L’hormone de croissance (GH)

La OH est importante dans divers processus biologiques, notamment dans la croissance chez les poissons. L’information disponible quant à ses modes d’action et les facteurs l’influençant demeure cependant incomplète ou contradictoire. Aucune étude de la OH chez S. fontinalis n’a été faite auparavant, malgré l’importance économique de cette espèce. Dans le cas présent, la présence de OH dans l’hypophyse de S. fontinalis a été démontrée, puis une technique pour partiellement l’isoler a été mise au point. Cette étude est la première à détailler un tel processus pour la OH de cette espèce. Cette OH partiellement purifiée de S. fontinalis a ensuite permis de tester l’efficacité du RIA hétérologue développé.

Confirmation de la présence de GH dans l’hypophyse de S. fontinalis 

L’anti-OH saumon/truite peut être utilisé pour la reconnaissance de la OH S. fontinalis. Des RIA ont été fait sur des homogénats d’hypophyses pour fins de validation. Tel qu’attendu, la technique développée a permis de doser de la OH dans les échantillons testés alors qu’aucune OH n’a été détectée dans le contrôle négatif, soit les homogénats de cerveau. Ces données attestent la présence de OH dans l’hypophyse, tel que démontré chez d’autres vertébrés. Avec l’amélioration des techniques, une plus grande proportion de OH a pu être détectée. Notamment, la mise en œuvre d’approches pour limiter la dégradation et! ou l’agrégation des protéines a été favorisée puisque ces phénomènes provoquent la perte de matériel. Dans cette étude, il a été démontré que l’ajout de manipulations lors des filtrations a provoqué une perte importante de OH. Les homogénats testés en RIA, ayant subi une filtration 10-30 kDa ont démontré une perte considérable du matériel dosé lors des essais .

Purification de la GH S. fontinalis sur colonne FPLC 

Des préparations d’homogénats d’hypophyses ont été Soumis à un tamisage moléculaire afin d’isoler la GH d’omble de fontaine. Les fractions de chacun des pics (ou déformation du bruit de fond) ont été combinées pour analyses sur gel SDS PAGE en condition dénaturante, puis passées en Westem-blot avec anti-GH saumon/truite . Parmi ces échantillons testés, celui comportant les fractions allant de 33 à 45 ml contient de la GH. Malgré l’absence de pics suivant ces volumes, une grande proportion de GH a été détectée vers 72 ml. Ce volume d’élution correspond au poids moléculaire estimé pour la GH monomérique d’omble de fontaine, soit 20,5 kDa. Les pics visibles sur le chromatogramme contiennent certes de la GH, mais majoritairement d’autres molécules. Ceci est bien visible sur l’électrophorèse des trois premiers pics alors que la bande de GH n’est pas visible. L’absence de pic sur le chromatogramme, là ou se situe la plus grande quantité de GH monomérique, proviendrait de la faible concentration de protéines totales à cet endroit. Le gel d’électrophorèse confirme bien la plus grande proportion de GH présente, comparativement aux autres fractions analysées, alors que la bande apparaît sur le gel et que le degré de réactivité avec l’ anticorps y est le plus fort pour un même volume d’ échantillon. La présence de dimères, autres oligomères, ainsi que la liaison de la GH avec diverses molécules peut donc expliquer la détection positive de GH à l’intérieur des fractions de haut poids moléculaire. La GH détectée par Westem-blot suite à l’électrophorèse SDS-PAGE en condition dénaturante, est présente vers 20 kDa tel qu’attendu. Aucune autre bande ne réagit avec l’anticorps utilisé. Dans les autres études similaires présentes dans la littérature, seules les fractions correspondant à des pics semblent avoir été analysées. C’est ce que précisent Rand-Weaver et al. (1989) dans leur article alors que les fractions correspondantes à des volumes d’élution supérieurs n’ont pas été testées. La présence de GH ailleurs que dans ces pics n’a pas été vérifiée .

