Les technologies haut débit dans l’étude des cellules tumorales

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Étude au niveau de l’ARN

Nous décrirons plus en détail dans la partie 2.5 les deux types de puces utilisés dans notre projet d’analyse du transcriptome sur le mélanome de la choroïde.

HAUT-DÉBIT ET ÉTUDE DES CANCERS

Quantification

La technique des puces à ADN permet de comparer les profils d’expression de cel-lules présentant des phénotypes différents et permet donc de comprendre les bases moléculaires associées à ces phénotypes. La comparaison entre tissu sain et malade permet d’identifier les gènes dérégulés dans la pathologie. Ces analyses permettent éga-lement de générer des cartes d’identité des tumeurs selon leurs profils d’expression et ainsi les classer selon les gènes sur- ou sous-exprimés et qui peuvent avoir un intérêt en terme de pathogénèse, diagnostic, pronostic et traitement. L’analyse de ces profils d’ex-pression en termes de corrélation permet également de mettre en évidence des groupes de gènes qui peuvent être fonctionnellement reliés par des régulateurs communs. Ces analyses permettent de mettre en évidence bon nombre de paramètres moléculaires ca-ractéristiques de chaque tumeur et donc adapter les traitements.

Epissage

Le passage d’un ARN pré-messager à un ARN mature suscite également de l’intérêt dans la progression tumorale. Il a été montré dans l’étude de cellules tumorales l’im-portance que des dérèglements au niveau de l’épissage alternatif peuvent avoir dans la prolifération cellulaire ou encore l’apoptose [Venables, 2004]. Certaines de ces perturba-tions sont causées par des mutations aux sites d’épissage (Fig. 2.7) et leurs éléments de contrôle, tandis que d’autres sont provoquées par des changements dans l’expression des protéines contrôlant la sélection des sites d’épissage.
FIG. 2.7: Quelques exemples d’épissage alternatif. A- l’utilisation de deux sites faibles (donneur et accepteur) permet, si les protéines requises sont présentes en quantité suffisante, de définir un exon supplémentaire à inclure. B- Utilisation d’un seul site alternatif, ici 3’ (accepteur). C- Utilisation d’un seul site alternatif, ici 5’ (donneur) avec dans ces deux cas l’inclusion d’un exon supplémentaire comme en A. D- Situation dans laquelle il y a deux paires de sites faibles et donc deux possibilités d’inclusion d’exon, qui sont exclusives l’une de l’autre. E- Absence d’épissage d’un intron entraînant sa rétention dans le messager

HAUT-DÉBIT ET ÉTUDE DES CANCERS

Il existe donc des puces qui permettent de quantifier les différents variants d’épissage exprimés dans la cellule en mesurant la présence des exons spécifiques de chaque iso-forme.

micro ARN

Dans les années 90, la découverte d’ARN messagers qui ne conduisent pas à la production d’une protéine chez C. elegans s’apparente à une véritable révolution [Lee et al., 1993]. D’autant plus que ces ARN ont la capacité de bloquer de façon sélec-tive certains gènes. En 2001, le premier micro ARN est découvert chez les mammifères [Lagos-Quintana et al., 2001] et depuis leur nombre ne cessent d’augmenter.
Des études dans la progression tumorale révèlent l’importance croissante de ces petits ARN non codants [Garzon et al., 2006]. L’utilisation de puces à micro ARN (dont le principe est similaire à celui des puces pour les ARN messagers en adaptant la technique d’extraction à ces ARN particuliers) ont montré que les profils d’expression de ces petits ARN permettaient de différencier précisément les échantillons tumoraux des échantillons normaux. L’équipe de Robert Weinberg, a analysé une liste de micro ARN présents dans des tissus cancéreux et dans des tissus sains et a étudié leur rôle dans le développement de métastases. Ils ont découvert qu’un micro ARN était présent en plus grande quantité dans des cellules cancéreuses métastasées. En forçant des cellules humaines de cancer du sein à sur exprimer ce micro ARN et en les injectant chez des souris, ces cellules ont entraîné des métastases. Une des explications possibles serait que ce micro ARN bloque un gène qui freine la migration cellulaire.
D’autres études ont montré que certains micro ARN favorisaient une division rapide et incontrôlée des cellules favorisant ainsi la formation des tumeurs.
Mais si l’on connaît le rôle de certains micro ARN, la plupart ont une fonction qui reste encore inconnue.

