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Variabilité génétique des VIH:
Les VIH sont extrêmement variables génétiquement d’une souche à l’autre, cette variabilité n’est pas seulement limitée au génome, mais concerne également les propriétés biologiques (tropisme, effets cytopathogénes, réplication) [34].
Cette propriété lui permet de s’adapter au mieux à l’état de l’organisme infecté grâce à une sélection du ou des mutant(s) le(s) plus apte(s) à se multiplier. On observe ainsi l’apparition de virus résistants aux anticorps neutralisant ou aux inhibiteurs spécifiques administrés dans un but thérapeutique. On observe aussi l’émergence du virus ayant des capacités de réplication accrue. A l’opposé on a montré l’existence du virus ayant des capacités de réplication diminuées chez des sujets infectés restant asymptomatiques pendant de longues années [34].
La variabilité génétique des VIH est responsable de l’existence de plusieurs groupes et sous-groupes diversement répartis dans le monde. L’analyse génomique des virus permet de distinguer une nette divergence entre les génomes du VIH-1 et du VIH-2, chaque type de virus est lui-même représenté par des virus génétiquement éloignés [19].
Selon qu’il s’agit d’une infection à VIH-1 ou à VIH-2, une prise en charge spécifique est considérée. Le diagnostic de différenciation entre les deux types est fondamental. Ces virus proviennent de passages accidentels de virus de singes (SIV) à l’espèce humaine [11].
Le VIH-1 comprend 3 groupes, M, N et O. Le groupe M (pour Majeur) est responsable de la pandémie actuelle, les autres groupes étant rares. Le groupe Majeur est subdivisé en une dizaine de sous-types (nommé de A à K) et de souches recombinantes. Le sous-type B est le plus répandu en Occident, chez les populations homosexuelles et chez les toxicomanes. En Afrique centrale, tous les sous-types sont représentés [21]. Le sous-type A et la forme recombinante entre les sous-types A et G, appelée CRF02, sont responsables d’un grand nombre d’infections en Afrique de l’Ouest. Les sous-types C et D sont majoritaires en Afrique de l’Est et en Afrique du Sud [21]. Les virus du groupe O (pour Outlier), peu fréquents, sont trouvés presque exclusivement en Afrique centrale (Cameroun, Gabon, Guinée-équatoriale) [28].
Pour le VIH-2, plusieurs sous-types ont été décrits. Seuls les sous-types A (Cap-Vert, Guinée-Bissau, Guinée, Sénégal) et les sous-types B (Côte-d’Ivoire, Mali et Burkina-Faso) ont une diffusion épidémique [21].
Cette distribution des VIH de divers groupes et sous-groupes à travers le monde n’exclue pas la cohabitation de plusieurs variétés du virus ; des co-infections sont aujourd’hui signalées [11].
La classification génétique est un outil précieux dans la surveillance épidémiologique des infections à VIH dans le monde. Cette surveillance permet la réactualisation des méthodes de diagnostic.
Épidémiologie : évolution et progrès : [24]
En fin 2005, on estime à 40.3 millions, le nombre d’individus infectés par le VIH dans le monde (Figure 2). Malgré les efforts effectués dans le but de rendre les antirétroviraux plus accessibles à la population, l’épidémie a tué plus de 3.1 millions de personnes au cours de l’année 2005, dont plus d’un demi million d’enfants. Durant cette même année, on estime également le nombre de nouvelles infections à 5 millions.
La situation en Afrique sub-saharienne reste la plus préoccupante (Tableau I) avec plus de 25.8 millions de personnes vivant avec le VIH, cela représente presque les deux tiers de la population infectée dans le monde, et avec une prévalence chez l’adulte de 7.2 %. En 2005, on a recensé plus de 2.4 millions de personnes décédées de maladies liées à cette infection, alors que 3.2 millions de plus ont contracté une infection VIH. L’augmentation de la proportion de femmes touchées par l’épidémie se poursuit. En 2005, parmi les 17.5 millions de femmes vivant avec le VIH, 13.5 d’entre elles vivent en Afrique subsaharienne confirmant la féminisation de l’épidémie (Tableau I).
