L’hydrogel d’acide hyaluronique, notre modèle d’étude

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Les protéines fibreuses

Les protéines fibreuses ont un rôle structurel dans la MEC : elles lui confèrent sa résistance mais également son élasticité. Il en existe plusieurs telles que l’élastine, la fibrilline ou la fibuline, cependant, nous allons nous focaliser sur le collagène qui le composant principal de la MEC [13].

Le collagène

Le collagène est la protéine la plus abondante du corps humain, représentant 25 à 35 % de la masse protéique totale [14]. Avec ses 28 isoformes, il constitue une superfamille dite « du collagène » : une grande famille de protéines fibreuses insolubles qui contiennent un domaine commun en triple hélice [15]. La synthèse du collagène peut être divisée en quatre étapes (Figure 2). i) Le précurseur du collagène est une hélice α gauche formée de trois segments : aux extrémités les domaines N-terminal d’un côté et C-terminal de l’autre et au milieu, une séquence polypeptidique caractérisée par la répétition d’un seul et même motif : Gly-X-Y où, le plus souvent, X et Y correspondent respectivement à la proline et l’hydroxyproline. ii) Elle est importée dans le réticulum endoplasmique pour subir les modifications post-traductionnelles qui vont permettre la formation du domaine commun en triple hélice caractéristique cité plus haut. iii) L’hydroxylation de lysines et de prolines va stabiliser la triple hélice aussi appelée procollagène. Certaines hydroxylysines seront par la suite glycosylées, là encore pour promouvoir la stabilité du procollagène. iv) Le procollagène est secrété dans la MEC où les domaines N et C terminaux vont être clivés par les métalloprotéases matricielles (MMP) créant ainsi le collagène sous sa forme mature [16].

Le collagène de type I

Le collagène de type I fait également partie de la sous-famille des collagènes fibrillaires. Il est constitué de trois chaînes α codées par les gènes COL1A1 and COL1A2. La triple hélice formée mesure environ 300 nm et se termine, à chaque extrémité, par des peptides non hélicoïdaux. Le collagène de type I est retrouvé très largement dans le corps humain et chez certains vertébrés au niveau de la cornée, du cartilage, du foie, des ligaments, des os, de la peau, des poumons, des tendons et des valves cardiaques notamment. Généralement la triple hélice est constituée de deux chaînes α1 et une α2. En effet, les homotrimères de chaînes α1 sont retrouvés dans les tissus fœtaux, les tumeurs ou encore les cicatrices ; il sont plus résistants au clivage enzymatique [19]. Les mutations des gènes COL1A1 et COL1A2 causent (i) la maladie de Caffey caractérisée par des douleurs, un gonflement des tissus mous, une hyperesthésie, une irritabilité, une sensibilité à la palpation et des rougeurs sur une ou plusieurs partie(s) du corps, (ii) les syndromes d’Ehlers-Danlos de type arthrochalasique et cardiaque valvulaire respectivement caractérisées par une fragilité tissulaire, une hyper-élasticité cutanée, une hyperlaxité articulaire et par une sévère et progressive dégénérescence des valves cardiaques accompagnée des mêmes symptômes précédemment cités, (iii) l’ostéogenèse imparfaite caractérisée par une faible masse osseuse, une fragilité osseuse et une tendance aux fractures de sévérité variable et (iv) l’ostéoporose post-ménopausique caractérisée par une diminution de la densité et de la résistance osseuse exposant le patient à un risque élevé de fracture [21–25]. La transmission de ces maladies, lorsqu’elle est génétique, est autosomique dominante ou récessive [19].

Le collagène de type III

Le collagène de type III fait également partie de la sous-famille des collagènes fibrillaires. Concernant la synthèse de cette protéine, sa triple hélice est constituée de trois chaines α identiques issues de la transcription du gène COL3A1 et son domaine N-terminal est clivé complètement de façon à s’assembler avec d’autres collagènes (types I, V et/ou XI). Le collagène de type III est plus particulièrement localisé au sein de tissus élastiques comme l’axe gastro-intestinal, le foie, la peau, les poumons ou encore l’utérus et le réseau vasculaire [16,26].
Par ailleurs, des mutations du gène COL3A1 peuvent aboutir au syndrome d’Ehlers-Danlos vasculaire. La plupart des cas humains rapportés de ce syndrome résultent d’une mutation faux sens où une glycine du domaine en triple hélice est remplacée par un autre acide aminé. Dans cette maladie, le pronostic vital peut être rapidement engagé du fait d’un risque accru de rupture des tissus artériels, intestinaux ou utérins. Les personnes atteintes de cette maladie présentent également une peau plus fine, presque translucide [26].