Étude au niveau protéique

Le niveau d’expression d’un gène ne reflète pas nécessairement la quantité de pro-téines produites. Cependant les protéines sont elles-mêmes soumises à des régulations traductionnelles et post-traductionnelles. Ainsi, analyser le protéome, c’est arriver à dé-terminer la quantité de protéines actives présentes dans les cellules étudiées. Les puces pour l’étude du protéome sont donc très prometteuses dans la compréhension du pro-cessus tumoral. Cependant la technique est plus difficile à mettre à œuvre car il n’existe pas de règle simple comme la complémentarité des acides nucléiques et il n’est pas tou-jours évident de trouver des anticorps avec une bonne spécificité. Une des possibilités pour étudier les protéines à grande échelle est de procéder de façon inverse comparé aux puces à ADN et ainsi étudier une protéine par support solide sur lequel est déposé différents échantillons à analyser. Il s’agit de la technique de RPPA pour Reverse Phase Protein Array. Cette technique est une technique innovante qui nécessite une petite quan-tité de matériel biologique (environ 1 ng) contrairement au western blot classique. Les échantillons sont déposés de façon automatique sur une lame recouverte de nitrocellu-lose qui peut en contenir plus de 1000 simultanément. En utilisant des anticorps dirigés contre des modifications spécifiques comme la phosphorylation de certaines protéines, la RPPA peut être utilisée pour analyser l’état d’activation des voies de signalisation dans des cellules tumorales.

Étude phénotypique

En plus de s’appliquer au niveau moléculaire, les approches haut débit peuvent éga-lement permettre l’analyse au niveau phénotypique. Des puces TMA (pour Tissue Mi-croArray) permettent de tester par immunohistochimie (IHC) l’intensité de l’expression et la localisation cellulaire et subcellullaire du produit d’un ou plusieurs gènes ou bien encore de rechercher les anomalies génétiques par FISH. Sur une lame, jusqu’à 1000 coupes tissulaires peuvent être analysées simultanément [Kononen et al., 1998].

Analyse du génome

Les puces CGH

L’hybridation génomique comparative (CGH) est une technique de cytogénétique mo-léculaire qui a été décrite par Kallioniemi [Kallioniemi et al., 1992]. Elle permet de ca-ractériser les gains et les pertes de segments chromosomiques observés dans l’ADN tumoral. Son principe est basé sur l’hybridation compétitive de deux ADN (un normal et un tumoral) marqués par des fluorochromes différents avec des chromosomes en mé-taphase. Le rapport des deux fluorescences visualisées de manière optique le long des chromosomes renseigne ainsi sur le gain ou la perte de régions chromosomiques au sein de l’ADN tumoral par rapport à l’ADN contrôle. Cette technique permet donc de discer-ner, avec une résolution d’environ 10 à 20 mégabases, l’ensemble des gains et pertes chromosomiques de grande taille présent dans une tumeur donnée. Cependant, cette résolution est très faible et la technique de CGH a été améliorée par notre connaissance du génome humain combinée aux apports de la biologie à grande échelle. Dans la tech-nique des puces CGH, les ADN ne sont plus hybridés sur des chromosomes mais sur des fragments d’ADN bien identifiés (Fig. 2.8).
Ces sondes sont principalement issues des banques de chromosomes artificiels bac-tériens clonés (BACs) contenant un fragment d’ADN humain d’environ 150 kilobases. Ces fragments sont extraits, amplifiés, et déposés sur une puce [Pinkel et al., 1998; Pol-lack et al., 1999]. Chaque spot à la surface de la puce correspond à un BAC et donc à une zone précise du génome. La résolution de la puce CGH dépend donc du nombre de BACs déposés et leur espacement sur le génome. Depuis la première étude pangéno-mique réalisée par l’équipe de Pollack [Pollack et al., 1999] sur une puce à 4000 points, la résolution n’a cessé d’augmenter. En 2001 avec environ 2400 BACs, ces puces permet-taient d’avoir une résolution de 1,4 megabases [Snijders et al., 2001]. Il existe aujourd’hui des puces couvrant la totalité du génome grâce à l’emploi de plus de 30 000 BACs se recouvrant partiellement permettant d’atteindre des résolutions de l’ordre d’une centaine de kilobase. Par ailleurs il existe également des puces CGH dont les sondes sont des oligonucléotides et ces séquences étant bien plus courtes que des clones BACs permet-traient d’atteindre des résolutions très élevées.
L’analyse des gains et des pertes dans le génome des tumeurs présente un double intérêt : d’une part pour l’établissement d’une carte des altérations chromosomiques tu-morales, cette carte des gains et des pertes étant associée de façon très étroite au diag-nostic, voire au pronostic [Wilhelm et al., 2002], et d’autre part pour l’identification précise des gènes dont un gain ou une perte de fonction est associée à ces altérations et à la progression tumorale. Plusieurs études ont mis à profit cette stratégie pour identifier des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs, les premiers étant associés à des régions de gain, et les seconds à des régions de perte [Albertson et al., 2000; Kauraniemi et al., 2001; Garcia et al., 2005]. Par ailleurs, plusieurs études ont montré que le génome des tumeurs et les altérations qu’il comportent étaient stables au cours du temps [Wald-man et al., 2000; Albertson, 2003] ce qui souligne l’intérêt de la recherche des altérations récurrentes car celles-ci apportent à la tumeur un avantage sélectif constant.
Cependant cette technique a ses limites. En effet, elle permet de détecter seulement les modifications chromosomiques non équilibrées, c’est à dire qu’il est impossible de mettre en évidence les translocations réciproques ou les inversions. De plus, le ratio des fluorescences utilisé pour l’analyse quantitative ne permet pas d’avoir des informations concernant la ploïdie.