Évaluation d’autres approches et mise au point de la technique 

Un test avec 500 hypophyses a été fait afin de palier à l’absence de pic de GH sur le chromatogramme. Celles-ci ont été homogénéisées et concentrées entre 10 et 30 kDa dans le but de concentrer la quantité de OH et limiter les risques d’interférence provenant des molécules, présentes en grande quantité dans l’échantillon. Ceci n’a toutefois pas permis d’obtenir un pic de OH malgré l’utilisation de 2,5 fois plus de matériel. Une électrophorèse et Westem-blot sur les fractions recueillies confirment la présence de OH suite au tamisage moléculaire bien que l’hormone soit présente en moins grande quantité. Une autre série d’environ 500 hypophyses a été homogénéisée puis le surnageant a été passé sur filtres Amicon-Ultra 10 kDa afin de réduire le volume d’échantillon à déposer sur la colonne. Un meilleur recouvrement de la OH a été obtenu avec cette approche. Le chromatogramme n’a pas montré la présence d’un pic de OH aux volumes d’élutions attendus, mais la concentration de OH monomérique était plus grande dans les fractions prévues. Des tests ont également été faits en comparant les prélèvements d’hypophyses sur têtes congelées à ceux sur des ombles de fontaine frais. L’utilisation d’un même nombre d’hypophyses, prélevées sur des truites fraîches, permet de récupérer une plus grande quantité de GH après le tamisage moléculaire. D’autres tests utilisant des homogénats d’hypophyses frais et des homogénats congelés suivant leur préparation ont été faits. La congélation des échantillons, à cette étape, a provoqué une forte précipitation et la perte subséquente de GH. L’ approche qui a démontré le meilleur rendement pour l’isolation de la GH S. fontinalis est l’utilisation d’hypophyses provenant de têtes fraîches. Les hypophyses doivent ensuite être congelées dès l’extraction. Lors du processus d’homogénéisation, la température des échantillons doit être maintenue à 4 oC et l’agitation trop forte des solutions qui augmente le contact avec l’air doit être limité. L’application de l’homogénat sur la colonne immédiatement après sa préparation donne également les meilleurs résultats .

Table des matières

Chapitre 1 : Revue de littérature 
Introduction
La croissance et son contrôle
– Facteurs exogènes influençant la croissance
– Facteurs endogènes influençant la croissance
L’hormone de croissance (GH)
– Évolution de la GH
– Actions de la GH
– Facteurs influençant la GH
La mesure de la GH par radioimmunoessai
La croissance compensatoire
L’omble de fontaine
Chapitre 2 : Matériel et méthodes 
Prélèvements et préparation des échantillons
– Provenance des ombles de fontaine
– Plasma provenant d’expériences de CC
– Prélèvement de plasma d’omble de fontaine
– Prélèvement d’hypophyses d’omble de fontaine et homogénéisation
– Concentration de molécules plasmatiques et d’homogénats d’hypophyses
Purification de OH S. fontinalis via FPLC
Électrophorèses et Western-blots
– Électrophorèses
– Western-blots
– Évaluation du poids moléculaire
Procédure pour le RIA
– Marquage de la OH saumon/truite
– Dosages en RIA
– Comparaison des techniques RIA
– Validation du RIA
Chapitre 3: Reconnaissance de la GH par l’anti-GH saumon/truite et réactivité
croisée avec la PRL 
Reconnaissance de la OH saumon/truite par l’anti-OH correspondant
Présence de OH dans l’hypophyse de S. fontinalis
Interactions croisées avec anti-PRL et PRL S. fontinalis
Réactivité croisée anti-OH saumon/truite et PRL S. fontinalis en RIA.
Chapitre 4 : Purification et caractérisation partielle de la GH S.fontinalis 
Confirmation de la présence de OH dans l’hypophyse de S. fontinalis
Purification de la OH S. fontinalis sur colonne FPLC
Évaluation d’autres approches et mise au point de la technique
Étude et caractérisation de la OH S. fontinalis
Chapitre 5: Développement et validation d’un RIA hétérologue afin de mesurer la GR chez S. fontinalis 
Validation de la stabilité du traceur
Étude de recouvrement de la OH saumon/truite
Limites de détection
Dosage de la OH S.fontinalis
Efficacité de la technique RIA pour doser la OH chez S. fontinalis
Chapitre 6 : Discussion générale 

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