LES TECHNOLOGIES CLASSIQUES DE LITHOGRAPHIE

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Lithographie par Balayage de faisceau dโ€™รฉlectrons/ions

La lithographie par balayage de faisceau est un ensemble de procรฉdรฉs technologiques sans utilisation de masque dโ€™insolation. Deux technologies similaires peuvent รชtre regroupรฉes sous ce dรฉnominatif : la lithographie รฉlectronique et la lithographie par faisceau d’ions focalisรฉ (FIB : Focused ion beam).
. FIB
Les ions sont utilisรฉs pour une grande variรฉtรฉ de modification de surface : la nanolithographie (via une rรฉsine), la nanofabrication par gravure localisรฉe (pas besoin de rรฉsine) avec ou sans gaz rรฉactif (sรฉlective, accรฉlรฉrรฉe ou non), lโ€™implantation ionique localisรฉe, le dรฉpรดt localisรฉ par dรฉcomposition induite sous faisceau [7,8]. . . Le faisceau, gรฉnรฉrรฉ par une source dโ€™ions (mรฉtal liquide (Ga, Ge, In, Au) ou gaz inerte ionisรฉ), est focalisรฉ sur la surface de lโ€™รฉchantillon par un systรจme composรฉ de lentilles รฉlectrostatiques (propriรฉtรฉs focalisatrices indรฉpendantes du rapport entre la charge et la masse de la particule). Lโ€™observation de lโ€™รฉchantillon par imagerie ionique permet une mise au point et un positionnement prรฉcis de la sonde, dont le meilleur diamรจtre est de lโ€™ordre de 5-10 nm avec un courant de quelques picoampรจres pour une source ร  mรฉtal liquide de Ga. La taille de sonde est principalement limitรฉe par les aberrations (chromatiques et sphรฉriques) introduites par le systรจme de lentilles รฉlectrostatiques ร  cause de la large dispersion รฉnergรฉtique de la source ร  mรฉtal liquide (LMIS, liquid metal ionic source). Lโ€™effet de ces aberrations est dโ€™autant plus prononcรฉ quโ€™on augmente le courant du faisceau. En raison de leur masse plus grande que celle des รฉlectrons, les ions du faisceau diffusent peu et pรฉnรจtrent moins dans la matiรจre avec laquelle ils interagissent (peu de rรฉtrodiffusion). Bien que lรฉgรจrement รฉlargie par les รฉlectrons secondaires, peu รฉnergรฉtiques, la zone dโ€™interaction obtenue est mieux dรฉlimitรฉe. Cโ€™est pourquoi la rรฉsolution accessible avec la lithographie par faisceau dโ€™ions (motif transfรฉrรฉ) est normalement meilleure que celle obtenue avec des รฉlectrons (pour une mรชme taille de sonde). Du fait de cette trรจs grande efficacitรฉ du transfert dโ€™รฉnergie entre les ions et la rรฉsine, une mรชme rรฉsine aura gรฉnรฉralement une sensibilitรฉ plus รฉlevรฉe au faisceau dโ€™ions quโ€™au faisceau dโ€™รฉlectrons. Voici les meilleurs rรฉsultats en termes de rรฉsolution, obtenus en lithographie ionique :
โ€“ des lignes dโ€™Aluminium larges de 10 nm ร  partir dโ€™AlF3, rรฉsine inorganique, de 50 nm dโ€™รฉpaisseur (dรฉcomposition de AlF3 sous le faisceau par sublimation du F) [9].
โ€“ des rรฉseaux de plots avec des diamรจtres variant de 10 ร  20 nm dans une couche de PMMA (poly(mรฉthyl methacrylate)) de 60 nm dโ€™รฉpaisseur [10].
โ€“ des lignes ร  base dโ€™or de faibles dimensions latรฉrales (30 nm) et verticales (<10 nm) avec un facteur de forme ajustable avec la dose [11].