Les puces Affymetrix SNP6.0

La plus grande différence entre les puces CGH et les puces SNP au niveau du proto-cole est qu’il n’y a pas d’échantillon normal utilisé comme référence. Les puces SNP sont des puces à ADN élaborées pour étudier les polymorphismes génétiques. Comme expliqué au préalable, cette variation est la plus grande source de variabilité génétique entre individus. En effet, il existe environ 10 millions de SNPs dans le génome humain [Cargill et al., 1999] présents tous les 100 à 300 paires de bases en moyenne. Ces polymor-phismes sont hautement conservés dans l’évolution et dans les populations. Ainsi leur cartographie a été entreprise voici une dizaine d’années et les connaissances acquises sont rassemblées dans des bases de données (projet HapMap et base de données dbSNP, NCBI) [Consortium, 2005; Sherry et al., 2001]. Lors d’analyses non appariées (dans ce cas l’appariement signifie échantillons tumoral + sain du même patient), 270 échantillons du HapMap sont utilisés comme référence. Les puces Affymetrix Genome-Wide Human SNP array 6.0 contiennent plus de 1,8 millions de marqueurs génétiques avec environ 900000 sondes pour l’étude du polymorphisme ou encore SNPs et 950000 sondes pour la détection du nombre de copie ou encore CNVs (Copy Number Variations). Les CNVs dont définis comme des segments de chromosome d’au moins 1000 nucléo-tides de long qui varient en nombre de copies d’un humain à un autre. D’après l’étude de Redon et al. [Redon et al., 2006], sur 270 individus les CNVs représenteraient 12% du génome ce qui permet d’avoir une résolution d’environ 0,7 kb. En pratique, les puces SNPs sont composées de sondes de 25 nucléotides. Pour les sondes SNPs, il y a deux sondes pour chaque SNPs, une pour chaque allèle, et pour chaque SNP, et elles sont répétées 3 à 4 fois sur la puce à des localisations différentes. Pour les sondes CNVs, il n’y a qu’un type de sonde pour chaque CNV puisque les deux allèles sont identiques et il n’y a pas de réplicat à d’autres positions sur la puce.
Deux valeurs sont communément utilisées lors de l’analyse de ces puces, le log R ratio (LRR) et le B allèle fréquence (BAF). R est la somme des fluorescences des deux allèles pour un SNP donné et le LRR correspond au logarithme du ratio entre la somme des deux sondes d’un SNP donné dans l’échantillon étudié et la même somme obtenue dans la référence. Il ne s’agit donc pas du même log ratio utilisé dans les puces CGH qui correspond au rapport des fluorescences issu de l’hybridation compétitive de deux échantillons marqués par un fluorochrome différent. Le B allèle fréquence représente la fraction d’allèle B par rapport à l’intensité totale issue de l’allèle A et de l’allèle B. Concrètement dans une région normale, le LRR est à 0 et le BAF peut avoir 3 valeurs : 0 (correspondant à un génotype homozygote AA), 0.5 (pour un génotype hétérozygote AB) ou 1 (pour le génotype homozygote BB) (Fig. 2.9).
En plus de l’analyse du nombre de copie à la manière des puces CGH, l’intérêt de ces puces SNP pour l’étude du cancer est double car elles permettent une étude pan-génomique des polymorphismes dans un échantillon, et elles permettent de réaliser un dosage de chaque allèle, elles peuvent ainsi être également utilisées pour réaliser une étude des pertes d’hétérozygotie. Elles deviennent donc un outil alternatif d’une grande précision pour l’étude des altérations génomiques grâce aux informations supplémen-taires qu’elles apportent notamment au niveau du génotype [Lindblad-Toh et al., 2000; Mei et al., 2000; Zhou et al., 2005]. La perte d’hétérozygotie (LOH) est une forme de dés-équilibre allélique où il y a perte complète d’un des 2 allèles. Comparé aux puces CGH, pour un nombre de copie normal les puces SNPs permettent de détecter une perte d’hé-térozygotie lors d’une isodisomie où les deux copies présentes proviennent en fait du même chromosome. La mise en évidence de ces déséquilibres alléliques est un atout dans l’analyse de tumeurs car de nombreuses études ont montré leur importance dans la cancérogénèse [O’Keefe et al., 2010], dans la prédisposition tumorale [Li et al., 2010] ou la prédiction de la survie [Parkin et al., 2010; Iwakawa et al., 2011]. De plus, en com-binant à la fois le nombre de copie et le génotype la détection d’événements comme la perte d’hétérozygotie ou connaître la ploïdie des cellules devient possible [Staaf et al., 2008; Popova et al., 2009]

