LES VOIES D’ENDOCYTOSE

LES VOIES D’ENDOCYTOSE

Protéines de l’endocytose médiée par la clathrine

La clathrine, FAP2 et la dynamine constituent les premières protéines mises en évidence et qui sont impliquées dans la formation des puits couverts de clathrine (McNiven et al. 2000a). Dans le but de mieux comprendre ce phénomène membranaire, des études se sont intéressées aux partenaires d’interaction de ces protéines et ont pu caractériser toute une série de protéines nouvelles impliquées dans les différentes étapes de l’endocytose médiée par les vésicules de clathrine (Puertollano 2004) (Figure 4). Certaines de ces protéines peuvent intervenir lors de la nucléation et le recrutement de la clathrine comme la synaptogamine, Pepsine, l’EpslS, l’adaptateur protéique 180 (AP180/CALM : Gathrinassembly lymphoid myeloid leukaemia protein), et l’amphiphysine. D’autres interviennent dans le recrutement de certains récepteurs membranaires spécifiques comme l’adaptateur AP180/CALM, HIP1/HIP1R et l’epsine qui interviennent dans l’intemalisation de la synaptobrevine, des récepteurs glutamate ou des protéines ubiquitinées, respectivement. L’epsine participe à l’invagination de la membrane à côté de la dynarnine, î’amphiphysine et l’endophiline interviennent également lors de la constriction et du détachement des vésicules de la membrane.

En plus de toutes ces protéines, l’actine joue aussi un rôle important dans l’assemblage, le détachement et la migration des vésicules vers les endosomes (Conner and Schmid 2003; Puertollano 2004; Yarar et al. 2005). De nouvelles protéines ont été découvertes récemment comme étant des protéines de l’endocytose (Blondeau et al. 2004; Borner et al. 2006). On distingue, Numb, ARH (Autosomal recessive hypercholesterolemia) et Dab2 (Disabled homolog 2) jouant le rôle d’adaptateur protéique (Schmid and McMahon 2007). La stonine est impliquée dans le recyclage des vésicules synaptiques (Maritzen et al. 2010). Les Necaps (adaptin-earbinding coat-associated protein) interagissent avec l’amphiphysine et I’AP2 (Ritter et al. 2003). La calpaïne appartenant à la famille des proteases à cystéine dépendante du calcium, régule l’endocytose médiée par la clathrine par protéolyse de plusieurs protéines endocytaires (Rudinskiy et al. 2009; Wu et al. 2007). Les protéines FCHoï/2 (Fer/Cip4 homology domain-only proteins 1 and 2) interagissent spécifiquement avec la membrane plasmique et recrutent l’AP2 par l’intermédiaire de l’Epsl5 et 1’intersectine (Henné et al. 2010). La protéine Sorting nexin9 (SNX9) est impliquée dans la déformation de la membrane via son domaine BAR. Cette protéine est régulée par N-WASP et la dynamine 2 (figure 4) (Shin et al. 2008).

La clathrine Découverte par Barbara Pearse (Pearse 1976), la clathrine est une protéine constituée de trois chaines lourdes associées par leur domaine C-terminal, chacune d’elle associée à une chaine légère. Cet assemblage est appelé « triskèle » (figure 5A). Grâce au domaine Hub, les branches des triskeles s’assemblent pour former une structure polyhédrale sous forme de cage (figure 4B) (Liu et al. 1995). La chaine lourde du triskèle est constituée d’un 10 alignement de sept domaines répétitifs CHCR (Clathrin Heavy Chain Repeat), chacun d’eux est composé de 146 résidus (Ybe et al. 1998). Le domaine N-terminal du triskèle, correspondant au domaine N-terminal de la chaine lourde, interagit avec plusieurs protéines dont API, ÂP2 et amphiphysine par le biais d’un motif consensus appelé « boite clathrine » (Benmerah 2002; Miele et al. 2004; ter Haar et aï. 1998).

