Les transporteurs ABC et leurs rôles dans les maladies génétiques

Les transporteurs ABC 

Toutes les cellules et les compartiments subcellulaires sont séparés du milieu extérieur par des membranes lipidiques. La survie cellulaire nécessite un passage régulé et sélectif de molécules spécifiques à travers ces membranes, non seulement pour acquérir les substances nutritives et excréter de nombreux produits mais aussi pour une multitude d’autres fonctions. En effet, certaines protéines membranaires sont des canaux ioniques ou des transporteurs passifs autorisant le passage de constituants selon leur gradient électrochimique ou des systèmes de transport actif permettant le transport de substances contre leur gradient de concentration. Parmi les transporteurs actifs, la famille des transporteurs à « ATP-binding cassette » (ABC) est la plus large avec des représentants chez les procaryotes et les eucaryotes [1]. Plus de 200 protéines impliquées dans le transport des substrats à travers les membranes biologiques sont des membres de la superfamille des protéines ABC [2]. Les eucaryotes ne possèdent que des systèmes d’export, alors que les procaryotes possèdent à la fois des systèmes d’export et d’import. La nature des composés transportés est extrêmement variable. A ce jour, 51 gènes ont été décrits dans cette famille chez l’Homme. 48 d’entre eux sont fonctionnels, 2 sont des pseudogènes alors que, pour un gène, la séquence de référence a été retirée des banques de données [3]. Les analyses phylogénétiques menées par Dean et al., ont permis de répartir cette famille en sept sous-familles, allant de la sous famille A à la sousfamille G  [4]. Il faut noter qu’une petite partie des protéines ABC est composée de protéines solubles, et ne sont donc pas des transporteurs membranaires.

Organisation structurale des transporteurs ABC 

Les transporteurs ABC présentent une remarquable conservation dans leur séquence et dans leur organisation structurale. Une protéine est classée en tant que membre de la famille ABC lorsqu’elle possède un domaine ATP-binding cassette. Ces domaines sont distinctifs, et conservés au sein de la famille des transporteurs ABC. L’unité fonctionnelle d’un ABC transporteur entier contient deux domaines transmembranaires (TMD pour TransMembrane Domain) et deux domaines cytoplasmiques (NBD pour Nucleotide-Binding Domain). Les hémi-transporteurs, comportant un domaine TMD et un domaine NBD, doivent former un homodimère ou un hétérodimère pour constituer un transporteur fonctionnel . Certains transporteurs ABC comportent un autre domaine TMD additionnel du côté Nterminal, appelé TMD0 .

Les TMD comportent plusieurs hélices transmembranaires. Typiquement, il y a six hélices par domaine, soit un total de douze hélices pour un transporteur entier (mais il existe des exceptions, comme BtuCD). Les TMDs constituent les domaines hydrophobes d’un transporteur, et ils ont un rôle primordial dans la reconnaissance et le transport du substrat. L’enchainement est le plus souvent N-TMD-NBD-C, mais le contraire existe aussi (exemple : ABCG). Les domaines cytoplasmiques ou NBD sont des domaines hydrophiles conservés. Ce sont les domaines impliqués dans la liaison et l’hydrolyse de l’ATP. Les NBD de tous les membres de la superfamille des protéines ABC partagent trois motifs caractéristiques qui permettent de les identifier par analyse de séquences. Ces motifs forment la « cassette » de fixation de l’ATP :

– Les motifs de Walker A et B [5]: ce sont des courtes séquences en acides aminés. Ces motifs sont conservés chez certaines protéines fixant l’ATP, en particulier les transporteurs ABC, mais ce ne sont pas les seules : il y a aussi certaines protéines kinases ainsi que des protéines de signalisation (exemple : HRAS).
– Le motif « LSGGQ » constitue la « signature » spécifique des transporteurs ABC. Sa présence entre les deux motifs Walker A et B sert à déterminer l’appartenance d’une protéine à la superfamille des transporteurs ABC.

Les transporteurs ABC et leurs rôles dans les maladies génétiques

Les transporteurs ABC sont donc des protéines membranaires qui transportent une large variété de substrats à travers les membranes intra- et extra- cellulaires. Cette fonction de transport leur permet d’assurer, chez les mammifères, un rôle important des transporteurs ABC dans la détoxication et la protection de l’organisme contre les xénobiotiques. Ce rôle prépondérant, dans les études récentes, est révélé par la distribution tissulaire des transporteurs ABC. Ils sont en effet exprimés au niveau d’importantes barrières tissulaires, telles que la muqueuse intestinale et l’endothélium qui constitue la barrière hématoencéphalique, mais aussi d’épithéliums d’élimination, comme les membranes apicales du canicule biliaire des hépatocytes et du tubule rénal .