Extraction du signal

Dans toutes les analyses de puces à ADN une première étape de normalisation est requise afin de corriger les biais expérimentaux et extraire l’information biologique. Les protocoles en amont des technologies des puces CGH et des puces SNP étant différents, les méthodes de normalisation sont également différentes.

Traitement des puces CGH

Dans les puces CGH, parmi les variations non biologiques systémiques, les biais spatiaux sont les artefacts prédominants. On peut distinguer les gradients spatiaux conti-nus et les biais spatiaux locaux qui se traduisent par des variations d’intensité de fluo-rescence localisées. Ces variations ont un impact direct sur le signal quantifié par les logiciels d’analyse d’images.
Dans l’équipe de bioinformatique, Neuvial et al. [Neuvial et al., 2006] ont développé une méthode, MANOR (MicroArray Normalisation), qui permet de corriger ces biais spa-tiaux (Fig. 2.10). Cette méthode consiste à faire un lissage spatial des données suivi d’une segmentation des zones présentant la même tendance de valeurs puis identifier les zones aberrantes affectées par ces biais spatiaux. Cette méthode apparaît comme étant l’algorithme le plus adapté pour la correction des biais spatiaux [Koren et al., 2007] et est utilisée en routine au laboratoire.

Traitement des puces SNP6.0

Nous décrirons ici deux algorithmes majori airement utilisés pour l’étude des SNP6.0 : tout d’abord celui commercialisé par Affymetrix uis celui proposé par Hen ik Bengtsson du département de biostatistique de Berkeley (USA) dans le projet aroma, un projet open-source pour l’analyse de données de puce (http://www.aroma-project.org/).
Affymetrix propose une suite de logiciels (Affymetrix Power Tools) pour analyser leurs puces. Parmi les algorithmes proposés dans le logiciel Affymetrix Genotyping Console, la méthode CN5 permet d’estimer le nombre de copie. Dans CN5, les signaux des sondes sont normalisés (avec une correction du bruit de fond) pour les variations systémiques. L’ensemble de ces sondes est ensuite normalisé par quantile via un algorithme proprié-taire d’Affymetrix. Pour les sondes SNPs, les effets puces sont estimés séparément pour chacun des allèles en utilisant l’algorithme PLIER (Probe Logarithmic Intensity Error). Le nombre de copie total est obtenu en faisant la somme des intensités de chaque allèle. Le log ratio est ensuite calculé avec la référence choisie. Pour finir, les log ratios sont ajustés afin que la médiane de tous les signaux médians des chromosomes autosomaux soit à zéro. Cette méthode ne peut s’appliquer qu’en utilisant les CDF par défaut et n’utilise que les femmes (hommes) quand le calcul de la référence se fait sur le chromosome X (Y). Il n’est pas possible de forcer l’estimation des ratios des chromosomes X et Y sur l’en-semble des échantillons puisque les chromosomes sexuels diffèrent entre les femmes et les hommes.
La méthode ACNE (Allele specific Copy Number Estimation) [Ortiz-Estevez et al., 2010] est la dernière méthode développée par le groupe du projet Aroma pour l’analyse des puces SNP6.0. Cette méthode se base sur la méthode CRMAv2 également propo-sée par ce groupe [Bengtsson et al., 2009] pour calculer le nombre de copie et permet également d’estimer la fréquence allélique. C’est une méthode puce à puce. Les résultats ne sont pas dépendants de l’ensemble du jeu de données. La méthode ACNE permet un pré-traitement des données et un regroupement des informations des différentes sondes afin d’obtenir une estimation du nombre de copie total. Les différentes étapes de la mé-thode consiste à calibrer les différents signaux entre les paires de sondes des allèles A et B, puis à normaliser les effets dus à la position des sondes dans la séquence des gènes cibles. Les sondes répliquées sont regroupées par un modèle de moyenne robuste (et en sommant les allèles A et B pour les sondes SNPs). Ce signal est normalisé pour les effets longueur de PCR puis les nombres de copie sont calculés en faisant le ratio des groupes de sondes de l’échantillon test sur celui utilisé comme référence.
