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Changement du phénotype des cellules
Dernier mécanisme de résistance « off-target », les changements phénotypiques des cellules tumorales ont été démontrés en clinique. Le premier de ces mécanismes est la transformation de CBNPC vers un CBPC intervenant dans 12% des cas. Elle est caractérisée par une morphologie différente ainsi qu’un marquage positif de la synaptophysine, la chromogranine ou encore NCAM.127,148 Sans preuve d’une présence de petites cellules avant la résistance acquise, ces cellules émergentes arborent toujours la mutation primaire de l’EGFR prouvant l’origine commune des CBNPC et des CBPC.166 Ce changement phénotypique a également été observé avant exposition des cellules aux ITK-EGFR ainsi que dans des cellules ne présentant pas de mutation du récepteur, l’exposition au médicament n’est donc pas l’unique origine de cette transformation. Elle est associée à une perte de l’expression de RB1, même si elle n’est pas suffisante pour l’induction d’une transformation dans des modèles murins166, et s’accompagne le plus souvent de mutations de PIK3CA.
La transition épithélio-mésenchymateuse ou EMT est impliquée dans 1-2% des mécanismes de résistance acquise.148 Les cellules épithéliales résistantes acquièrent alors des caractéristiques mésenchymateuses s’accompagnant de changements morphologiques et phénotypiques : perte de l’adhérence cellulaire, diminution des expressions de l’E-cadhérine et de la β-caténine, augmentation des expressions de la vimentine, de la N-cadhérine et des facteurs de transciption SNAIL, SLUG, ZEB1 et TWIST.167 Ces augmentations de la mobilité et de l’invasion sont associées à un niveau élevé de TGFβ stimulant la production d’IL-6 et activant la voie JAK-STAT de manière autocrine. Ce mécanisme de résistance pourrait impliquer les augmentations de NOTCH1, de MET ou encore celle d’AXL comme démontré dans plusieurs lignées cellulaires ainsi que dans des modèles murins.145 L’évaluation de ce changement phénotypique n’étant pas réalisée en pratique courante, son importance est donc sous-évaluée.168 Des séquençages génomes entiers de plusieurs lignées cellulaires dérivées de patients progressant sous ITK-EGFR ont identifié FGFR1 comme le médiateur le plus important de cette résistance. Les inhibitions combinées de Billaud Amandine | Analyse moléculaire, enjeux et limites des thérapies ciblées en oncologie l’EGFR et de FGFR suppriment cette résistance acquise dans un modèle de xénogreffes murines.168 Le microenvironnement est également acteur de cette EMT comme démontré lors de co-cultures avec des CAF (Cancer-associated fibroblast) favorisant la résistance par sécrétion de facteurs solubles tels que HGF, TGBα, HB-EGF ou encore GAS6. L’hypoxie et la production de HIF1 associée contribuent de même à cette résistance.140
L’ensemble des mécanismes impliqués dans la résistance au traitement d’un patient démontre la difficulté à identifier le traitement secondaire le plus adapté. (Figure 6) La cooccurrence de certains de ces mécanismes complexifie d’autant plus ce choix. Encore aujourd’hui, et malgré les progrès considérables de ces dernières années, 15 à 20% de ces résistance acquise demeurent d’origine inconnue. D’autre part, plus de 50% sont des résistances intervenant sur la cible même de l’ITK. Face à l’apparition de ces mutations secondaires, un ITK de 3ième génération est à présent sur le marché. Cependant, lui aussi favorise l’apparition d’une résistance acquise lors d’une exposition continue.
Résistance acquise aux ITK de troisième génération
La disponibilité de cet ITK-EGFR de troisième génération (Osimertinib) étant récente, les études concernant la résistance acquise à cette thérapie sont moins nombreuses. Il est par ailleurs trop tôt pour savoir si les études cliniques vont rejoindre les prédictions des études précliniques.169 Nous savons cependant que la résistance acquise mise en place va alors dépendre de trois paramètres : la nature de la mutation de sensibilité de l’EGFR, la présence ou non de la mutation de résistance p.Thr790Met et l’identité de la mutation tertiaire concourant à cette résistance.
Ce traitement a, dans un premier temps, été administré lors des rechutes sous ITK-EGFR de première génération, en présence de la p.Thr790Met. Une première étude de la résistance acquise suivant son administration conduite chez 15 patients a permis d’identifier la mutation de résistance p.Cys797Ser de l’EGFR chez 6 d’entre eux.170 Pour 4 patients, la p.Thr790Met n’était plus détectée lors de la rechute, la mutation primaire étant toujours identifiée dans tous les cas. Ce variant est localisé précisément au niveau du site de liaison covalente de l’inhibiteur, diminuant son affinité de fixation.169 Les cellules résistantes deviennent alors des triples mutants de l’EGFR, résistantes à tous les ITK-EGFR disponibles, en particulier si les mutations sont localisées sur le même allèle.142 Une autre étude forçant cette résistance acquise par une exposition continue au Rociletinib (ITK-EGFR de troisième génération) après une exposition à un agent mutagène insérant des mutations ponctuelles de manière aléatoire a caractérisé deux nouvelles mutations de résistance de l’EGFR, p.Leu718Gln et p.Leu844Val, ainsi que le variant p.Cys797Ser déjà mentionné.171 Les variants p.Gly796Ser et p.Gly796Arg ont également été rapportés comme favorisant une résistance acquise, ils sont localisés au niveau des régions hydrophobiques proches du lieu de fixation de l’inhibiteur. Cependant, certains variants peuvent favoriser une résistance acquise aux ITK de troisième génération mais être sensibles aux ITK de première génération complexifiant à nouveau la décision thérapeutique, des combinaisons peuvent alors être envisagées.169
De nouveaux essais cliniques ont depuis démontré que l’apparition de la résistance acquise suite à une exposition à l’Osimertinib en première ligne apparaît plus tardivement qu’avec le Gefitinib ou l’Erlotinib (18.9 mois vs 10.2 mois). Cette thérapie est donc à présent administrée en première ligne.91 Les mécanismes de résistance commencent donc tout juste à être caractérisés et diffèrent cependant de ceux identifiés lors de l’administration du traitement en seconde ligne.172 (Tableau 3) Comme attendu, aucun variant p.Thr790Met n’a alors été détecté.