Lorsque le faisceau est suffisamment intense et รฉnergรฉtique, la collision des ions provoque la pulvรฉrisation des atomes de la surface et une gravure localisรฉe sโ€™opรจre. Cette option est trรจs intรฉressante puisquโ€™elle permet dโ€™effectuer la lithographie et la gravure simultanรฉment sans besoin dโ€™un masque de rรฉsine intermรฉdiaire. Habituellement, deux รฉtapes sont nรฉcessaires: la lithographie produit le masque de rรฉsine destinรฉ au transfert du motif par lift-off ou gravure. Contrairement au lift-off, la gravure dรฉtรฉriore souvent la rรฉsolution du motif de rรฉsine par รฉrosion ou pulvรฉrisation. Dโ€™oรน lโ€™intรฉrรชt de ce mode de fabrication par FIB qui permet la nanofabrication de structures ร  lโ€™รฉchelle de la dizaine de nanomรจtres en une seule รฉtape. Des lignes larges de 8 nm ont รฉtรฉ obtenues par cette technique (en rรฉgime de gravure) dans une couche de GaAs au travers dโ€™une couche de 50 nm dโ€™AlF3 [9]. Cette gravure peut รชtre rendue sรฉlective ou รชtre accรฉlรฉrรฉe par lโ€™addition dโ€™un gaz rรฉactif dans lโ€™enceinte. Ce procรฉdรฉ de gravure (sรฉlectif ou non) est utilisรฉ pour rรฉparer les masques ou les circuits dรฉfectueux (avec dรฉpรดt localisรฉ possible), fabriquer des membranes, prรฉparer des รฉchantillons pour une analyse au microscope รฉlectronique ร  transmission . . . Rรฉcemment, il a servi ร  la rรฉalisation de rรฉseaux de trous, constituant des sites de croissance prรฉfรฉrentielle pour la fabrication de boรฎtes quantiques organisรฉes, sur des surfaces de InP(001), Si(001) et GaN [12].
Bien que trรจs lents, la lithographie et lโ€™usinage par faisceau dโ€™ions focalisรฉ sont versatiles, flexibles et permettent une intervention localisรฉe directe ร  lโ€™รฉchelle nanomรฉtrique. Malheureusement, les ions รฉtant des particules lourdes, ils induisent toutefois des dommages en surface :
โ€“ amorphisation (possibilitรฉ de rรฉduire cet effet en augmentant la tempรฉrature de lโ€™รฉchantillon pendant lโ€™irradiation).
โ€“ implantation non contrรดlรฉe dโ€™ions issus de la source (Ga…).
โ€“ re-dรฉpรดt dโ€™atomes รฉjectรฉs lors du bombardement ionique (possibilitรฉ de rรฉduire cet effet soit en procรฉdant ร  plusieurs passages, soit en introduisant un gaz rรฉactif dans lโ€™enceinte pour former des รฉlรฉments volatils รฉvacuรฉs par le pompage)
Il en rรฉsulte une perte de cristallinitรฉ et une contamination de la surface, trรจs handicapantes pour certaines applications comme une reprise de croissance, par exemple.
. Lithographie par faisceau dโ€™รฉlectrons focalisรฉ (EBL, Electron Beam Lithography)
La lithographie par faisceau dโ€™รฉlectrons ou lithographie รฉlectronique est la technique la plus souvent employรฉe pour fabriquer des dispositifs nanomรฉtriques. Elle consiste ร  balayer par un faisceau dโ€™รฉlectrons une rรฉsine รฉlectro-sensible (sensible aux รฉlectrons) pour y dessiner un motif (figure 6) Le dessin des motifs sur la rรฉsine est donc dans ce cas sรฉriel et non parallรจle comme en photolithographie. La rรฉsine peut รชtre soit organique (PMMAโ€ฆ), soit inorganique (procรฉdรฉ SiDWEL : Silicide Direct Write Electron Beam Lithographyโ€ฆ).

Technologies de ยซ contact printing ยป

Lorsque lโ€™on souhaite dรฉposer des molรฉcules biologiques, souvent fragiles, les mรฉthodes les plus utilisรฉes sont deux technologies de contact printing. La premiรจre utilisant un automate (spotter) constituรฉ de fines aiguilles creuses permettant le dรฉpรดt de gouttes liquides est trรจs largement majoritaire. La seconde, beaucoup plus rรฉcente : le Microcontact printing (ยตCP) est de plus en plus utilisรฉ, principalement en laboratoire.
Spotter
Par technologie de contact printing on peut รฉtendre le sujet bien au delร  de la lithographie douce. En effet des technologies plus matures comme le spotter [24] (figure 13) permettent aussi de dรฉposer par contact des molรฉcules sur un substrat. Le principe en est simple, il consiste ร  remplir des aiguilles possรฉdant un rรฉservoir avec la solution ร  dรฉposer. Ce remplissage se fait gรฉnรฉralement par capillaritรฉ ou bien par รฉlectrocapillaritรฉ [25]. Ces aiguilles sont amenรฉes une fois remplies en contact avec le substrat crรฉant ainsi une goutte de solution sur celui-ci, allant de quelque nL ร  quelques pL. La taille de cette goutte dรฉpend grandement de la taille de lโ€™aiguille, puis de faรงon moins importante du temps de contact entre lโ€™aiguille et le substrat et bien sur de lโ€™angle de contact entre le liquide et la surface. Des tailles de gouttes (souvent appelรฉes spots) de quelques centaines de micromรจtres ร  quelques microns [26] peuvent รชtre obtenues.