Diagnostic sérologique, Principes et méthodes :
Il est possible de détecter la présence du VIH dans les lymphocytes sanguins mais également au niveau des tissus des sujets infectés, par ailleurs ces méthodes restent techniquement difficiles et très coûteuses, alors elles ne peuvent pas s’appliquer au dépistage de masse.
Cependant, la plupart des laboratoires peuvent mettre en œuvre des méthodes simples, peu onéreuses et utilisables à grande échelle, permettant de détecter indirectement le virus par la recherche des anticorps spécifiquement dirigés contre les protéines constitutives du VIH.
La détection des anticorps anti-VIH circulants est la technique de choix pour le diagnostic chez l’adulte. Le développement des techniques de biologie moléculaire ne permet pas, pour l’heure actuelle, de remplacer les techniques sérologiques qui restent, partout dans le monde, les techniques de référence pour le dépistage et la confirmation des infections à VIH chez l’adulte [22]. Seul le diagnostic précoce chez le sujet nouvellement infecté ou dans les premiers mois de vie chez l’enfant né de mère séropositive, nécessite la mise en évidence du virus, de ses composants ou de son génome [31].
Cinétique des anticorps anti-VIH : [13]
Une bonne connaissance de la cinétique des anticorps et de l’antigène p24 est indispensable à l’interprétation des tests VIH. La figure 3 résume la cinétique des marqueurs biologiques au cours de l’infection à VIH.
Après la contamination, le virus est détectable, sous la forme d’acide ribonucléique (ARN) dès le 10-12e jour et sous la forme d’antigène p24 représentant juste une fraction du virus, vers le 12-14e jour. Les premiers anticorps sont délectables vers le 21e jour. Cette cinétique peut varier en fonction de chaque patient et aussi de la souche infectante.
Actuellement, les tests de dépistage utilisés en Occident sont le plus souvent capables de détecter, en plus des anticorps, simultanément, la fraction « antigène p24 ». L’utilisation de ces tests dits de quatrième génération raccourcit donc la période de « silence » sérologique lors de la primo-infection. Une fois produits par la réponse immunitaire, les anticorps anti-VIH persisteront toute la vie du patient.
Diversité des VIH et diagnostic sérologique : [33]
Les tests de dépistage basés sur des antigènes du VIH-1 de sous-type B de l’Occident et du VIH-2 de sous-type A peuvent présenter une sensibilité moindre pour la reconnaissance des autres sous-types, particulièrement lors de la primo-infection ou d’infection par des variants très « distants », comme les VIH-1 du groupe O.
Actuellement, la majorité des tests sérologiques commerciaux sont capables de détecter les anticorps anti-groupes, soit par l’intermédiaire de la réactivité croisée des antigènes spécifiques du groupe M, soit par addition des antigènes spécifiques du groupe O.
La diversité génétique a également des conséquences sur la mesure de la charge virale chez les patients infectés par les souches VIH non B. les kits disponibles ne peuvent pas détecter et quantifier les VIH-1 du groupe O, ou les souches du VIH-2, d’où la nécessité d’une mise à jour continue des tests utilisés. [3].
Tests de dépistage sérologique : [11]
Les tests sérologiques visent à détecter, dans le sérum ou le plasma d’un patient, des anticorps anti-VIH.
La plupart des algorithmes conventionnels de diagnostic sérologique exigent l’utilisation d’un test de dépistage à haute sensibilité puis en cas de positivité, l’utilisation d’un test de confirmation hautement spécifique pour éliminer les faux positifs. En effet, les tests de dépistage sont, par définition très sensibles (très peu ou pas de faux négatifs), mais ils peuvent manquer de spécificité (risques de faux positifs) [22]. Ainsi plusieurs méthodes sont utilisées :
• Les ELISA :
Les tests de dépistage sont le plus souvent des tests immuno-enzymatiques de type ELISA (Enzyme-linked Immuno-sorbent-Assay), où les antigènes viraux sont fixés sur un support solide. Ils constituent la méthode de choix pour détecter les anticorps anti-VIH circulants [22]. Ces ELISA sont classés en fonction du mode de révélation des anticorps :
-Les ELISA indirects (Figure 4) : les anticorps se fixent dans un premier temps sur l’antigène lui-même fixé sur un support solide inerte. Cette fixation est révélée par une anti-globuline humaine marquée par une enzyme, en général la peroxydase. L’intensité de la réaction colorée est approximativement proportionnelle à la quantité d’anticorps présents dans l’échantillon à tester.