D’après leur publication, ACNE donnerait de meilleurs résultats que ceux produits par la suite logicielle d’Affymetrix. Cependant, suite à la comparaison de profils SNP6.0 en sortie des deux algorithmes qui étaient assez similaires et parce que la méthode ACNE est plus chronophage, nous utilisons en routine les sorties de CN5.

Segmentation des données

En sortie de ces méthodes d’extraction du signal, on obtient des valeurs quantitatives proportionnelles au nombre de copie d’ADN. Cependant, il y a une fluctuation résiduelle du signal inhérente aux technologies haut-débit. Le nombre de copie d’ADN est quasi-ment semblable entre des locus contigus sauf pour certains d’entre eux où on observe un changement abrupt, ces locus sont appelés points de cassure. Des méthodes de segmentation ont été développées afin de mettre en évidence ces points de cassure le long des chromosomes. Ces méthodes de segmentation doivent analyser les données tout en prenant en compte la présence de valeurs aberrantes ou la contamination des cellules normales présentes dans tous les échantillons qui ont pour effet de minimiser plus ou moins les changements de nombre de copie. Plus la résolution des puces aug-mente plus la mise en évidence d’aberrations de petites tailles est facilitée mais plus la complexité des données augmente et donc nécessite des algorithmes performants. Dif-férents algorithmes de segmentation ont été développés et comparés [Willenbrock and Fridlyand, 2005; Lai et al., 2005].
Parmi ces méthodes nous pouvons citer : AWS (Adaptive Weights Smoothing) [Pol-zehl and Spokoiny, 2000], méthode de lissage itérative ; CBS (Circular Binary Segmenta-tion) [Olshen et al., 2004] basée sur l’application d’un test statistique avec permutation ; Jong et al. [Jong et al., 2004] ont proposé une méthode qui maximise la vraisemblance avec un terme pénalisant sur le nombre de points de cassure ; Wang et al. [Wang et al., 2005] ont proposé une méthode basée sur la classification hiérarchique ; CBS amélioré [Venkatraman and Olshen, 2007] pour que le temps de calcul soit linéaire en nombre de sondes afin de s’adapter aux nouvelles versions de puces ; une méthode basée sur les chaînes de Markov (HMM – Hidden Markov Model) [Fridlyand et al., 2004] ; CGHseg [Picard et al., 2005] basée sur une approche de programmation dynamique avec vrai-semblance pénalisée afin de choisir le nombre de points de cassures adaptés au profil ; une méthode de lissage par quantile [Eilers and de Menezes, 2005] ; une méthode qui chercher à débruiter les données en utilisant un découpage en vague [Hsu et al., 2005] ; les méthodes proposées par Engler, Broet, Guha [Engler et al., 2006; Broët and Richard-son, 2006; Guha et al., 2008] se basent sur des modèles de mixture Gaussien ; Lai et al. [Lai et al., 2008] utilisent un modèle de segmentation Bayesienne ; haarseg [Ben-Yaacov and Eldar, 2008] est basée sur un découpage en vague avec seuillage et est définie comme étant 1000 fois plus rapide que les méthodes précédentes.
Ces méthodes ont été développées pour la segmentation des puces CGH. En 2010 Rigaill et al. a proposé une adaptation de la méthode CGHseg pour les données SNP6.0 qui sont plus complexes que les données de puces CGH [Rigaill, 2010a,b].
Alors que beaucoup de méthodes ont été proposées pour la segmentation des données, peu traitent le problème de l’assignement d’un statut. L’algorithme GLAD (Gain and Loss Analysis of DNA) [Hupé et al., 2004] permet dans un premier temps de détec-ter les points de cassure dans le profil génomique (étape de segmentation via AWS ou haarseg) puis attribue à chaque segment son statut, c’est à dire normal, perte, gain ou amplification (étape d’attribution du statut génomique). Cette étape d’attribution du statut de façon automatique permet de s’affranchir d’un travail manuel long et non reproductible et permet d’éviter les erreurs de perception.