Un ITK-EGFR de quatrième génération (EI045) est actuellement en cours de développement, il est efficace contre ces triples mutants lorsqu’il est combiné au Cetuximab (ciblant la partie extracellulaire du récepteur).175 A nouveau, certains des mécanismes de résistance acquise décrits apparaissent simultanément, ils sont beaucoup plus hétérogènes et la majorité demeure d’origine inconnue.
Malgré les progrès cliniques considérables, les thérapies ciblées de manière générale disposent encore de perspectives d’évolutions considérables. Une amélioration de la détection des biomarqueurs afin de pouvoir définir le traitement le plus adapté ou d’identifier la résistance de manière plus précoce est primordiale. Les mécanismes de résistance acquise et leur importante hétérogénéité en sont l’autre versant avec pour objectif une meilleure identification ouvrant sur de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le patient. Les inhibiteurs de tyrosine kinase ciblant spécifiquement l’EGFR dans les CBNPC constituent un exemple type de ces enjeux thérapeutiques et font l’objet de la première partie de ces travaux de thèse.
Létalité synthétique, prescription des inhibiteurs de PARP dans les cancers ovariens
BRCA1 et BRCA2 dans les cancers de l’ovaire
HGSOC et mutations de BRCA1/2
Généralités sur le cancer de l’ovaire
De par son développement asymptomatique, le cancer de l’ovaire est le cancer d’ordre gynécologique le plus mortel, avec 295 414 nouveaux cas en 2018 dans le monde (4500 à 4800 femmes en France) pour 184 799 décès.2,176 Il est diagnostiqué tardivement chez 75% des patientes en raison des difficultés de détection et de contrôle, 70% vont ainsi rechuter dans les 3 années qui suivent le premier traitement. En conséquence, la survie nette à 5 ans est de 46%.2,176,177 Les cancers ovariens d’origines épithéliaux regroupent des sous-types histologiques distincts présentant des caractéristiques génomiques différentes. En 2017, Wang et son équipe les classifient d’ailleurs en fonction des types de dommages de l’ADN et donc des signatures mutationnelles qui y sont retrouvées.62 (Figure 8)
La majorité des cancers de l’ovaire (70%) sont des cancers ovariens séreux de haut grade ou HGSOC (high grade serous ovarian cancer), que nous développerons par la suite. Les autres sous-types tels que les endométrioïdes (ENOC – 20%), les mucineux et les cancers ovariens à cellules claires sont le plus souvent résistants à la chimiothérapie et associés à la présence de mutations oncogéniques également retrouvées dans d’autres localisations tumorales (ARID1A, PTEN, KRAS, CTNNB1, PIK3CA…).
Dans 15% des cancers ovariens, des mutations d’origines héréditaires accroissent le risque de développement tumoral.178 Deux types de gènes en sont principalement responsables : les gènes BRCA1 et BRCA2 (75%) et les gènes de réparation des mésappariements ou MMR (25%).176 Les mutations de BRCA1/2 sont largement associées aux HGSOC tandis que les dysfonctionnements du MMR sont préférentiellement retrouvés dans les endométrioïdes.
Profil mutationnel des HGSOC
Le cancer ovarien séreux de haut grade est le sous-type le plus commun. Dans la plupart des cas, il est associé à un Ki67 élevé et une chimio-sensibilité malgré le mauvais pronostic (Figure 9). D’autre part, la perte du suppresseur de tumeur TP53 semble être un événement précoce majeur de leur développement puisque 96% sont mutées.176,177 Ces caractéristiques leur confèrent une certaine homologie avec les cancers du sein triples négatifs. Malgré l’absence de driver oncogénique clairement établi, la mutation de TP53 est suivie de différents processus mutationnels générant une tumeur génétiquement instable avec peu de drivers et quelques altérations du nombre de copies, évoluant dans le temps mais aussi avec les différentes lignes de traitement.
En 2011, Bell et son équipe réalisent une analyse des ARNm, des microRNA, de la méthylation de promoteurs de 489 HGSOC et les exomes de 316 d’entre eux.177 Cette étude conséquente va permettre d’établir le profil mutationnel de ce sous-type ovarien et confirme les divergences avec les autres sous-types mentionnées plus tôt. Des mutations de TP53 ont alors été retrouvées dans 96% des tumeurs, 9 gènes présentaient des mutations somatiques récurrentes (NF1, BRCA1, BRCA2, RB1, CDK12…), 113 gènes avaient des altérations du nombre de copies et 168 présentaient des hyperméthylations de leur promoteur. Enfin, plus de 50% de ces HGSOC étaient également associés à une recombinaison homologue déficiente. Cette dernière fréquence a depuis été confirmée à plusieurs reprises, notamment dans une cohorte de 500 tumeurs d’adénocarcinomes ovariens de haut grade dont 25.7% étaient liés à des altérations germinales ou somatiques de 13 gènes impliqués dans cette voie de réparation de l’ADN.179,180 Puis, en 2019, ces chiffres ont été associés à une classification des HGSOC d’un point de vue moléculaire les divisant en quatre : mésenchymateux, immunitaire, différencié ou prolifératif.176 Mis à part ces cancers RH déficients, certaines voies de signalisations sont également communément altérées et semblent de bonnes cibles thérapeutiques : RB, RAS/PI3K, FOXM1 et NOTCH.