Figure 13 : Diffรฉrents types de spotter. A gauche : spotter classique avec des aiguilles mรฉtalliques de quelques centaines de micron au niveau de la pointe permettant le dรฉpรดt de gouttes de quelques centaines de micron sur des lames de verre. A droite Spotter dรฉveloppรฉ par le LAAS-CNRS: a) et b) micro leviers en silicium (500 ยตm de large et une pointe de quelques dizaines de microns permettant le dรฉpรดt de gouttes de quelques microns sur des lames de verre c).
Contact printing en lithographie douce
Les technologies de contact printing existaient bien avant lโ€™apparition de la lithographie douce, elles ne constituent que lโ€™รฉvolution du principe dโ€™imprimerie de Gutemberg. En effet le principe est simple, le but est de transfรฉrer des molรฉcules par contact entre les motifs topologiques du timbre et le substrat (figure 14). La premiรจre personne ร  avoir eu lโ€™idรฉe de transposer ce principe ร  lโ€™รฉchelle du micromรจtre ร  รฉtรฉ G. Whitesides et al. [27] en utilisant un timbre souple en PDMS.
Pour se faire le timbre en PDMS est premiรจrement ยซ encrรฉ ยป avec la solution ร  dรฉposer. Lโ€™encrage consiste dans la majoritรฉ des cas ร  dรฉposer une goutte de solution sur la surface structurรฉe du timbre, puis aprรจs un laps de temps dรฉpendant de la solution de la retirer et de sรฉcher sous un flux dโ€™azote (figure 14a)). Lโ€™encrage est une รฉtape clรฉ du contact printing, de lโ€™uniformitรฉ et de la nature du dรฉpรดt de la molรฉcule sur le timbre dรฉpendront la qualitรฉ et la nature du dรฉpรดt final. Nous y reviendrons en dรฉtail dans le chapitre 3. Le timbre encrรฉ est ensuite amenรฉ en contact avec le substrat. Idรฉalement, lors de ce contact, seul le sommet des motifs topographiques du timbre entre en contact avec le substrat (figure 14b)). Les molรฉcules adsorbรฉes ร  sa surface sont donc transfรฉrรฉes sur le substrat par contact si elles prรฉsentent une plus grande affinitรฉ avec le substrat quโ€™avec le timbre. Le timbre peut finalement รชtre retirรฉ, laissant ainsi les motifs de lโ€™encre dรฉposรฉ sur le substrat (figure 14c)).
Le contact printing en lithographie douce ne regroupe que deux technologies le Microcontact printing (ยตCP) et le nanotransfer printing (nTP). Ces deux techniques sont en fait identiques, lโ€™une รฉtant utilisรฉe lorsque lโ€™on travaille ร  lโ€™รฉchelle micromรฉtrique et lโ€™autre ร  lโ€™รฉchelle nanomรฉtrique. Cette distinction est historique, en effet lors des dรฉbuts du dรฉveloppement du microcontact printing une partie de la communautรฉ scientifique pensait que lโ€™on ne pourrait jamais obtenir des motifs nanomรฉtriques avec cette mรฉthode. Lorsque cette barriรจre ร  รฉtรฉ franchie le terme nTP a commencรฉ ร  รชtre utilisรฉ.
Le contact printing ร  รฉtรฉ utilisรฉ pour de nombreuses applications et ceux avec une large variรฉtรฉ de molรฉcules. Nous pouvons citer, les Alcane-thiols dรฉposรฉs sur lโ€™or [28] principalement pour la microรฉlectronique. Lโ€™Octadรฉciltrichlorosilane (OTS) utilisรฉ comme passivant de surface [29] ou comme masque de gravure. De nombreux procรฉdรฉs industriels sont mรชme dรฉjร  utilisรฉs, notamment chez Phillips [30] et dans la fabrication dโ€™รฉcrans plats [31]. Des rรฉsolutions infรฉrieures ร  100 nm ont รฉtรฉ atteintes avec de nombreuses molรฉcules [32,33]. De plus le dรฉpรดt de grandes surface de motifs nanomรฉtriques est rรฉalisable [34].