Le collagène de type IV

Le collagène de type IV est un des principaux composants de la lame basale. Les six gènes COL4A1 à COL4A6 codent respectivement pour les chaines α1 à α6 de cette protéine [16]. Seulement trois associations possibles conduisent à la formation du collagène de type IV : les trimères α1α2α1, α3α4α5, et α5α5α6 [27]. Les domaines globulaires présents aux extrémités de la molécule de collagène de type IV permettent une association à d’autres molécules de manière à former un réseau (Figure 3).
Le collagène de type IV est caractérisé par deux domaines globulaires qui favorisent la polymérisation de la protéine avec d’autres molécules de collagène de type IV. Le domaine 7S permet la dimérisation et le domaine NC1 l’hexamérisation. Cet assemblage aboutit à la formation d’un réseau au sein de la lame basale. Figure issue du travail de Mouw et coll., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2015 [16].
Au treillis obtenu s’ajoute des molécules de collagène de type VII, des glycoprotéines et PG. Il en résulte un maillage plus dense qui confère à la lame basale son rôle de filtre.
Lors du remodelage de la MEC par les enzymes matricielles, les MMP, les protéines de la matrice interstitielle ainsi que celles de la lame basale sont clivées. Certains des peptides alors formés sont connus pour avoir des propriétés biologiques. Deux grands groupes de peptides se distinguent : les matrikines et les matricryptines (qui peuvent être considérées comme un sous-groupe de matrikines) [28]. Les matrikines sont les peptides qui avaient déjà une activité biologique quand ils faisaient corps avec la protéine de la MEC (via un domaine de fixation par exemple). Les matricryptines correspondent aux peptides dont la fonction biologique est inactive tant qu’ils ne sont pas clivés [29]. Avec ses six chaines α différentes, la dégradation du collagène de type IV peut aboutir à la formation de nombreux peptides. Parmi eux, six sont connus pour avoir un rôle biologique et sont répertoriés dans le Tableau 2.

Les glycoprotéines adhésives

Les glycoprotéines adhésives possèdent des domaines de liaison cellulaire et matriciel qui permettent l’assemblage des différents composants de la MEC entre eux mais aussi les interactions des cellules avec cette matrice. Elles sont multiples et sont impliquées dans l’adhésion et la migration cellulaire.

La fibronectine

La fibronectine est la seconde protéine la plus abondante dans la MEC. Elle est exprimée à partir du gène FN1 et structurée en dimère d’environ 250 kDa chacun relié par une paire de ponts disulfures. Chaque monomère est formé par différents domaines : les domaines fibronectine de type I, de type II et de type III respectivement appelés FN I, FN II et FN III (Figure 4). La fixation des cellules est notamment permise par l’intermédiaire du motif RGD
(Arg-Gly-Asp) du domaine FN III10 à une intégrine cellulaire (α5β1) [36]. La fibronectine a également d’autres rôles biologiques tels que la cicatrisation, la différenciation, la prolifération et la réorganisation du cytosquelette [37].

Les glycosaminoglycanes sulfatés

Le glucose et le galactose sont les principaux précurseurs des unités saccharidiques des GAG. Ils sont métabolisés par des actions enzymatiques successives dans le cytosol afin d’obtenir cinq sucres uridine diphosphate (UDP) : l’UDP acide glucuronique, l’UDP galactose, l’UDP N-acétylgalactosamine, l’UDP N-acétylglucosamine et l’UDP xylose. Les formes métabolisées du glucose et du galactose sont assemblées par des enzymes présentes pour la plupart dans le cytosol, sinon, dans le réticulum endoplasmique ou l’appareil de Golgi où peuvent se faire la liaison covalente au tronc protéique pour la synthèse d’un PG ainsi que la sulfatation pour ce dernier [45,51].
La fonction des GAG dépend de leur structure moléculaire. Cette structure est elle-même déterminée par les réactions d’épimérisation qui ont lieu dans l’appareil de Golgi (Figure 8) [45].