La recombinaison homologue déficiente chez un HGSOC sur deux peut résulter de différentes altérations, dont 33% concernent BRCA1 ou BRCA2. (Figure 9) Les 17% restants sont liés à des perturbations d’autres gènes de la recombinaison homologue (RAD51C, RAD51D, BRIP1, BARD1, PALB2, ATM…). Concernant, les altérations des suppresseurs de tumeur BRCA1 et BRCA2, 15% des HGSOC présentent des mutations constitutionnelles, 5-7% des mutations somatiques et 11 à 13% une inhibition épigénétique.177 La prévalence de ces mutations d’origine héréditaire peut également varier avec l’origine ethnique, ainsi cette fréquence est plus élevée dans les populations juives ashkénazes et à moindre titre dans les populations Norvégiennes, Danoises, Islandaises et Canadiennes. D’autre part, bien que ces fréquences soient identiques entre les populations de l’Ouest de l’Europe et Chinoises, les spectres mutationnels quant à eux varient.181 Ces mutations germinales n’affectent qu’un seul des deux gènes simultanément et sont héritées de manière autosomique dominante.
Mutations germinales de BRCA1 et BRCA2
Dès 2002, les implications de BRCA1 et BRCA2 dans la tumorigénèse sont bien connues, la présence d’une mutation germinale pathogène élevant le risque d’avoir un cancer du sein avant 70 ans à 85%.182 L’instabilité génétique générée par leur perte est étudiée, notamment au niveau de la structure des chromosomes.183 Plus récemment, des études ont également prouvé que des mutations de ces gènes prédisposent aux cancers de l’ovaire, de la prostate, du pancréas ou encore de l’estomac et du larynx. Ainsi, tandis qu’environ 1.3% des femmes ont un risque de développer un cancer de l’ovaire, ce chiffre passe à environ 40 à 60% en présence d’une mutation de BRCA1 et 11 à 27% pour BRCA2.180,181 Avec des mutations de BRCA2, le risque relatif est multiplié par 20 dans la prostate (risque de développement d’un cancer de la prostate en présence d’une mutation de BRCA2 de 0.1%) et par 10 dans le pancréas (0.5%).184 D’autre part, bien que toutes deux prédisposent à la tumorigénèse, les mutations de BRCA1 et BRCA2 n’ont pas les mêmes conséquences, des différences étant observées au niveau de la localisation tissulaire, du sexe de la personne ou encore de la pénétrance de la maladie. Cette prédisposition majoritairement dans les cancers du sein et de l’ovaire est probablement liée aux forts signaux prolifératifs hormonaux que subissent les cellules au cours des cycles menstruels. Par ailleurs, les cellules mutées BRCA1 présentent également fréquemment une déficience en récepteur à l’estrogène (ER). Une autre théorie à cette prédisposition met en cause les ROS surexprimées suite aux variations hormonales au cours des cycles menstruels, ces ROS causeraient des dommages de l’ADN et la génération d’un stress réplicatif non pris en charge en raison de la perte de BRCA1 ou 2.185
De par cette hérédité, le statut BRCA1/2 des patientes devient un enjeu thérapeutique et théranostique majeur avec une réelle valeur pronostique. Leurs évaluations génétiques sont essentielles pour la prise en charge du risque, l’administration du traitement et la prévention pour la patiente elle-même mais aussi pour ses apparentés. Suite à des consultations oncogénétiques, les femmes porteuses de mutations germinales de BRCA1 ou 2 se voient donc proposer des chirurgies prophylactiques (salpingo-ovariectomie bilatérale) pour réduire le risque de développement tumoral.176,177
Une perte d’hétérozygotie essentielle ?
BRCA1 et BRCA2 sont des suppresseurs de tumeurs, une perte de fonction des deux allèles est donc attendue afin de faciliter le développement tumoral. Ainsi, en parallèle de la mutation de BRCA1 ou BRCA2 (somatique ou constitutionnelle), une perte de l’allèle sauvage appelée aussi perte d’hétérozygotie (LOH) a initialement été reportée. Cependant, ce paradigme a récemment été remis en question. Tandis que la perte des deux allèles de BRCA1, BRCA2 ou RAD51 est létale, certaines études ont pu mettre en évidence que des souris Brca1+/- et Brca2+/- n’avaient pas d’augmentation de la tumorigénèse par rapport à des souris WT.186,187 Pourtant, dans les souris Brca1+/- Trp53+/- une légère augmentation des carcinomes mammaires était observée par comparaison aux souris Trp53+/-. L’ensemble des tumeurs présentaient un maintien du niveau d’expression de BRCA1 écartant l’hypothèse d’un silencing épigénétique. Des résultats similaires ont été observés avec BRCA2.186,188,189 De même, une étude conduite sur 30 patientes atteintes de cancers du sein mutés BRCA1/2 n’a pu mettre en évidence une perte d’hétérozygotie chez seulement 18 patientes.190 Cependant, une seconde étude fait état de 80 LOH sur 90 cas de tumeurs mammaires présentant des mutations de BRCA1/2 ou hyperméthylation de BRCA1.22 Il faut cependant garder à l’esprit la méthode d’analyse de la LOH dans le tissu tumoral car une faible contamination d’allèle WT provenant du tissu sain est envisageable. Ces différents arguments prouvent que la LOH ne serait donc pas indispensable à la tumorigénèse des HGSOC mutés BRCA1/2, sa significativité en tant que biomarqueur serait quant à elle discutable.
