L’extraction d’ADN

L’extraction d’ADN

Généralités sur l’eucalyptus Le genre

Eucalyptus appartient à la famille des Myrtacées qui compte environ 700 espèces, nombre qui varie selon les auteurs (revue par Vigneron, 2000). Les aires naturelles de répartition s’étendent des Philippines jusqu’au sud de l’Australie (Jacobs, 1954 ). Leur évolution ayant suivit celle du super continent Gondwana, la plupart des espèces ont des caractéristiques d’adaptation assez remarquables qui leur permettent de pousser dans des conditions pédoclimatiques très diverses (Eldridge et al., 1993). Outre ces caractères d’adaptation, certaines espèces sont capables de se développer dans des zones impropres à l’agriculture ou à tout autre plantation forestière. Enfin, les eucalyptus possèdent des propriétés sylvicoles intéressantes en plantation : une croissance rapide, une possibilité de multiplication végétative par bouturage, et la propriété de rejeter permettant plusieurs rotations sur une même plantation. Actuellement, environ 15 millions d’hectares sur la planète sont consacrés à la culture de l’eucalyptus, ce qui en fait l’essence feuillue la plus plantée dans le monde (Vigneron et Bouvet, 1997). Le bois d’eucalyptus est utilisé aussi bien comme bois d’énergie (charbon de bois et bois de chauffage), bois de construction (poteaux, bois de sciage), bois pour l’industrie papetière. Au Congo, l’eucalyptus est essentiellement utilisé comme bois de pâte et bois d’énergie.

Programme d’amélioration de !’Eucalyptus au Congo

En 1955, plusieurs espèces d’Eucalyptus ont été introduites au Congo en vue de comparer leurs performances et de repérer les mieux adaptées aux conditions pédoclimatiques du Congo. Ensuite, des hybrides naturels sont apparus avec des performances de croissance supérieures à celles des espèces introduites. A partir des années 70, ces hybrides ont été utilisés en plantations industrielles après la mise au point des techniques de multiplication végétative. Le programme d’amélioration génétique a débuté dans les années 80 avec comme objectif d’ « obtenir des eucalyptus capables de dépasser la limite de production atteinte par les hybrides naturels Eucalyptus PF1 et E. 12ABL * E. saligna (Vigneron, 1992). La maîtrise des techniques de pollinisation contrôlée (Martin et Quillet, 197 4) a permis de tester différentes combinaisons hybrides. Une des formules hybrides la plus prometteuse s’est avérée être le croisement entre E. urophylla et E. grandis. Les caractéristiques de ces deux espèces sont complémentaires : E. urophylla présente une bonne adaptation au Congo, une bonne forme et une assez bonne production alors qu’E. grandis est mal adapté, présente une assez bonne forme et une production potentielle importante. Dans la mesure où les populations de base sont très divergentes, que les populations parentales sont fortement complémentaires et que le taux de consanguinité de l’hybride est nul, la sélection récurrente réciproque (SRR) est apparue comme la meilleure solution pour l’amélioration génétique des eucalyptus au Congo (Vigneron, 1991 ). Dans son principe la SRR vise à améliorer de façon conjointe et orientée deux groupes d’individus l’un par rapport à l’autre. Ceci à pour but d’obtenir des hybrides intergroupes recombinants différents caractères présents séparément dans chacun des deux groupes (Gallais, 1978). Le schéma de la SRR est représenté à la figure 1. La SRR comporte plusieurs étapes: G) la constitution des populations parentales CV la présélection d’une centaine de géniteurs G) la réalisation d’un plan factoriel incomplet pour les géniteurs sélectionnés. Il permet d’estimer la valeur de chaque géniteur en croisement (l’aptitude générale à la combinaison : AGC). Les hybrides interspécifiques de première génération constituent la base de la sortie variétale qui peut prendre plusieurs formes : clones, mélange de clones ou famille … © une recombinaison intraspécifique entre géniteurs sélectionnés sur la base de leur AGC permet d’obtenir les populations parentales de seconde génération. Cette étape de recombinaison intraspécifique évitent une perte trop rapide de la variabilité génétique, tout en augmentant la fréquence des allèles favorables.

Les principaux problèmes de la sélection chez les arbres forestiers

Pour de nombreuses espèces forestières un minimum de 20 à 30 ans de recherches et d’évaluation est nécessaire avant de pouvoir produire les premières variétés. En effet, l’amélioration génétique des arbres forestiers est confrontée à trois contraintes majeures : Une évaluation tardive des caractères de croissance et de qualité du bois. Il faut attendre, pour les espèces à croissance rapide 6 à 12 ans chez le pin radiata (Cotterill et Dean, 1988), le pin taeda (McKeand, 1988) et trois ans chez l’eucalyptus (Bouvet, 1991 ). L’évaluation est beaucoup plus tardive pour les espèces à croissance lente comme le chêne, le teck, l’acajou. Les caractères intéressants pour le sélectionneur (croissance, forme, adaptation, qualité du bois) sont soumis à de forts effets du milieu. L’héritabilité (sensu stricto ) de ces caractères est généralement faible à moyenne variant de 0, 10 à 0,40 (Kremer, 1994 ). Le choix des meilleurs individus dans les meilleurs familles n’est donc pas optimal. Les sélectionneurs sont contraints d’attendre la maturité sexuelle avant de pouvoir effectuer des croisements. Cette maturité sexuelle apparaît tardivement chez les arbres forestiers : de 3 à 5 ans chez l’eucalyptus, de 5 à 10 ans chez le peuplier, de 15 à 25 ans chez l’épicéa.