Le groupe de l’héparane sulfate et de l’héparine

Les héparanes sulfates et les héparines sont constitués par le N-acétylglucosamine et respectivement par l’acide glucuronique ou l’acide iduronique en cas d’épimérisation.
Concernant l’héparane sulfate, les liaisons entre les sous-unités sont de type
β (1-4) glycosidiques et les liaisons entre les unités disaccharidiques de type α (1-4) glycosidiques tandis que toutes les liaisons de l’héparine sont de type α (1-4) glycosidiques [45]. Les chaînes d’héparanes sulfates comptent généralement entre 50 et 200 répétitions d’unités disaccharidiques soit 25 000 à 100 kDa [57]. L’héparine a un poids moléculaire moins élevé qui varie entre 5 et 30 kDa [58]. Le degré de sulfatation de ces GAG influe sur leur capacité à interagir avec d’autres protéines telles que les cytokines ou les facteurs de croissance déterminant ainsi leur fonction biologique. Ils s’associent à un cœur protéique à partir d’un motif tétrasaccharidique de résidus xylose (1), galactose (2) et acide glucuronique fibreuses ou facteurs de croissance) et notamment à l’antithrombine III pour l’héparine, ce qui lui confère une activité anticoagulante [45]. Les PG à héparanes sulfates tels que le perlecan interagissent également avec des facteurs de croissance en les séquestrant afin qu’ils soient libérés suite à un stimulus particulier ou afin de créer un gradient [57].

Le groupe du kératane sulfate

Le kératane sulfate est majoritairement localisé dans la cornée puis le cerveau. Dans la cornée, il permet de maintenir un espace précis entre les fibres de collagène pour assurer la clarté visuelle et une hydratation optimale. Dans le cerveau, le kératane sulfate joue un rôle régulateur de la prolifération cellulaire [45]. Il peut contenir jusqu’à 50 unités disaccharidiques de galactose et de N-acétylglucosamine (entre 20 000 et 25 000 Da). Ils sont liés les uns aux autres par des liaisons β (1-4) glycosidiques et les unités disaccharidiques par des liaisons β (1-3) glycosidiques [53]. Les deux sucres peuvent être sulfatés, le N-acétylglucosamine de façon plus importante. Le kératane sulfate est le seul GAG sulfaté qui ne s’associe pas à un cœur protéique par l’intermédiaire d’un motif tri ou tétrasaccharidique lors de la formation d’un PG. Il existe trois types de kératanes sulfates selon le mécanisme utilisé pour l’ancrage au cœur protéique. Les kératanes sulfates de type I s’associent au cœur protéique par l’intermédiaire d’un glycane complexe et d’une asparagine. Les kératanes sulfates de type II, principalement retrouvés dans le cartilage, se lient au cœur protéique à partir d’un résidu N-acétylgalactosamine sur un acide aminé sérine ou thréonine. Les kératanes sulfates de type III sont plus souvent observés au niveau cérébral et utilisent un résidu mannose pour créer une liaison avec un acide aminé sérine ou thréonine du cœur protéique [45].

L’acide hyaluronique

L’AH est un GAG particulier. Non sulfaté, il est moins hydrophile que les autres GAG mais sa grande taille (jusqu’à 25 000 unités disaccharidiques soit 20 000 kDa) lui permet de stocker une quantité plus importante de molécules d’eau. Il est composé par l’acide glucuronique qui porte la charge négative et par le N-acétylglucosamine [59]. L’AH ne forme pas de PG mais il peut interagir avec eux (agrécane, brévicane, neurocane et versicane) de façon non-covalente via des motifs particuliers : les hyaluronan-binding motifs, jouant ainsi un rôle de plateforme [53].
L’AH sera décrit plus en détail que les autres GAG cités plus haut car il s’agit du biomatériau de base de notre modèle de culture.