Le statut de TP53 semble lui jouer un rôle crucial. Muté dans 50% des cancers, cette fréquence est beaucoup plus élevée dans les tumeurs mutées BRCA1/2. De nombreuses études suggèrent une coopération entre la perte de TP53 et BRCA1/2. Certaines mutations de TP53 y sont par ailleurs particulièrement associées tels que p.Thr150Ile, p.Gly199Arg et p.Arg202Ser. Les cellules tumorales conservent alors leurs activités de transactivation des points de contrôles et pro-apoptotiques mais ne parviennent plus à contrer leur transformation.191 De même, la perte d’ATM et de CHK2, agissant dans la même voie de signalisation que TP53, favorisent le développement tumoral chez les souris mutées BRCA1 mais de façon moins importante. D’autre part, les pertes simultanées de RB1 sont associées à un bon pronostic.192 Ainsi, la cooccurrence avec certaines mutations semble à la fois indispensable au développement tumoral et pourrait avoir une valeur prédictive.
Rôles de BRCA1 et BRCA2
Localisés sur deux chromosomes différents, les suppresseurs de tumeurs BRCA1 et BRCA2 (Breast Cancer Associated Genes) sont deux grands gènes d’environ 70kb, riches en séquences répétées. Ne possédant pas d’orthologue chez la levure, ils sont donc apparus tardivement au cours de l’évolution avec un rôle fondamental chez le mammifère.183 Bien que ces deux protéines soient toutes deux centrales dans la réparation des cassures doubles brins de l’ADN par recombinaison homologue, elles n’ont pas d’activité redondante et ont d’ailleurs très peu d’homologie entre elles.181
Recombinaison homologue : mécanismes et implications de BRCA1/2
La recombinaison homologue permet la réparation des cassures doubles brins (CDB) de l’ADN qui peuvent apparaître suite à la réplication, l’exposition à des radiations ionisantes ou encore à d’autres composants génotoxiques. Les cassures simples brins (CSB) peuvent également être converties en cassures doubles brins au cours de la réplication. Découverte dès le milieu des années 90 et quantifiée lors de la découverte de Rad51 chez la souris, la RH est essentielle au maintien de l’intégrité du génome.193,194 Ainsi, une séquence d’ADN homologue intervient pour guider la réparation avec une haute fidélité : c’est un mécanisme conservateur des cellules proliférantes. Elle intervient donc pendant les phases S tardives et G2 du cycle cellulaire, ce qui est d’ailleurs une différence majeure avec la NHEJ qui peut intervenir à tout moment.184,195 Cette dernière est non conservatrice et va fusionner les extrémités des CDB sans tenir compte de la séquence homologue conduisant à l’apparition d’insertions ou de délétions de matériel génétique. Certaines de ces mutations peuvent alors promouvoir le développement tumoral expliquant la prédisposition à la carcinogénèse en cas de mutations germinales de BRCA1/2195. En effet, lors d’un défaut des protéines impliquées dans la RH, la NHEJ prend le relais. De même, la RH est augmentée lorsqu’un des composants de la NHEJ est muté. Il s’agit donc d’une compétition réelle entre ces deuxmécanismes de réparation, la liaison des composants de la NHEJ à l’ADN empêchant la résection nécessaire à la RH. Cette RH est également contrôlée par l’intermédiaire de ses cibles pendant les différentes phases du cycle cellulaire. Cette régulation est effectuée par les CDK ou encore par l’hélicase B qui supprime la résection pendant la phase G1, PALB2 est dégradée par le protéasome au cours de cette phase du cycle. Enfin, l’état de la chromatine au cours de la phase S peut également être impliqué.199
La première étape de la RH comprend la coupure puis la résection des extrémités de la CDB. (Figure 10, étapes 1 et 2) Celle-ci est réalisée par le complexe MRN (composé de MRE11, RAD50 et NBS1) servant d’échafaudage à l’activation d’ATM. Brièvement, l’activité endonucléasique de MRE11 coupe l’ADN jusqu’à 300nt en amont de la cassure et son activité 3’-5’ exonucléasique forme un ADN simple brin (ADNsb) en 5’ avant de promouvoir le recrutement des hétérotrimères Replication Protein A (RPA1, RPA2 et RPA3) au niveau du site CDB. La présence de l’endonucléase CtBP Interacting protein (CtIP) appelée aussi RBBP8 est nécessaire à l’activité de MRE11. Puis, l’exonucléase EXO1 dont l’activité est stimulée par l’hélicase BLM, digère le brin 5’ afin de former la queue en 3’ d’ADNsb. A nouveau, des RPA sont recrutés sur le site pour maintenir l’ouverture des structures secondaires de l’ADN. MRE11 et CtIP sont des cibles de la phosphorylation par les CDK, limitant ainsi la résection aux phases S et G2 du cycle cellulaire.200 A l’issue de cette étape, l’ADNsb formé est essentiel à l’invasion par RAD51, il est lui aussi protégé par des RPA.
La seconde étape majeure de ce mécanisme de réparation comprend la formation du filament nucléoprotéique, structure dynamique composée de RAD51, une ATPase DNA-dependant, et de l’ADNsb précédemment formé.201,202 (Figure 10, étapes 3 et 4) Les RPA permettent dans un premier temps d’empêcher la fixation de RAD51 sur l’ADNsb car des cofacteurs (parmi lesquels BRCA2, PALB2, BRCA1-BARD1) sont nécessaires au préalable. Puis, une fois le filament nucléoprotéique formé, RAD51 catalyse l’étape biochimique cruciale de la RH : l’invasion du duplex homologue par l’ADNsb. (Figure 10, étape 5) Si la complémentarité entre l’ADNsb et l’homologue est suffisante, la synapse est stabilisée et le brin non lié est déplacé formant la D-loop (displacement loop), un complexe synaptique supportant la formation d’une hélice intermédiaire à trois ADN.199,200 Le duplex homologue envahit, appelé aussi duplex donneur, sert de modèle pour la réparation.