Il existe deux formes de chaînes légères chez les mammifères, la chaîne légère a et la chaine légère b (CLa et CLb) tandis que chez la levure, une seule chaine a été mise en évidence (Silveîra et al. 1990). Les CLa et CLb se lient aux ions calcium et à la calmoduline (Lisanti et al. 1982; Mooibroek et al. 1987; Nathke et al. 1990). Les deux formes se lient aux domaines hub des triskèles et exercent une compétition pour le site de liaison à la chaine lourde. Elles régulent ainsi l’assemblage des triskèles (Kirchhausen et al. 1983; Ungewickell 1983; Ungewickell and Ungewickell 1991). La CLb peut être phosphorylée par la caséine kinase II (Bar-Zvi and Branton 1986; Hill et al. 1988). La chaine légère n’est pas nécessaire à la formation des cages de clathrine, toutefois elle stimule l’hydrolyse de l’ATP grâce à son interaction avec HSC70 lors du démantèlement de la clathrine (DeLuca-Flaherty et al. 1990; Schmid et al. 1984;Schmidetal. 1982).

Le complexe AP-2

Le complexe AP-2 représente l’adaptateur protéique présent à la membrane plasmique, constitué de deux grandes sous-unités d’environ 100 KDa, a et P2, et deux petites-sousunités u2 et a2 de 50KDa et 16KDa respectivement (Heuser and Keen 1988; Keen 1987) (figure 7). L’AP-2 fixe les récepteurs à intemaliser, via la sous-unité u2, par reconnaissance de séquences spécifiques dans leurs domaines cytoplasmiques. Ces déterminants constituent les signaux d’endocytose. Les plus communs sont les motifs tyrosine Yxx<3> (<P : résidus hydrophobe) qui se lient directement à la sous-unité ji2 (Collins et al. 2002; Ohno et al. 1995). Des études suggèrent que îes motifs DExxxLL se lient aux sous-unités pi ou p2 des complexes AP-1 ou AP-2 pour le recrutement des autres protéines de Fendocytose (Bresnahan et al. 1998; Dietrich et al 1997; Greenberg et aï. 1998; Rapoport et al. 1998). L’implication des motifs tyrosine NPxY ont été observés lors de Finternalisation des molécules LDL. Une simple mutation de la tyrosine au niveau de ces récepteurs entraine le blocage de l’intemalisation des molécules LDL, ce qui engendre le syndrome de Fhypercholestérolémie familiale (Davis et al. 1986). Toutefois, il existe un bon nombre de récepteurs qui peuvent être internalises par l’intermédiaire d’adaptateurs autres que F AP-2 tels les récepteurs couplés aux protéines G internalises par l’adaptateur P-arrestine (Ferguson et al. 1996; Pierce and Lefkowitz 2001).

L’AP-2 recrute la clathrine à la membrane plasmique et stimule l’assemblage des triskèles via la sous-unité p2. Ce complexe recrute également, par les sous-unités a2 et P25 des protéines accessoires nécessaires à la formation des vésicules (Galîusser and Kirchhausen 1993; Kirchhausen 2002; Schroder and Ungewickell 1991; Shih et al. 1995) (figure 7). Suite à fixation du complexe AP-2 à la membrane plasmique, la sous-unité u2 subit un changement de conformation afin d’exposer son site d’interaction au récepteur à intemaliser. Ce changement de conformation serait dû à une phosphorylation de la sous14 unité \û. au niveau de la thréonine 156 (Thr-156) par la kinase AAK1 associée à l’adaptateur. La clathrine constitue le facteur d’activation de cette kinase. II a été montré que l’AP2, dont la sous-unité u2 est phosphorylée, interagit spécifiquement avec la clathrine. Le degré de phosphorylation de ces sous-unités se trouve très réduit dans un modèle cellulaire où l’expression de la ciathrine est réprimée (Jackson et ai. 2003; Ricotta et al. 2002). L’AP2 est un élément essentiel à la formation des vésicules de clathrine, la suppression de son expression par des ARN interférants conduit à une baisse du nombre de vésicules de clathrine (Motley et al. 2003). Une perturbation de l’intemalisation des molécules LDL et un blocage d’autres molécules dépendantes de la clathrine ont été également observés (Boucrot et al. 2010).

L’auxiline

L’auxiline est une protéine spécifique du cerveau, elle se trouve enrichie au niveau des terminaisons nerveuses (Ahle and Ungewickell 1990). Cette protéine est constituée de plusieurs domaines (figure 11). Elle appartient à la famille des protéines à domaine J qui sont caractérisées par la présence d’un ensemble d’acide aminés (HPD : Histidine, Proline et Acide aspartique) constituant le site de liaison à HSC70 (Eisenberg and Greene 2007). L’auxiline s’associe également au complexe AP2 et à la vésicule de clathrine peu avant sa séparation de la membrane par l’intermédiaire de la dynamine et par cette interaction elle recrute HSC70 au niveau de la vésicule de clathrine (Lee et al. 2006). En absence d’auxiline, le recyclage des vésicules synaptiques est altéré. Une accumulation des vésicules/puits de clathrine au niveau des terminaisons a été également observée. Cette dernière est causée par le non démantèlement des vésicules formées suite à l’absence d’auxiline (Yim et al. 2010). Dans les autres types cellulaires, le démantèlement s’opère grâce à la protéine GAK (Cyclin G-associated kinase) qui est l’homologue de l’auxiline (Greener et al. 2000).