Ces ELISA indirects ont une bonne sensibilité et une spécificité variable.
-Les ELISA par compétition (Figure 5) : Le principe repose sur la compétition pour les antigènes absorbés sur la surface solide entre les anticorps anti-VIH du patient et des anticorps anti-VIH marqués contenus dans le conjugué ajouté en même temps que l’échantillon à tester. L’intensité de la réaction est inversement proportionnelle au titre des anticorps.
Ces ELISA par compétition sont spécifiques.
-Les ELISA de type sandwich (Figure 6) : Les anticorps fixés sur les antigènes de la phase solide sont révélés par les mêmes antigènes marqués par une enzyme mais présents dans le conjugué et qui se fixent sur les sites anticorps restés libres. Le signal colorimétrique est approximativement proportionnel à la quantité d’anticorps présente dans l’échantillon à tester.
Quelque soit l’ELISA utilisé, le signal colorimétrique obtenu pour un échantillon testé est traduit en densité optique par lecture au spectrophotomètre et interprété par rapport à un seuil de positivité (ou cut-off) de la trousse utilisée [22].
Pour les ELISA indirects ou de type sandwich, un signal coloré supérieur au cut-off signe une positivité de l’échantillon testé, alors qu’une réactivité inférieure au cut-off indique une négativité. Il existe plusieurs générations d’ELISA selon le type d’antigène utilisé :
o Les ELISA de « première génération » sont peu sensibles et peu spécifiques, l’antigène utilisé est un lysat de virus complet, purifié à partir de lignées cellulaires infectées.
o Les ELISA de « deuxième génération » : beaucoup plus sensibles et spécifiques, utilisent comme antigènes des protéines recombinantes obtenues par génie génétique et/ou des peptides synthétiques.
o Les ELISA de « troisième génération » : plus sensibles encore que les ELISA de « deuxième génération», utilisent le même type d’antigène, mais les anticorps sont reconnus par une technique de type sandwich.
o Les ELISA de « quatrième génération » : combinant la détection des anticorps du VIH et l’antigène p24 [22].
• Les tests de dépistage rapide :
Ce sont, le plus souvent, des tests basés sur l’immunodot (Figure 9), l’immunochromatographie (Figure 7), la filtration (Figure 7 et 8) ou la migration du sérum sur une membrane ou un support recouvert d’antigènes recombinants VIH-1 et VIH-2. Lors de cette filtration ou migration, les anticorps anti-VIH, éventuellement présents dans l’échantillon, se fixeront sur les antigènes présents sur le support. La révélation de cette liaison antigène-anticorps se fait généralement par un conjugué. Le test se réalise en une dizaine de minutes en général et se fait de façon unitaire. Cette simplicité d’emploi leur assure une large diffusion dans les pays en développement.
Test de confirmation : WB [11]
Le test de confirmation doit s’effectuer, quelle que soit la technique, sur un prélèvement différent de celui ayant servi au dépistage.
En effet, de nombreux artefacts peuvent venir du prélèvement ayant servi au dépistage (contamination, erreur d’enregistrement, fausse réactivité). Aussi, pour rendre un diagnostic de séropositivité vis-à-vis du VIH, il faut s’assurer que le patient a subit un autre prélèvement et que le ou les test(s) de confirmation ont été réalisés sur ce second échantillon [22].