Attribution du génotype pour les puces SNP6.0

Les puces SNP6.0 sont plus riches en information que les puces CGH. En effet avec deux sondes SNP par locus, en plus de pouvoir estimer le nombre de copie par le log R ratio (LRR) de façon comparable aux puces CGH, ces puces permettent d’estimer la fréquence allélique. Cette information supplémentaire peut être très informative, par exemple lors d’une perte d’hétérozygotie dans une région à 2 copies. C’est une informa-tion qui n’aurait pas pu être mise en évidence avec les puces CGH. La fréquence allélique permet également d’estimer le niveau de contamination par les cellules normales dans l’échantillon analysé en comparant le niveau réel du BAF au niveau théorique (0 ou 1 dans les régions délétées) [Nancarrow et al., 2007].
De plus, comme nous l’avons déjà cité précédemment, la prise en compte à la fois du nombre du log ratio pour le nombre de copie et la fréquence allélique permet d’as-signer plus précisément un statut à chaque segment. Popova et al. ont proposé une méthode graphique (GAP – Genome Alteration Print) qui permet d’analyser automatique-ment les profils complexes comme les échantillons de tumeurs qui sont fréquemment polyploïdes ou contaminés [Popova et al., 2009]. Cette méthode permet donc de déter-miner la ploïdie de chaque échantillon analysé et le nombre exact de copie de chaque segment (Fig. 2.11).
Loo et al. [Loo et al., 2010] ont également proposé une approche bioinformatique AS-CAT (allele-specific copy number analysis of tumors) qu’ils ont appliqué sur des tumeurs de seins et qui permet précisement de décrire le nombre de copie de façon allèle spéci-fique et ainsi estimer la ploïdie des tumeurs et la contamination de cellules normales.