A partir de la découverte initiale que la résistance multiple aux médicaments anticancéreux (MDR, pour « multidrug resistance ») était due à l’expression d’un transporteur ABC [7] (ABCB1 ou P-gp), il est devenu clair que plusieurs maladies chez l’homme résultent de mutations observées chez les transporteurs ABC. Ainsi, on associe à ce jour à 22 des 48 transporteurs connus des pathologies observées chez l’Homme [8], http://nutrigene.4t.com/humanabc.htm, [9]. Les mutations dans les transporteurs ABC causent ou contribuent à plusieurs désordres, mendéliens ou complexes, incluant l’adrénoleucodystrophie, la mucoviscidose, la dégénérescence rétinienne, et certaines formes d’hypercholestérolémie et de cholestase . La maladie génétique la plus fréquente est la mucoviscidose, causée par des mutations observée chez la protéine CFTR/ABCC7.

Les transporteurs ABC assurent le transport de très nombreux substrats. Ces substrats peuvent être des substances physiologiques (peptides, hormones, sucres, ions…) ou des substances exogènes potentiellement toxiques (métaux lourds, contaminants…). Dans ce dernier cas, le transport de ces substances reflète le rôle clé des transporteurs ABC dans la détoxication de l’organisme chez les mammifères. Certains transporteurs ABC sont impliqués dans les phénomènes de résistance multiple aux médicaments anticancéreux (MultiDrug Resistance). C’est le cas pour certaines protéines ABC des sous familles B (B1, P-gp), C (MRP1, MultiDrug Resistance-associated Protein 1) et G (G2, MXR/BCRP), dont l’expression au niveau des cellules cancéreuses a été associée à une fonction de détoxication par efflux actif des médicaments, pouvant mettre en échec les chimiothérapies anticancéreuses .

Les sous-familles de transporteurs ABC

En se basant sur leur conservation de séquences, et plus spécialement celles de leurs domaines NBD qui comportent les motifs spécifiques, les gènes ABC eucaryotes ont été répartis en sept sous-familles :

La sous-famille ABCA
La sous-famille ABCA comprend 12 transporteurs entiers. Cette sous-famille contient les plus grands gènes ABC. Ainsi, certaines protéines de cette sous-famille sont composées de plus de 2000 acides aminés et ont une masse moléculaire supérieure à 200kDa. Les membres de cette sous-famille sont impliqués dans le transport des lipides. ABCA1 est impliqué dans le transport de cholestérol vers les lipoprotéines à haute densité (HDL) naissantes, mais qui est décrit comme étant secondaire à une fonction de transfert intramembranaire de phosphatidylsérine. Des mutations au niveau de ce gène ont été associées à une maladie héréditaire, la maladie de Tangier, se traduisant par des désordres de transport du cholestérol et des HDL. [11-12]. C’est aussi le cas pour d’autres membres de la sous-famille ABCA : la détresse respiratoire néonatale pour ABCA3 [13], la maladie d’Alzheimer pour ABCA2 [14- 15], la maladie de Stargardt pour ABCA4, et l’ichtyose Harlequin pour ABCA12.

La sous-famille ABCB
C’est la seule sous-famille chez les mammifères comportant à la fois des transporteurs entiers et des hémi-transporteurs. Actuellement, 11 membres constituent cette sous-famille dont 4 transporteurs entiers et 7 hémi-transporteurs. ABCB1 est le premier transporteur cloné ; il est aussi le premier transporteur caractérisé pour sa capacité à conférer le phénotype « MultiDrug Resistance » aux cellules cancéreuses.[16-18]. Nous reviendrons plus en détail dans cette introduction sur les propriétés de ce transporteur, sur lequel porte l’essentiel de mon travail de thèse.

Les protéines ABCB4 et ABCB11 sont toutes les deux localisées dans le foie et sont impliquées dans la sécrétion des composants de la bile, phosphatidylcholine et acides biliaires respectivement [8]. ABCB2 et B3 (TAP1/2) sont deux hémi-transporteurs qui dimérisent pour transporter des peptides de restriction antigénique à l’intérieur du réticulum endoplasmique, pour réaliser leur présentation antigénique aux cellules immunocompétentes en association aux molécules de classe 1 du complexe majeur d’histocompatibilité [19]. Le transporteur ABC le plus homologue aux TAP est ABCB9, et il a été localisé dans les lysosomes [20]. Les autres hémi-transporteurs, ABCB6, ABCB7, ABCB8 et ABCB10 ont été localisés dans les mitochondries où ils participent au le métabolisme du fer et transportent les peptides précurseurs de la protéine Fe/S [21]. Les maladies génétiques associées aux transporteurs de cette sous-famille sont: les cholestases intrahépatiques familiales de type 2 ou 3 dues respectivement à des mutations sur ABCB11 [22] ou ABCB4 [23] et l’anémie sidéroblastique liée à l’X, due à des mutations d’ABCB7.

La sous-famille ABCC
La sous-famille ABCC contient 12 transporteurs entiers avec des fonctions assez variées parmi lesquelles le transport d’ions, des activités de sécrétion de toxines ou encore, le rôle de récepteurs à la surface des cellules.