Biosynthèse et renouvellement de l’acide hyaluronique

L’AH est le GAG dont la structure est la plus simple, sans ajout de groupements sulfates et sans modification post-polymérisation dans l’appareil de Golgi. Il est directement synthétisé à la face interne de la membrane plasmique cellulaire. Les sucres précurseurs, l’UDP acide glucuronique et l’UDP N-acétylglucosamine, sont métabolisés dans le cytoplasme et recrutés à la membrane plasmique par diffusion [45]. Ils sont alors assemblés par des liaisons β (1-3) glycosidiques et des liaisons β (1-4) glycosidiques entre les unités disaccharidiques. Lapolymérisation de l’AH est permise par les enzymes hyaluronan synthases (HAS) transcrites et traduites à partir des gènes Has1-3 [60]. Suite à la polymérisation, l’AH est secrété dans la MEC (Figure 10) [45].
L’AH est un GAG composé par l’acide glucuronique et le N-acétylglucosamine. Les formes précurseurs de ces sucres sont assemblées via une l’action enzymatique de la hyaluronan synthase (HAS) à la face interne de la membrane plasmique cellulaire. D’après Vincent Hascall and Jeffrey D. Esko, Essentials of Glycobiology, 3rd edition, 2017 [60].
L’AH est dégradé par l’action enzymatique des hyaluronidases codées par les gènes HYAL1-3 et SPAM1 (pour la protéine sperm adhesion molecule 1) où l’action est limitée à la spermatogenèse et la fécondation. Le gène HYAL4 est un cas particulier, il code pour une hyaluronidase qui a une action de chondroïtinase. L’AH est également capté par différents récepteurs afin d’être détruit dans le lysosome. Lorsque la dégradation est locale, l’AH est reconnu par le récepteur hyaluronan receptor for endocytosis (HARE). Sinon, la dégradation peut avoir lieu dans les ganglions lymphatiques ou au niveau du foie. Dans ce cas, l’AH est respectivement fixé par le lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1 (LYVE-1) ou le liver endothelial cell clearance receptor (LEC receptor) puis éliminé [60].

Les différentes fonctions de l’acide hyaluronique

L’AH est un GAG ubiquitaire capable d’attirer de nombreuses molécules d’eau (jusqu’à 10 000 fois son poids en eau). Une fois hydraté, l’AH gagne en volume ce qui lui confère la capacité de résister à la compression mais également de faciliter la migration cellulaire (particulièrement lors de la cicatrisation) grâce à sa conformation en hélice [49,60]. Sa charge en eau lui donne une consistance de gel qui permet la lubrification notamment au niveau des articulations [45,56].
Afin d’exercer une fonction biologique, l’AH doit être fixé par un récepteur. Les deux récepteurs principaux de l’AH sont le cluster of differentiation 44 (CD44) et le receptor for hyaluronan-mediated motility (RHAMM). Le CD44 est un récepteur transmembranaire avec un domaine extracellulaire unique de liaison à l’AH. La fixation du ligand entraîne un changement de conformation du domaine cytoplasmique du récepteur qui permet une interaction avec des protéines régulatrices de la migration, de la prolifération ou encore de la réorganisation du cytosquelette. Il existe des variants du récepteur CD44 qui sont obtenus par épissage alternatif, glycosylation ou oligomérisation tel que le CD44H, l’isoforme exprimée par les cellules souches hématopoïétiques (CSH). La liaison de l’AH au récepteur RHAMM active d’autres protéines impliquées dans la motilité, la prolifération cellulaire et la survie. Il existe également des variants du récepteur RHAMM, certains sont intracellulaires. L’intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) et la layiline sont d’autres protéines réceptrices de l’AH. Lorsqu’il est fragmenté et capté par les toll-like receptors (TLR-2 et 4), l’AH envoie un signal de « blessure » et déclenche alors l’expression de gènes inflammatoires [61]. L’AH joue également un rôle important dans la morphogenèse. Ses fonctions de promotion de l’adhésion, la différenciation, la migration, et la prolifération cellulaires permettent la formation du cartilage, du cœur, des neurones, des os et des vaisseaux sanguins [61]. Ces fonctions, associées à l’impact de l’AH sur la survie cellulaire, sont également clés pour la carcinogenèse. En effet, l’expression de certains variants du récepteur CD44 est corrélée à l’apparition et à la progression du cancer [45,60]. C’est pourquoi la régulation de la signalisation de l’AH doit être très fine. Cette régulation est basée sur la taille de l’AH qui varie selon l’enzyme de synthèse et l’activité enzymatique des hyaluronidases ou d’autres acteurs responsables de la dégradation de l’AH tels que les espèces réactives de l’oxygène ou reactive oxygen species (ROS). L’AH de haut poids moléculaire (à partir de 1 000 kDa), plus visqueux, présente des propriétés anti-inflammatoires, immunosuppressives et lubrifiantes tandis que l’AH de bas poids moléculaire peut induire la libération de cytokines pro-inflammatoires [62].
Le rôle de l’AH dans la cancérogenèse sera abordé dans la partie I.4.
L’AH est utilisé en tant qu’agent thérapeutique dans différents domaines. Dans le cas de l’arthrose, des injections d’AH au niveau des articulations touchées peuvent soulager les patients. L’AH a également une application dans la chirurgie ophtalmique où il est injecté de manière à protéger le champ d’opération tout en le maintenant accessible [60].