La technique du Western Blot (WB) : c’est la méthode de référence, mais son interprétation peut être délicate. Le WB est une technique de transfert des antigénes sur nitrocellulose, après migration électrophorétique en gel de polyacrylamide, de protéines d’un lysat viral VIH-1 ou VIH-2. Sur la bandelette de WB, différentes protéines constitutives des virus seront reconnues par des anticorps spécifiques anti-VIH-1 ou anti-VIH-2. Le WB permet parfois d’évoquer une séroconversion récente ou une infection par des virus variants.
En cas d’infection à VIH, le WB sera le plus souvent pleinement réactif et donnera peu d’information complémentaire. Inversement, en cas de « non infection », des réactivités non spécifiques sont fréquentes et d’interprétation difficile. Aussi, des alternatives au WB sont nécessaires pour éviter un recours systématique à cet examen coûteux et pas toujours très informatif. Le western blot est considéré comme révélateur d’une infection à VIH-1 si l’on met en évidence des anticorps contre au moins une protéine de core (p24 notamment) et une protéine de surface (gp41 ou gp120 ou gp160 pour le VIH-1 par exemple) [11]. Le plus souvent on trouve des anticorps contre l’ensemble des protéines du virus.
Si seule est observée la bande p24 du VIH-1, plusieurs hypothèses sont à envisager :
* Le patient est dans la période de séroconversion, les anticorps anti-p24 étant les premiers à être aperçus en western blot. Il faut redemander un contrôle sérologique 15 jours à 1 mois plus tard.
* Il peut s’agir d’une réaction croisée VIH-1/VIH-2 ; la p26 de VIH-2 est en effet proche de p24 du VIH-1 et des patients infectés par VIH-2 peuvent réagir avec p24 VIH-1 ; on pratique alors un western blot VIH-2.
* Une réaction non spécifique, dans ce cas le western blot doit être refait sur des prélèvements sériques ultérieurs.
Il est important de dire que le délai moyen d’apparition des anticorps anti-VIH après le comptage est de 3 à 6 semaines.
Les tests de discrimination : [22]
Il s’agit de tests de type immunoanalyse en ligne (LIA), utilisant des peptides synthétiques qui permettent, dans certaines situations difficiles, de discriminer entre le VIH – 1 et le VIH-2 et même récemment le sous-type O.
On distingue :
– L’Inno-LIA™ (Laboratoires Innogenetics): méthode utilisant des protéines recombinantes et des protéines de synthèse déposées sur une bande de nylon fixée sur un support plastique qui fixe en même temps des lignes témoins qui servent à établir une échelle de cotation. Le conjugué utilisé est une immunoglobuline de chèvre anti-IgG humaine marquée à la phosphatase alcaline.
– le Pepti-LAV™ (Laboratoires BIO-RAD) : technique utilisant une membrane fixée sur un support plastique comportant une ligne avec un sérum témoin et 2 bandes avec des peptides de synthèse spécifique, qui représentent les épitopes immunogènes gp41 du VIH-1 et gp36 du VIH-2. Le conjugué utilisé est une immunogène de chèvre anti-IgG humaine, marquée à la peroxydase de Raifort.
Paramètres biologiques de suivi d’une infection à VIH :
Une fois l’infection par le VIH confirmée, et quel que soit le stade clinique, il faudra assurer un suivi longitudinal des paramètres immuno-hématologiques et virologiques.
Paramètres immuno-hématologiques : [30]
Le suivi immuno-hematologique de l’infection porte essentiellement sur la détermination régulière des sous populations lymphocytaires (pourcentage et valeurs absolues des lymphocytes T CD4 et T CD8, rapport T CD4/T CD8). On peut doser également la beta2-microglobuline et parfois même, les immunoglobulines.
Tout au long de l’infection, et en l’absence de traitement antiretroviral, on note une diminution des lymphocytes T CD4, une augmentation des lymphocytes T CD8, une diminution donc du rapport T CD8/T CD4, une augmentation de la beta2-microglobuline et du titre des immunoglobulines.