Différentes recombinaisons homologues interviennent finalement, en fonction du devenir de la synapse formée par RAD51. (Figure 10) La seconde extrémité de l’ADN est, en effet, soit dissoute par l’hélicase BLM pour former un non-crossover (pas de changement d’information génétique), soit capturée pour former les jonctions de Holliday conduisant à un crossover. Puis, une DNA polymérase (principalement Polδ) est recrutée à l’extrémité 3’ du brin invasif utilisant le brin homologue comme modèle. Finalement, le duplex ADN néoformé est dissocié par une ATP hydrolase.200
La SDSA (synthetic dependant strand annealing) est majoritairement utilisée, l’invasion de duplex dirigée par RAD51 est alors effectuée avec seulement une des deux extrémités de la CDB tandis que la résection de l’autre est effectuée mais reste passive, la terminaison par liaison au brin naissant est alors facilitée. C’est un non-crossover. La classique RH est majoritaire lors de la méiose permettant la génération de cellules germinales haploïdes, un crossover a lieu suite à la formation de jonction de Holliday. La fidélité de la RH va entièrement dépendre du brin donneur homologue servant de modèle lors de la réparation. Il peut s’agir du chromatide sœur, la restauration sera alors complète, ou du chromosome homologue. Dans ce dernier cas, une perte d’hétérozygotie peut être observée car l’information du chromosome homologue est copiée au détriment de celle du chromosome parental. Cependant, cela reste moins fréquent en raison de la proximité, de la similarité des séquences et de la cohésion physique.199 La RH inter-homologue est responsable de certains développements tumoraux comme les rétinoblastomes héréditaires où elle conduit à la perte de RB1 WT dans 40% des tumeurs même si, le plus souvent, la NHEJ reste responsable des réarrangements chromosomiques.
La présence de mutations de BRCA1 ou 2 est tout à fait caractéristique d’une déficience de la recombinaison homologue. Sont retrouvées une instabilité chromosomique spontanée avec induction de dommages, une absence de formation de foci RAD51, une sensibilité aux radiations ionisantes, une sensibilité ICL sévère ou encore une anormalité des centrosomes.186 Mais, alors qu’une augmentation de la NHEJ est observée en parallèle des mutations de BRCA1, ce n’est pas le cas avec BRCA2 soulignant leurs rôles différents. BRCA1 est donc impliqué plus précocement dans la voie de la recombinaison homologue.
BRCA1, médiateur de la recombinaison homologue et autres rôles multiples
Localisée au niveau du chromosome 17 (17q21), les 22 exons de BRCA1 codent pour une protéine pléïotropique de 1863 acides aminés. Fondamentale dans le processus de recombinaison homologue, elle joue le rôle de médiateur liant senseurs et effecteurs de la réparation des CDB et intervient donc aux différentes phases du processus. Cependant, cette protéine aux rôles multiples interagit également avec des suppresseurs de tumeur, des protéines de la réparation, des régulateurs du cycle et de la transcription à travers ses différents domaines et partenaires protéiques (Figure 11).
Les mutations de BRCA1 sont principalement localisées au niveau de ses domaines RING et BRCT où elles vont le plus impacter sa fonctionnalité. Le domaine RING, impliqué dans l’ubiquitinylation des protéines, contient une E3 ubiquitine ligase, c’est à ce niveau que va s’associer la protéine BARD1 catalysant cette activité.184,203 L’hétérodimère formé contrôle la duplication des centrosomes en régulant l’ubiquitination des gamma-tubuline204 et joue un rôle dans la vitesse de progression de la fourche de réplication.205 L’activité du complexe peut être inhibée par BAP1. Enfin, ce complexe BRCA1-BARD1 est impliqué dans l’activation du point de contrôle G1/S du cycle cellulaire. En effet, BRCA1 facilite la phosphorylation de p53 sur la sérine 15 nécessaire à la transcription de l’inhibiteur de CDK, p21.184 Une étude de l’impact fonctionnel d’un variant de ce domaine dans un modèle murin a permis de confirmer cette fonction.186 En effet, le variant C61G de BRCA1 empêche l’hétérodimérisation avec BARD1 mais n’altère pas la RH, ce qui reste suffisant pour favoriser une sensibilité aux inhibiteurs de PARP.
BRCA1 comprend également deux domaines BRCT en C-terminal placés en tandem. Ils sont composés de répétitions d’environ 90 AA favorisant l’interaction avec des protéines phosphorylées au niveau des sérines du motif SXXF par ATM. Ainsi, BRCA1 va pouvoir se lier à différentes protéines formant des complexes distincts avec des rôles propres :
– Complexe BRCA1A : Abraxas se lie directement au domaine BRCT permettant le recrutement de RAP80, lui-même associé aux histones H2AX polyubiquitinylés. Ce complexe permet le recrutement de BRCA1 au niveau des sites de dommages. Le complexe BRCA1-Abraxas-RAP80 est également impliqué dans la régulation du point de contrôle G2/M activé suite à des dommages de l’ADN par radiation ionisantes.184 Ils assurent une inhibition transitoire de l’entrée en mitose afin d’éviter une ségrégation aberrante des chromosomes.203 En effet, les cellules ayant perdu Abraxas ou RAP80 n’ont plus d’accumulation de BRCA1 au niveau des sites de dommages ainsi qu’une perte du point de contrôle G2/M du cycle cellulaire.206
– Complexe BRCA1B : La DNA hélicase BRIP1 se lie également au domaine BRCT suite à sa phosphorylation, elle permet de dérouler l’ADN en déplaçant les protéines du site endommagé. Un excès de BRIP1 peut également inhiber la formation de la D-loop. Ce complexe BRCA1-BRIP1-TOPBP1 est nécessaire au point de contrôle de la phase S en réponse à un blocage ou un arrêt de la fourche de réplication.