Facteurs de croissance matriciels

L’adhésion des cellules à la MEC entraîne la sécrétion de facteurs de croissance par ces cellules pour influencer leur différenciation, leur prolifération ou leur survie. Ces facteurs sont ensuite séquestrés par les protéines de la matrice, notamment par les PG à chondroïtine et héparane sulfate. Cette séquestration a plusieurs conséquences : (i) leur stockage, (ii) la protection de la dégradation des facteurs de croissance par des protéases, (iii) une concentration de l’activité pour une action prolongée, (iv) la création d’un gradient de concentration, (v) la proximité du ligand et de son récepteur pour une activation rapide de la voie de signalisation. De plus, la séquestration permet également de contrôler positivement ou négativement l’activité des facteurs de croissance. Les facteurs de croissance peuvent à leur tour exercer aussi un rôle sur la MEC en induisant sa synthèse et/ou sa dégradation en promouvant la production d’enzymes. La liaison du facteur de croissance peut être directe, c’est-à-dire sur son récepteur, ou indirect par l’intermédiaire des intégrines. Par ailleurs, la liaison est aussi possible sur les matrikines et matricryptines des protéines de la MEC [63–65].

L’epidermal growth factor

L’epidermal growth factor (EGF) est une protéine de 6 kDa exprimée à partir du gène EGF et qui a pour récepteur l’epidermal growth factor receptor (EGFR). Elle peut également interagir avec des domaines protéiques liant l’EGF présents sur les protéines de la MEC décrites plus haut et leurs matrikines (avec une affinité plus faible). L’EGFR est une glycoprotéine transmembranaire de 170 kDa aux ligands multiples dotée d’une activité tyrosine kinase. L’interaction du ligand à son récepteur permet de promouvoir la différenciation, la prolifération, la migration, et la survie cellulaire ainsi que la production de ROS [56,64–67].

Le fibroblast growth factor

Chez l’Homme, la famille des fibroblast growth factors (FGF) compte 22 membres dont le poids moléculaire varie entre 7 et 38 kDa répartis dans six sous-familles selon leur homologie de séquence et leur phylogénie. Le récepteur du FGF (FGFR) existe sous quatre formes et chacune d’elle présente plusieurs variants obtenus après épissage alternatif. Il s’agit de protéines transmembranaires à activité tyrosine kinase. Ligands et récepteurs sont respectivement exprimés à partir des gènes Fgf1-22 et FGFR1-FGFR4. Les fonctions des FGF sont nombreuses, ils sont notamment impliqués dans l’angiogenèse, la cicatrisation, la migration et la prolifération cellulaire ainsi que la mécanotransduction [56,64,65,68].

Le platelet-derived growth factor

Le platelet-derived growth factor (PDGF) est un dimère de 30 kDa formé par deux chaînes protéiques. Il existe quatre types de chaînes (A, B, C ou D) exprimées à partir de gènes distincts (Pdgfa-d) qui forment cinq isoformes de PDGF (AA, AB, BB, CC ou DD). Les différentes isoformes peuvent se lier aux deux récepteurs du PDGF, le PDGFRα et β, avec une affinité variable. Le PDGF est un facteur pro-angiogénique qui est secrété par les cellules endothéliales de plusieurs tissus et également par les monocytes lors de leur adhésion à la MEC. Au moment de l’angiogenèse, le PDGF est secrété et stocké par la MEC par le biais d’intégrines car il est nécessaire à la maturation des vaisseaux sanguins [64,69,70].

Le transforming growth factor β

Le transforming growth factor β (TGF-β) est exprimé par toutes les cellules du corps humain sous trois formes, TGF-β1-3, à partir de trois gènes, respectivement et Tgfb1-3. Dans sa forme active, le TGF-β est un homodimère de 25 kDa, associé à son récepteur, le TGF-β receptor (TGFBR) qui existe également sous trois formes, TGFBR1-3, exprimés à partir des gènes Tgfbr1-3. Les récepteurs TGFBR1 et 2 ont des activités à la fois sérine/thréonine kinase et tyrosine kinase tandis que le TGFBR3 n’a pas d’activité kinase. Le TGF-β, régule (i) la synthèse de protéines de la MEC par les fibroblastes telles que le collagène ou encore l’AH, (ii) la différenciation, (iii) la prolifération, (iv) la réponse inflammatoire et (v) la survie cellulaire [64,65,71–73].