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Table des matières

I Introduction 
1 Le cancer 
1.1 Origine
1.1.1 Origine clonale
1.1.2 Cellules souches cancéreuses
1.2 Oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs
1.2.1 Les oncogènes
1.2.2 Les gènes supresseurs de tumeurs
1.3 Caractéristiques des cellules cancéreuses
1.3.1 Perte de contrôle au niveau du cycle cellulaire
1.3.1.1 Indépendance vis-à-vis des signaux stimulants la prolifération cellulaire
1.3.1.2 Insensibilité aux signaux anti-prolifératifs
1.3.2 Fabrication de la masse tumorale
1.3.2.1 Prolifération illimitée
1.3.2.2 Résistance à la mort cellulaire
1.3.3 Maintien de la masse tumorale
1.3.4 Activation du potentiel invasif et migratoire
1.3.5 Reprogrammation du métabolisme
1.3.6 Microenvironnement et système immunitaire
2 Les technologies haut débit dans l’étude des cellules tumorales
2.1 Introduction
2.2 Principe général
2.2.1 Les puces à ADN par dépôt
2.2.2 Les puces à ADN à oligonucléotides synthétisés in situ
2.2.3 Les puces à ADN à microbilles (Bead Chip)
2.3 Haut-débit et étude des cancers
2.3.1 Étude au niveau de l’ADN
2.3.1.1 Analyse du nombre de copie
2.3.1.2 Polymorphismes
2.3.1.3 Méthylation
2.3.1.4 Fixation de régulateurs
2.3.2 Étude au niveau de l’ARN
2.3.2.1 Quantification
2.3.2.2 Epissage
2.3.2.3 micro ARN
2.3.3 Étude au niveau protéique
2.3.4 Étude phénotypique
2.4 Analyse du génome
2.4.1 Les puces CGH
2.4.2 Les puces Affymetrix SNP6.0
2.4.3 Extraction du signal
2.4.3.1 Traitement des puces CGH
2.4.3.2 Traitement des puces SNP6.0
2.4.4 Segmentation des données
2.4.5 Attribution du génotype pour les puces SNP6.0
2.5 Analyse du transcriptome
2.5.1 Les puces 3’IVT d’Affymetrix
2.5.2 Les puces Exon Array d’Affymetrix
2.5.3 Algorithmes pour l’extraction du signal des puces d’expression Affymetrix
2.5.3.1 MAS 5.0
2.5.3.2 RMA et GCRMA
2.5.3.3 Autres algorithmes
3 Analyse de données haut débit 
3.1 Analyses exploratoires non supervisées
3.1.1 Clustering Hiérarchique
3.1.1.1 Métriques
3.1.1.2 Les critères de liens
3.1.2 Analyse en Composantes Principales
3.2 Analyses Supervisées
3.2.1 Le test de Student
3.2.2 L’analyse de la variance
3.2.3 Le test de Wilcoxon
3.2.4 Contrôle du taux d’erreur
3.2.4.1 Le taux d’erreur globale
3.2.4.2 Le taux de faux positifs
3.2.5 Exemple de la méthode SAM
3.2.6 Statistique bayésienne empirique
3.3 Analyse d’enrichissement
3.3.1 La « Gene Ontology »
3.3.2 La base de données KEGG
3.3.3 Les Tests Hypergéométriques
3.3.4 L’outil GSEA
3.4 Analyse de survie
3.4.1 Définitions
3.4.2 Les courbes de survie et la méthode de Kaplan-Meier
3.4.3 Comparaison de courbes de survie
3.4.3.1 Test du logRank
3.4.3.2 Modèle de Cox
4 Les mélanocytes et les mélanomes 
4.1 Origine des Mélanocytes
4.2 Description anatomique
4.2.1 La Peau
4.2.1.1 Organisation
4.2.1.2 Rôle des mélanocytes
4.2.2 L’oeil
4.2.3 Formation de l’oeil
4.3 La mélanogénèse
4.4 Pathologies associées aux mélanocytes de la choroïde
4.4.1 Pathologies associées à une anomalie de pigmentation
4.4.2 Pathologies associées à une hyper prolifération des mélanocytes
4.5 Le mélanome de la choroïde
4.5.1 Généralités
4.5.1.1 Épidémiologie et facteurs de risques
4.5.1.2 Diagnostic
4.5.1.3 Traitement initial
4.5.1.4 Évolution
4.5.2 Altérations chromosomiques
4.5.3 Mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des mélanomes de la choroïde
4.5.3.1 Facteurs de transcription et modulation d’expression de gènes clés
4.5.3.2 Altérations de voies métaboliques
4.5.3.3 Mutations de récepteurs
II Résultats 
5 Analyse de la collection de Tumeurs Primaires de l’Institut Curie 
5.1 Introduction
5.2 Résultats
5.2.1 Implication de la phosphatase PTP4A3 dans les mélanomes uvéaux
5.2.1.1 Une forte expression de PTP4A3 est corrélée avec le risque métastatique chez les patients atteints de mélanome de la choroïde
5.2.1.2 PTP4A3, une molécule dérégulée dans les mélanomes uvéaux métastatiques
5.2.1.3 Analyse des lignées OCM-1 transfectées avec PTP4A3
5.2.2 Autres gènes d’intérêts dans l’analyse des tumeurs primaires
6 Analyse de la collection de métastases de l’Institut Curie 
6.1 Introduction
6.2 Matériel et Méthodes
6.3 Résultats
6.3.1 Les profils d’expression des métastases
6.3.2 Analyse de survie
6.3.3 Analyse des couples
6.4 Conclusion
7 Analyse des modèles de xénogreffes de l’Institut Curie 
7.1 Introduction
7.2 Résultats
7.2.1 Établissement des modèles murins
7.2.2 Caractérisation des modèles murins par analyse transcriptome et génome
7.3 Conclusion
8 Analyse de données haut débit 
8.1 Introduction
8.2 Résultats
III Discussion 
IV Conclusion 
V Bibliographie 

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