– Complexe BRCA1-C : CtIP phosphorylé par les CDK se lie au domaine BRCT pour permettre la résection des extrémités de la CDB. Cette résection CtIP-dépendante a lieu pendant les phases S et G2, promeut le RH et inhibe la NHEJ. Le complexe BRCA1-CtIP- MRN joue un rôle essentiel dans la détection des dommages et l’activation de la voie ATM-ATR, importante pour le point de contrôle G2/M.
D’autre part, le domaine SCD (SQ/TQ cluster domain) de BRCA1 comprend une dizaine de sites pouvant être phosphorylés par ATM. BRCA1 comprend finalement un quatrième domaine d’interaction présent en amont des répétitions BRCT, le domaine superhélicoïdal (coiled-coil), permettant son association à PALB2. PALB2 fait ainsi le lien entre BRCA1 et BRCA2. Phosphorylée par ATM/ATR, BRCA1 régule à son tour la phosphorylation de différentes protéines de cette voie telles que p53, NBS1, Chk1 et Chk2.203 Ces phosphorylations sont différentes selon les stress subis par la cellule prouvant l’implication de BRCA1 dans des voies bien distinctes en fonction de ses partenaires protéiques.
BRCA2 : effecteur de la recombinaison homologue
Le gène de BRCA2, localisé au niveau du chromosome 13 (13q12.3), comprend 27 exons et code pour une protéine de 3418 AA. Il possède plusieurs domaines qui assurent principalement sa liaison à RAD51 et à l’ADN.184,207 (Figure 12) BRCA2 est, en effet, un médiateur de la formation du filament nucléoprotéique essentiel à sa fonction prédominante, la recombinaison homologue. Ainsi, les cellules déficientes en BRCA2 ne peuvent plus recruter RAD51.208 Le second rôle de BRCA2 est au niveau de la protection de la fourche de réplication. Le variant p.Ser3291Ala de BRCA2 ne perturbe pas la recombinaison homologue mais va induire un défaut de protection de la fourche de réplication, favorisant une sensibilité aux inhibiteurs de PARP.209
Au centre, BRCA2 comprend 8 domaines répétés comprenant une trentaine d’acides aminés appelés BRC 1 à 8. Ces derniers présentent tout de même quelques distinctions, ce qui explique leurs affinités d’association différentes avec RAD51. Un seul d’entre eux permet la formation du filament nucléoprotéique en présence d’ATP, en maintenant la forme active de la liaison RAD51-ADNsb. Certains vont accélérer le déplacement des RPA par RAD51 et tous vont stimuler l’invasion et l’échange de brin indispensable à la RH.207 BRCA2 possède également un domaine carboxy-terminal qui, après avoir facilité le recrutement de RAD51 au niveau des ADNsb suite à la résection des extrémités, permet de stabiliser le filament nucléoprotéique.210 D’autre part, BRCA2 comprend plusieurs domaines de liaison à l’ADN (DBD) non indispensable à la RH : une α-hélice, 3 domaines OB de liaison aux oligonucléotides et un tower domain (TD) liant l’ADN double brin.
Enfin, BRCA2 comprend un domaine d’interaction avec PALB2 situé en N-terminal, permettant le lien physique entre BRCA1 et BRCA2. Cette interaction semble être dépendante d’une phosphorylation préalable par Chk2 au niveau de la sérine 988 de BRCA1. Des mutations de cet acide aminé induisent une déficience en RH mais la régulation des points de contrôles mitotique est conservée favorisant une résistance aux radiations ionisantes et soulignant la complexité de la régulation et les rôles multiples que peuvent jouer ces protéines.
Le Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2 (CIMBA) sur plus de 31 000 mutations de ces gènes a confirmé l’augmentation du risque de développement de cancer et son lien avec la position et le type de mutation. Les rôles primordiaux de ces protéines pour l’intégrité du génome expliquent leurs fréquentes altérations en cancérologie. Récemment, des progrès thérapeutiques considérables ciblant les variants pathogènes de BRCA1/2 ont été réalisés grâce au développement des iPARP.
iPARP : mécanismes d’action et mise au point des inhibiteurs
L’apparition des inhibiteurs de PARP fait suite à l’application du concept de létalité synthétique, mentionné précédemment. Dans ce contexte, c’est l’inhibition conjointe de la recombinaison homologue (mutations BRCA1 ou BRCA2) et des protéines PARP par l’intermédiaire des iPARP. Afin de mieux comprendre le mécanisme d’action de ces traitements, nous commencerons par détailler le rôle des protéines qu’ils ciblent.