Table des matières

RÉSUMÉ
TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ABRÉVIATIONS
INTRODUCTION
PERTINENCE ET OBJECTIFS DE L’ÉTUDE
CHAPITRE 1 LES VOIES D’ENDOCYTOSE .
1.1 Definition et rôles de l’endocytose
1.2. Différents types d’endocytose
1.2.1 Les voies d’endocytose indépendantes de laclathrine
1.2.2 Endocytose médiéepar la clathrine
1.3 Étapes de l’endocytose médiée par la clathrine
1.4 Protéines de l’endocytose médiée par la clathrine
1.4.1 Laclathrine
1.4.2 Les complexes protéiques AP
1.4.3 Le complexe AP-2
1.4.4 Ladynamine
1.4.5 Le cytosquelette d’actine
1.4.5.1 Structure et fonctions
1.4.5.2 Endocytose et cytosquelette d’actine
1.4.6 L’auxiline
1.4.7 I/HSC70
1.4.7.1 Origine et structure..
1.4.7.2 HSC70, l’auxiline et l’endocytose
1.4.8 La cortactine
1.4.9 HIP1,HIP1R et Sla2p
CHAPITRE 2 STRUCTURE ET FONCTIONS D’HIPÏ ET HIP1R
2.1 Structure et localisation cellulaire d’HIPl etHIPiR
2.2 Implication d’HIPî et d’HIPIR dans î’endocytose médiée par la clathrine
2.3 Récepteurs régulés par HIP1 ou par HIP1R
2.4 Autres rôles d’HIPl et HIP1R dans la cellule
CHAPITRE 3 MÉTHODOLOGIE DE LA RECHERCHE
3.1 Synthèse des domaines d’HIPIR nécessaires à l’étude
3.1.1 Technique du clonage moléculaire
3.2 Protéines de fusion GST-HIP1/R -domaine X
3.3 Technique dupulî-down
3.3.1 Production d’extrait protéique
3.3.2 Quantification des protéines par la méthode de Bradford
3.4 Technique de l’immunoblot
3.5 Technique de l’overîay
3.6 Cosédimentation avec l’aetine
3.7 Démantèlement des vésicules de clathrine
3.7.1 Purification de vésicules de clathrine.
3.7.2 Technique du démantèlement
3.8 Analyse statistique des résultats
CHAPITRE 4  RÉSULTATS ET INTERPRÉTATIONS
4.1 Synthèse des domaines à l’étude
4.1.1 Clonage des domaines GST-HIPIRC-terminaux
4.1.2 Expression des protéines de fusion des domaines GST-HIP1R domaine X
4.2 Résultat de la recherche de nouveaux partenaires d’interaction
4.2.1 Identification de nouveaux partenaires
4.2.2 Vérification, par immunoblot, de l’interaction directe : HSC7Q-HIP1R
4.2.3 Identification du site de liaison de HSC70 sur HIP1R-TALIN
4.3 Essai de sédimentation avec Factine
4.4 Essai de liaison du domaine TALIN KVK/DDD avec HSC70
4.5 Essai de dimérisation de deux domaines HIP1R-TALIN
4.5.1 Co-sédimentation du dimère THATCH d’HIPIR avec l’actine en présence d’HSC70
4.5.2 Essai de dimérisation des domaines C-terminaux de deux protéines HIP1R
4.6 HIP1R et le démantèlement des vésicules recouvertes de clathrine
CHAPITRE 5 DISCUSSION GÉNÉRALE DES RÉSULTATS
CONCLUSION
PERSPECTIVES
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE A Clonage des protéines à l’étude
ANNEXES Production de protéines de fusion GST sous différentes formes
ANNEXE C Protocole de production d’extrait de cerveau
ANNEXE D Protocole de sédimentation avec l’actine
ANNEXE E Protocole de démantèlement de vésicules de clathrine
ANNEXE Présentation des sites d’HIPIR TALIN potentiels à l’interaction avec HSC70

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