Les biotechnologies au service de l’amélioration génétique

Même si les sélectionneurs sont en mesure d’offrir des variétés forestières améliorées à l’aide des méthodes de sélection classique, des techniques visant à augmenter les gains génétiques par unité de temps (sélection précoce) et à améliorer l’efficacité de la sélection (choix des meilleurs géniteurs) sont recherchées. Dans l’optique de développer rapidement des variétés d’ Eucalyptus à forte productivité et mieux adaptées aux applications industrielles, deux stratégies sont envisageables La transformation génétique combinée à la production en masse du matériel via l’embryogenèse somatique (Harvengt et al., 2000), permet de « créer» puis de multiplier rapidement des génotypes répondant aux demandes des utilisateurs (sylviculteurs, industriels .. . ). Des résultats récents, obtenus notamment chez le tabac et le peuplier, ont montré qu’il était possible de modifier la composition chimique du bois au niveau des lignines et de la cellulose (Grima-Pettenati et Goffner, 1999). Cette modification permettrait d’optimiser le procédé industriel de fabrication de la pâte à papier tout en le rendant moins polluant et moins coûteux (Boudet, 1997). Chez l’eucalyptus, les problèmes liés à la régénération rendent pour le moment la multiplication par embryogenèse somatique impossible. D’autre part, des questions restent posées : sur plusieurs années, comment se comportent ces arbres transformés en conditions naturelles ? Quelles sont les éventuelles répercussions sur l’environnement de l’introduction de transgènes (Jouanin, 2000)? Enfin, les craintes de l’opinion publique relatives aux OGM rendent délicate l’utilisation d’arbres transgeniques pour l’instant. La seconde stratégie s’appuie sur l’exploration et la mise à profit de la variabilité génétique naturelle. La sélection assistée par marqueurs (SAM) permettrait de sélectionner rapidement à moindre coût les individus les plus performants : sélection des individus qui possèdent le ou les allèles favorables des gènes qui contrôlent les caractères quantitatifs d’intérêt. Ces loci sont appelés QTL pour Quantitative Trait Locus (Geldermann, 1975). En 1923, Sax a été le premier à utiliser des marqueurs morphologiques pour mettre en évidence les zones chromosomiques impliquées dans les variations quantitatives. Il trouva une association entre la pigmentation des téguments de la graine de haricot (caractère qualitatif contrôlé par un seul gène) et la taille du grain (caractère quantitatif contrôlé par de nombreux gènes). Depuis, le développement des techniques de marquage moléculaire a ouvert de nouvelles perspectives pour la détection de QTL : la construction de cartes génétiques saturées et la recherche de QTL sur ces cartes. Des cartes génétiques saturées ont été construites pour différentes espèces d’Eucalyptus, à l’aide de marqueurs anonymes : RAPD (Grattapaglia et al., 1994 ; Verhaegen et Plomion, 1996), AFLP (Marques et al., 1998). L’existence de ces cartes a permis la mise en évidence la de QTL pour des caractères de qualité du bois, de croissance et de multiplication végétative (Grattapaglia et al., 1995 ; Verhaegen et al., 1997; Byrne et al. 1997; Marques et al. 1999). Cependant par rapport aux espèces annuelles, les analyses QTL sont encore peu développées chez les arbres forestiers (Plomion, 2000). En effet, ce sont généralement des espèces allogames caractérisées par un haut niveau de diversité génétique et un déséquilibre de liaison faible. Or, un déséquilibre de liaison entre le locus marqueur et le QTL est indispensable pour la détection. L’utilisation des gènes sous jacent aux QTL pourrait permettre de s’affranchir du faible déséquilibre de liaison, des phénomènes de recombinaison et de caractériser ces QTL.

Table des matières

Introduction et synthèse bibliographique
1. Généralités sur l’eucalyptus
2. Programme d’amélioration de L’Eucalyptus au Congo
3. Les principaux problèmes de la sélection chez les arbres forestiers
4. Les biotechnologies au service de la sélection
5. L’approche gènes candidats appliquée à la voie de biosynthèse des lignines
Matériel et méthodes
1. Matériel végétal
1.1. Descendance hybride étudiée
1.2. L’extraction d’ADN
2. Gènes étudiés
3. PCR dirigée pour chaque gènes fonctionnels
3.1 . Choix des amorces
3.2. Conditions d’amplification PCR
4. Séquençage des produits PCR
5. Révélation du polymorphisme par SSCP
5.1 . Principe
5.2. Conditions SSCP
6. Cartographie génétique
7. Caractères mesurés
8. Détection de QTL
8.1. Analyse de variance (ANOVA)
8.2. Maximum de vraisemblance (lnterval Mapping)
Résultats et discussion
Partie I : Cartographie des gènes
1. Optimisation des conditions d’amplification PCR
2. Résultats du séquençage
3. Optimisation des conditions SSCP
4. Héritabilité mendélienne des fragments SSCP
5. Causes moléculaires du polymorphisme SSCP
6. Localisation des gènes sur les cartes parentales
Partie Il: Co/ocalisation gène!QTL
1. Les caractères étudiés
1.1. Etude de la variabilité des caractères
1.2. Corrélations phénotypiques des caractères
2. Mise en évidence de QTL
2.1. Détection par ANOVA et lnterval mapping
2. 1. 1. Caractères de vigueur
2. 1.2. C ractères de forme
2. 1.3. Le pylodin
2. 1.4. Propriétés mécaniques du bois
3.5.3 Propriétés chimiques du bois
2.1. Test de permutation
2. Colocalisafon gène-QTL
3. Cas des gè es CAD et CCoAOMT
Conclusions et perspectives
Bibliographie

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