Marqueurs virologiques : [11]
Antigène p24du VIH-1/p26 du VIH-2, anticorps anti-p24/anti-p26 :
L’antigène p24/p26 est détectable par ELISA dans le sérum et éventuellement dans le LCR. Il est détectable dans le sérum au moment de la primo-infection avant l’apparition des anticorps. Puis il ne va plus être détecté pendant la phase asymptomatique, il va réapparaître au moment de l’évolution du patient vers le stade IV de la classification clinique du Center for Disease control (CDC).
Depuis 1996, avec l’apparition des techniques moléculaires, les laboratoires de virologie spécialisés n’utilisent plus la quantification de l‘antigène p24 comme marqueur de suivi biologique mais plutôt la mesure de la charge virale plasmatique. Cependant l’antigène p24/p26 est toujours recherché dans un sérum lors d’une suspicion de primo-infection et chez un nouveau-né d’une mère VIH (+).
Charge virale plasmatique :
C’est le marqueur principal du pronostic, de l’évolution et du suivi thérapeutique. Elle correspond à la quantité du virus libérée dans le plasma.
Il faut rappeler qu’au cours de la primo-infection le virus se multiplie de façon intensive au niveau des cellules mononuclées du sang et des ganglions. Après la séroconversion, la multiplication va décroître, et le patient rentre dans la phase asymptomatique, avant d’atteindre le stade du SIDA clinique ou la réplication va atteindre de nouveau des niveaux élevés (Figure 10).
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Table des matières
A. INTRODUCTION
B. REVUE DE LA LITTERATURE: Les virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et diagnostic sérologique des infections à VIH
1. Taxonomie et structure du virus
2. Variabilité génétique
3. Épidémiologie : évolution et progrès
4. Diagnostique sérologique: Principes et moyens
4.1. Cinétique des anticorps anti-VIH
4.2. Diversité des VIH et diagnostic sérologique
4.3. Tests de dépistage sérologique
4.4. Tests de confirmation : WB
4.5. Tests de discrimination
4.6. Caractéristiques des tests et stratégies alternatives du diagnostic sérologique
5. Paramètres biologiques de suivi d’une infection à VIH
5.1. Paramètres immuno-hématologiques
5.2. Marqueurs virologiques
5.2.1. Antigène p24du VIH-1/p26 du VIH-2, anticorps anti-p24/antip26
5.2.2. Charge virale plasmatique :
6. Nouvelles méthodes de prélèvements biologiques
6.1. Le prélèvement salivaire
6.2. Le prélèvement urinaire
6.3. Le prélèvement d’une goutte de sang sur papier filtre
6.3.1. Principe et réalisation de la technique
6.3.2. Avantages
6.3.3. Utilité dans le diagnostique d’une infection à VIH
6.3.4. Détection d’acides nucléiques
C Mise en place du dépistage rapide au Sénégal: Utilisation de la technique des gouttes de sang Séchées comme outil de contrôle de Qualité
1. Contexte de l’étude
2. Objectifs de l’étude
3. Cadre de l’étude
4. Matériel utilisé dans l’étude
5. Méthodologie :
5.1. Sélection des tests et d’algorithmes
5.2. Sélection des sites
5.3. Procédure de l’étude
5.3.1. Formation du personnel des sites :
5.3.2. Déroulement de l’étude
5.3.2.1. Au niveau des sites
5.3.2. 2. Supervision
5.3.2. 3. Au niveau du laboratoire de référence :
5.4. Principes et modes opératoires des tests utilisés
5.4.1. Tests utilisés au niveau des sites :
5.4.2. Tests utilisés au niveau du laboratoire de référence
6. Résultats :
6.1. Performances des tests de « Screening »
6.2. Performances des tests de discrimination (BS et MS)
6.3. Résultats des tests effectués au laboratoire de référence
6.3.1. Résultats des tests effectués sur le plasma
6.3.2. Comparaison des résultats obtenus avec le DBS avec ceux obtenus avec le plasma
D- DISCUSSION
E- CONCLUSION
F- BIBLIOGRAPHIE
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