Rôles des membres de la famille PARP
L’ensemble des inhibiteurs actuels ciblent au moins la protéine PARP1, une abondante protéine nucléaire. Cependant, il existe 17 enzymes PARP distinctes identifiées sur les bases de leur homologie avec PARP1. Elles sont donc divisées en 4 sous-familles en fonction de leur architecture : les DNA-dependant PARP (PARP1, 2, 3), les tankyrases, les CCCH (Cys-Cys-Cys-His) et les macro-PARP.211 Seuls PARP 1 à 3 vont jouer un rôle dans la réparation par excision de base (BER) et vont donc nous intéresser ici.212
La PARylation, actrice de la signalisation cellulaire
L’activité des membres de la famille PARP est étroitement liée à celle de la signalisation cellulaire. Ce sont des ADP-ribosyl transferase transmettant un groupe ADP-ribose négativement chargé d’un donneur NAD+ vers les résidus Glu, Asp ou Lys de la protéine cible : c’est la PARylation. Cette activité est permise par un domaine catalytique comprenant 3 résidus : His-Tyr-Glu. Tous les membres de la famille PARP ne possèdent pas cette activité et certains fonctionnent plutôt comme des monoADP-ribose transférases.211 La PARylation des protéines permet une adaptation rapide au stress par trois grands types de régulations : l’inhibition des interactions protéine-protéine ou protéine-acide nucléique, la régulation de la localisation des protéines ou la promotion de leurs interactions et enfin la régulation de l’ubiquitinylation. Elle intervient ainsi dans de nombreux processus cellulaires tels que la réparation de l’ADN, la régulation transcriptionnelle, l’interférence ARN, les fonctions mitochondriales ou encore les divisions cellulaires. Cette implication directe de la PARylation dans la biologie cellulaire suppose une destruction catabolique rapide et coordonnée des résidus PAR. Ainsi, des protéines, les PARG (polyADP-ribose glycohydrolase) et les ARH (ADP-ribosyl hydrolase), les dégradent presque immédiatement après leur synthèse.211
Les modifications post-traductionnelles peuvent également altérer et réguler l’activité des membres de la famille PARP en influant sur la reconnaissance de leurs cibles. D’ailleurs, cette interaction reste encore très méconnue, l’architecture du domaine d’interaction de chaque membre est probablement importante. En ce qui concerne PARP1 et ses partenaires, le domaine BRCT de BRCA1 se liant aux phosphoprotéines dirige leurs interactions.211 D’autre part, la PARylation du domaine BRCT de BRCA1 par l’intermédiaire de RAP80 est un préalable à la RH puisqu’elle permet l’association avec Abraxas et la formation du complexe BRCA1A.213 La perte de cette régulation va favoriser une RH excessive, une instabilité génétique et la tumorigénèse.
A ce jour, ce sont surtout les fonctions de PARP1, PARP2 et des tankyrases qui ont été caractérisées et ce majoritairement de par leur rôle dans la réparation des cassures simples brins de l’ADN.
Rôle capital de PARP dans la réparation des CSB
PARP1 et PARP2 possèdent un domaine de liaison à l’ADN, comprenant 3 motifs zinc-finger, qui leur permettent la reconnaissance de structures secondaires de l’ADN tels que les cassures simples et doubles brins, les structures cruciformes et les nucléosomes. La liaison de PARP1 à l’ADN entraine un changement de conformation de la protéine et une modulation de son site actif. Lors de la présence d’une CSB, l’accumulation de résidus chargés négativement par PARylation facilite le recrutement des effecteurs de la réparation.
Les implications de PARP1 et PARP2 dans la voie SSBR (Single-stranded break repair), une forme de BER, sont les plus connues. Ces protéines servent alors à la fois de senseurs et de transducteurs des signaux. PARP1 se lie à la cassure simple brin et initie le processus de détection à l’aide de son domaine en doigt de zinc. La protéine change alors de conformation et s’auto-PARyle avant de réaliser la PARylation de la zone endommagée pour faciliter le recrutement des effecteurs tels que XRCC1 et les histones H1 et H2B.214 Cependant, le rôle de PARP1 dans le BER est controversé. Ainsi, il a été démontré que PARP1 n’est pas indispensable au BER dans les cellules mais réduit le renouvellement de ses composants, les cellules non RH déficientes ne sont pas affectées par les iPARP. Les KO des principaux acteurs de la BER (APE1, Polβ ou XRCC1) chez la souris entrainent une létalité embryonnaire ce qui n’est pas le cas des souris PARP1-/-.216–218 D’autre part, tandis que la réparation par BER est très hautement conservée à travers l’évolution des espèces, ce n’est pas le cas des protéines PARP.
De manière intéressante, les inhibiteurs de PARP ont des effets totalement contraires à ceux observés lors de la déplétion de PARP1 par siRNA. En effet, ces iPARP vont bien inhiber la BER en piégeant les intermédiaires de la réparation sur l’ADN.215 Ainsi, lors de l’inhibition de l’activité des PARP, la réparation des cassures simples brins de l’ADN est bien évidemment compromise. Cependant, l’efficacité des inhibiteurs de PARP n’est pas seulement liée à leurs impacts sur les voies de réparation de l’ADN.