ABCC1 est le principal transporteur de conjugués du glutathion et du glucuronate ; c’est aussi l’un des transporteurs responsables d’efflux de médicaments cytotoxiques, cotransportées avec le glutathion. ABCC2 transporte les anions organiques du foie vers la bile, les mutations touchant ce transporteur sont responsables du syndrome de Dubin-Johnson [24]. Comme ABCC1 et C2, ABCC3 est aussi un transporteur de conjugués du glutathion alors qu’ABCC4 et ABCC5 sont des transporteurs de nucléotides cycliques et d’analogues de nucléotides [25]. Les trois membres de cette sous-famille, ABCC10, ABCC11 et ABCC12 sont également des pompes d’anions lipophiles. Un dernier membre de cette famille ABCC13 ne semble pas coder pour un transporteur fonctionnel chez l’Homme [4]. Le transporteur le plus étudié de cette sous-famille est ABCC7 ou CFTR. C’est un canal d’ions chlorures, régulé par les nucléotides, dont le gène muté est responsable chez l’Homme de la mucoviscidose [26]. ABCC8 (SUR1) et ABCC9 (SUR2) sont deux protéines membranaires ABC encore plus atypiques puisqu’elles ne présentent aucune fonction de transport connue à ce jour. ABCC8 a représenté un modèle de travail pour une partie de mes travaux de thèse présentés dans ce manuscrit. ABCC8/9 jouent le rôle de régulateurs de canaux potassiques impliqués dans la modulation de la sécrétion d’insuline. Des mutations d’ABCC8 causent une hypoglycémie due à l’excès de sécrétion d’insuline. Les protéines SUR sont en association hétérotétramérique avec les sous-unités Kir6 qui constituent le canal K+ proprement dit : les protéines ABC qui sont réparties autour du canal KATP dont la conductance est régulée par ATP et ADP (par liaison aux NBD) mais aussi par différents ligands pharmacologiques dont la reconnaissance multispécifique est une caractéristique importante de SUR.

Table des matières

Chapitre A : Introduction générale
I. Les transporteurs ABC
I.1. Organisation structurale des transporteurs ABC
I.2. Les transporteurs ABC et leurs rôles dans les maladies génétiques
I.3. Les sous-familles de transporteurs ABC
II. ABCB1 : La P-glycoprotéine ou P-gp
II.1. Généralités : MDR et Détoxication
II.2. Localisation tissulaire de la P-gp
II.3. La P-gp d’un point de vue fonctionnel
II.3.1. La P-gp : entre transport de substrats et hydrolyse d’ATP
II.3.2. La P-gp : un modèle de pompe atypique?
II.3.3. La P-gp : sa multispécificité de reconnaissance
II.3.4. La P-gp : le phénotype MDR
II.4. La P-gp d’un point de vue structural
II.4.1. Structure du gène ABCB1
II.4.2. Structure de la protéine P-gp
III. Objectifs de la thèse
IV. Bibliographie
Chapitre B: Etude phylogénétique
I. Introduction
II. Analyse des séquences protéiques
III. Alignement des séquences protéiques
IV. Analyses phylogénétiques
IV.1. Méthodologie
IV.2. Phylogénie des transporteurs ABC humains
IV.3. La phylogénie au service de la modélisation
V. Bibliographie
Chapitre C: Modélisation Moléculaire
I. Introduction
II. Etude structurale de transporteurs ABC humains
II.1. Contexte scientifique
II.2. Analyse de la topologie membranaire des transporteurs ABC
II.2.1. ABCB1 et ABCC8 : des topologies membranaires similaires
II.2.2. Quelle topologie pour la région linker ?
II.3. Modélisation comparative de transporteurs ABC humains
II.3.1. Sélection des templates et alignements de séquences
II.3.3. Evaluation des modèles
II.4. Etude du cycle de translocation de la P-gp
II.4.1. Analyse des cavités et des canaux d’accès de la P-gp
II.4.2. Comparaison de deux conformations
III. Conclusion
IV. Bibliographie
Chapitre D: Docking
I. Introduction
II. Le processus de docking
II.1. Présentation
II.2. L’étape de docking
II.2.1. La recherche systématique
II.2.2. La recherche stochastique
II.2.3. La recherche déterministe
II.3. L’étape de scoring
III. Etude de docking chez les transporteurs ABC multispécifiques
III.1. Contexte scientifique
III.2. Les protagonistes considérés
III.2.1. Le récepteur
III.2.2. Les ligands
III.3. Résultats du docking
III.3.1. Résultats du docking sur la P-gp de hamster
III.3.2. Résultats du docking sur la P-gp humaine
IV. Conclusion
V. Bibliographie
Bilan général et perspectives
I. Bilan général
II. Perspectives
Conclusion générale
Annexes

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