculaires de l’inactivation de RASSF1A
1.2. L’hyperméthylation du promoteur du gène RASSF1, un biomarqueur des cancers à différents égards
1.3. Intérêt clinique de l’identification de la méthylation du promoteur de RASSF1
1.4. Faisabilité de la recherche « en routine » du statut de méthylation du promoteur du gène RASSF1
1.5. Pourquoi la méthylation du promoteur de RASSF1 n’est pas déjà utilisée en routine ?
1.6. Quelles cibles thérapeutiques faut-il envisager chez les patients porteurs d’une tumeur avec hyperméthylation du promoteur de RASSF1 ?
2. Tunneling nanotubes : vers une utilité en clinique ?
2.1. Implication des TnTs dans la carcinogenèse
2.2. Identification de marqueurs de TnTs : où en sommes-nous ?
2.3. Identification de marqueurs de TnTs : approche in vitro
2.4. Évaluation de l’impact pronostic de la présence de TnTs dans le MPM : approche ex-vivo
2.5. Comment expliquer la disparité pronostique entre ces deux marqueurs de TnTs : connexine 43 et vimentine ?
2.6. TnTs et thérapeutique
CHAPITRE 4 – CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES
1. Conclusion générale
2. Perspectives
Références 
Annexe 

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