Le vascular endothelial growth factor

Chez l’Homme, la famille des vascular endothelial growth factors (VEGF) compte cinq membres : VEGF-A-D et le placental growth factor (PlGF). Le VEGF receptor (VEGFR) existe sous trois formes, VEGFR1-3, chacun avec sa spécificité de ligand et de signalisation. Les récepteurs VEGFR-1 et 2 médient l’angiogenèse tandis que le VEGFR-3 peut participer à l’angiogenèse lors des phases précoces de l’embryogenèse mais active surtout la lymphangiogenèse. Le VEGF-A peut également être capté par les domaines FN III présents sur la fibronectine et la ténascine [56,64,69,74].

Propriétés mécaniques

Le corps peut capter des signaux mécaniques extérieurs par le biais de mécanorécepteurs présents dans la peau et à proximité des os. Le stimuli extérieur (contact, étirement, mouvement, ondes sonores ou pression) est transduit en un signal intracellulaire via des canaux ioniques sensibles à la pression. Par exemple, ce sont les barorécepteurs, des mécanorécepteurs particuliers, qui détectent et transmettent les changements de pression artérielle au système nerveux autonome afin qu’elle soit corrigée [75,76].
Les cellules sont également sensibles à leur microenvironnement mécanique. En effet, les modifications des interactions qu’elles entretiennent avec les cellules voisines ou les protéines de la MEC via les intégrines entraîne une contraction du cytosquelette. Cette réorganisation initie l’association de protéines clés de la motilité cellulaire qui, à son tour, active la voie de signalisation des protéines Rho (RhoA et Rac1) (Figure 11) pour la modulation de l’expression de gènes en faveur de la différenciation, de la migration, de la prolifération ou régulant la morphologie cellulaire [77,78].

Table des matières

REMERCIEMENTS
RÉSUMÉ
ABSTRACT
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
INTRODUCTION
I. Le microenvironnement
1. La matrice extracellulaire
2. Facteurs de croissance matriciels
3. Propriétés mécaniques
4. Le microenvironnement tumoral
II. Les différents modèles de culture tridimensionnels
1. Culture à la surface ou au sein de supports tridimensionnels
2. Génération de sphéroïdes en suspension
III. L’acide hyaluronique, un modèle de culture tumorale
1. Généralités
2. L’hydrogel d’acide hyaluronique, notre modèle d’étude
IV. La génipine
OBJECTIFS
I. Caractérisation du modèle
II. Les cellules souches hématopoïétiques
MATÉRIEL ET MÉTHODES
I. Synthèse des hydrogels d’acide hyaluronique
II. Traitement et réticulation des hydrogels
1.Traitement des hydrogels
2. Réticulation des hydrogels
III. Caractérisation des hydrogels
1. Définition du degré de réticulation : test à la ninhydrine
2. Étude de la résistance à la dégradation enzymatique : test du carbazole
3. Microscopie à force atomique
4. Microscopie électronique à balayage
5. Propriétés thermiques
6. Gonflement ou swelling ratio
IV. Culture
1. Lignées CB74, CB109 et CB191
2. Lignée HMEC-1
3. Lignée MDA-MB-231
4. Culture primaire
5. Culture 3D
6. Co-culture CB74 et HMEC-1
V. Étude de la viabilité et de la prolifération cellulaires
1. Test au LIVE/DEAD®
2. Test au Cell Counting kit-8®
VI. Test de clonogénicité
1. Récupération des cellules à partir des hydrogels
2. Test de clonogénicité
VII. Analyses statistiques
RÉSULTATS
I. Article
II. Résultats complémentaires
1. Cellules endothéliales seules
2. Co-culture des cellules de glioblastomes et endothéliales
3. Culture de cellules souches hématopoïétiques
DISCUSSION
I. Caractérisation des hydrogels et de leurs traitements
1. Caractérisation physico-chimique
2. Caractérisation mécanique
3. Caractérisation biochimique
II. Effet biologique
1. Différents traitements
2. Différents types cellulaires
CONCLUSION – PERSPECTIVES
RÉFÉRENCES

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