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Table des matières
INTRODUCTION
1. Instabilité génétique et hétérogénéité mutationnelle : le développement des thérapies ciblées
1.1. Instabilité génétique, cause et conséquence de la tumorigénèse
1.1.1. Caractéristiques essentielles de la cellule tumorale
a) Découverte des oncogènes et suppresseurs de tumeur
b) Acquisition séquentielle de différentes propriétés essentielles à la tumorigénèse
1.1.2. Origines de l’instabilité génétique tumorale
a) Agents mutagènes endogènes et exogènes
b) Mécanismes de réparation de l’ADN et cancers
1.2. L’instabilité génétique, actrice de l’hétérogénéité tumorale
1.2.1. Accumulation d’anomalies génétiques et diversité mutationnelle
a) Notion de drivers et de passengers
b) Principaux oncogènes et suppresseurs de tumeurs en oncologie solide
c) Autres types d’anomalies génétiques
1.2.2. Une hétérogénéité tumorale à la fois spatiale et temporelle
a) Sélection clonale et hétérogénéité intratumorale
b) Hétérogénéité intertumorale
c) Hétérogénéité spatiale et temporelle
1.3. Thérapies ciblées et évolution vers une médecine personnalisée
1.3.1. Emergence des thérapies ciblées
a) Notions d’oncogénétique et de médecine personnalisée
b) Début des thérapies ciblées et évolution
1.3.2. Addiction oncogénique et létalité synthétique : les thérapies ciblées reposent sur différents principes
a) Addiction oncogénique
b) Létalité synthétique
2. Addiction oncogénique et prescription des ITK dans les cancers du poumon non àpetites cellules
2.1. Cancers bronchiques et thérapies ciblées
2.1.1. Place des CBNPC et caractéristiques
a) Les cancers bronchiques, généralités et épidémiologie
b) Différents types de cancers bronchiques
c) Hétérogénéité mutationnelle des CBNPC
2.1.2. Thérapies ciblées dans les CBNPC
a) Explosion du paysage thérapeutique dans les CBNPC
b) Les inhibiteurs spécifiques de l’EGFR
2.2. ITK-EGFR : cibles et mécanismes d’action
2.2.1. Le récepteur au facteur de croissance épithélial
a) Structure du récepteur
b) Mécanisme d’activation du récepteur
c) Activation des voies de signalisation
d) Régulation de l’activation et renouvellement du récepteur
2.2.2. Les ITK-EGFR contre l’activation constitutive oncogénique
a) Activation constitutive et mutations activatrices
b) Sensibilité aux ITK-EGFR
2.3. Résistance acquise aux ITK-EGFR
2.3.1. Résistance innée ou acquise ?
a) Résistance primaire aux ITK-EGFR
b) Résistance acquise : sélection clonale ou nouvelles mutations ?
a) Mutations secondaires de l’EGFR
b) Surexpression du récepteur
2.3.3. Changement d’addiction oncogénique et résistance « off-target »
a) Amplifications et changements d’addiction oncogénique
b) Mutations ponctuelles et apparition de nouveaux drivers oncogéniques
c) Changement du phénotype des cellules
2.3.4. Résistance acquise aux ITK de troisième génération
3. Létalité synthétique, prescription des inhibiteurs de PARP dans les cancersovariens
3.1. BRCA1 et BRCA2 dans les cancers de l’ovaire
3.1.1. HGSOC et mutations de BRCA1/2
a) Généralités sur le cancer de l’ovaire
b) Profil mutationnel des HGSOC
c) Mutations germinales de BRCA1 et BRCA2
d) Une perte d’hétérozygotie essentielle ?
3.1.2. Rôles de BRCA1 et BRCA2
a) Recombinaison homologue : mécanismes et implications de BRCA1/2
b) BRCA1, médiateur de la recombinaison homologue et autres rôles multiples
c) BRCA2 : effecteur de la recombinaison homologue
3.2. iPARP : mécanismes d’action et mise au point des inhibiteurs
3.2.1. Rôles des membres de la famille PARP
a) La PARylation, actrice de la signalisation cellulaire
b) Rôle capital de PARP dans la réparation des CSB
c) Implication des PARP dans le contrôle de la fourche de réplication
3.2.2. Les iPARP en clinique, premières thérapies basées sur la létalité synthétique
a) Apparition des iPARP et mécanismes d’action
b) Les différentes molécules inhibitrices de PARP en clinique
3.3. Limites actuelles des iPARP et champs d’investigation
3.3.1. BRCAness : un challenge pour l’identification et le diagnostic
a) Définition de BRCAness
b) Hyperméthylation du promoteur de BRCA1
c) BRCAness par analyse moléculaire de gènes individuels
d) Signature transcriptionnelle et BRCAness
e) HRD et signature mutationnelle : une évolution rapide
f) Autres biomarqueurs fonctionnels de la recombinaison homologue
3.3.2. Mécanismes de résistance aux iPARP
a) Modification de la disponibilité du traitement
b) Reprise de l’activité de la recombinaison homologue
c) Diminution du piégeage de PARP1
d) Stabilisation de la fourche de réplication
3.3.3. VSI de BRCA1/2 : CRISPR-Cas9 pour la mise en place d’un test fonctionnel
a) VSI de BRCA1 et BRCA2
b) Méthodes actuelles de caractérisation fonctionnelle des VSI
c) Edition génomique via la technologie CRISPR-Cas9
OBJECTIFS DE LA THESE
RESULTATS
1. Amélioration de la détection des mutations de l’EGFR dans les CBNPC et nouveaux mécanismes de résistance acquise, étude des enjeux actuels des ITK-EGFR
Article 1: Caractérisation moléculaire de l’EGFR dans les cancers bronchiques non à petites cellules : étude prospective comparative des technologies NGS et automate Idylla.
1.1.1. Résultats de l’article 1
1.1.2. Discussion de l’article 1
1.1.3. Résultats de l’article 2
1.1.4. Discussion de l’article 2
Article 3 : TBK1, voie de résistance aux ITK-EGFR : vers une nouvelle combinaison thérapeutique dans les CBNPC
1.1.5. Résultats de l’article 3
1.1.6. Discussion de l’article 3
Conclusion générale de la partie 1
2. Caractérisation fonctionnelle des variants de signification inconnue de BRCA1/2 dans les cancers ovariens, vers une extension des indications thérapeutiques des iPARP
Article 4: Somatic mRNA analysis of BRCA1 splice variants provides a direct theranostic impact on PARP inhibitors
1.1.1. Résultats de l’article 4
1.1.2. Discussion de l’article 4
Article 5: Clinically applicable classification of variants of uncertain significance from essential tumor
suppressor genes by CRISPR-Cas9 genome editing
1.1.3. Résultats complémentaires
1.1.4. Résultats de l’article 5
1.1.5. Discussion de l’article 5
Conclusion générale de la partie 2
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
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