Mais lโ€™utilisation la plus frรฉquente du ยตCP concerne la biologie. Les premiers travaux ont รฉtรฉ rรฉalisรฉs par IBM sur des protรฉines [35], la rรฉsolution ultime ร  mรชme รฉtรฉ atteinte en dรฉposant un rรฉseau dโ€™anticorps uniques [32]. La dรฉformation du timbre ร  รฉtรฉ รฉgalement utilisรฉe pour dรฉposer ces mรชmes protรฉines au fond dโ€™un canal microfluidique ouvert [36]. De mรชme les premiers travaux sur le dรฉpรดt dโ€™ADN ร  lโ€™รฉchelle du micron commencent ร  apparaรฎtre [37,38]. Les travaux les plus marquants concernent lโ€™amรฉlioration de technologies couramment utilisรฉes en biologie, par exemple la croissance in-situ dโ€™oligonucleotides par ยตCP [39].
La mรฉthodologie simple dโ€™utilisation, sa rรฉsolution submicromรฉtrique, la possibilitรฉ de lโ€™utiliser sur de grandes surfaces, la possibilitรฉ de transfรฉrer des molรฉcules biologiques en petites quantitรฉs (molรฉcules souvent onรฉreuses) sans dรฉtรฉriorer les fonctionnalitรฉs font du contact printing un outil de choix pour tout type dโ€™applications en biologie. Les chapitres 2,3 et 4 seront consacrรฉs essentiellement aux rรฉsultats de nos travaux dans ce domaine. Dans la deuxiรจme partie de ce chapitre, nous allons nous pencher sur le domaine des biopuces en essayant de prรฉsenter les enjeux et les besoins. Nous nous restreindrons au domaine des puces ร  ADN sans aborder celui des puces ร  protรฉines qui constitue la poursuite logique de ce couplage entre les technologies de miniaturisation et dโ€™intรฉgration de la biologie molรฉculaire.
Biopuces ร  ADN
Gรฉnรฉralitรฉs
Le marchรฉ des Biopuces
Au cours de ces dix derniรจres annรฉes, les puces ร  ADN ont envahi le marchรฉ de la recherche, bientรดt celui du diagnostic, et sโ€™imposent comme un outil incontournable dans lโ€™รจre du ยซ post-gรฉnome ยป. Elles ont changรฉ la vision des chercheurs en leur offrant la possibilitรฉ de rรฉaliser des milliers dโ€™analyses gรฉnรฉtiques en parallรจle, que ce soit dans le domaine du diagnostic, du gรฉnotypage, de la pharmaco gรฉnomique ou de lโ€™analyse globale de lโ€™expression des gรจnes. Il y a seulement dix ans, le sรฉquenรงage des gรฉnomes semblait une tรขche ambitieuse et dรฉmesurรฉe. Aujourdโ€™hui, le dรฉchiffrement de ces codes est simplement une รฉtape prรฉliminaire : il faut dรฉsormais identifier les gรจnes, leur fonction, et comprendre lโ€™organisation spatio-temporelle de lโ€™activitรฉ des gรจnes et de leurs produits au niveau cellulaire. Cโ€™est pourquoi lโ€™accรจs ร  la technologie des puces ร  ADN est devenu une prioritรฉ scientifique pour les centres de recherche acadรฉmiques et industriels. Il est รฉgalement une prioritรฉ รฉconomique puisque le marchรฉ mondial des biopuces en 2000 รฉtait de 550 millions de dollars, et avec une croissance de 15 % par an, il a dรฉpassรฉ les 2 milliards de dollars en 2005 [40]. Les principaux acteurs actuellement prรฉsents sur le marchรฉ sont amรฉricains (Agilent, Affymetrix, Illumina…).
Les applications de tels outils sont trรจs variรฉes : de la recherche fondamentale jusquโ€™ร  la mรฉdecine lรฉgale (empreinte ADN) et aux applications militaires (dรฉtection de menaces bactรฉriologiques), en passant par la dรฉcouverte de nouveaux mรฉdicaments et de nouvelles cibles thรฉrapeutiques, le diagnostic des mutations et polymorphismes de gรจnes responsables dโ€™une maladie gรฉnรฉtique, le contrรดle environnemental et agroalimentaire. Les publications les plus rรฉcentes parlent de lโ€™identification et de la dรฉtection de mutations dans des gรจnes impliquรฉs dans certains cancers [41] et proposent que les puces ร  ADN puissent guider le mรฉdecin dans le choix de la thรฉrapie la mieux adaptรฉe ร  son patient. Dans les applications environnementales [42], lโ€™analyse par puce ร  ADN vise ร  dรฉtecter rapidement et ร  quantifier une grande variรฉtรฉ de micro-organismes pathogรจnes.

ADN et hybridation

Lโ€™acide dรฉsoxyribonuclรฉique (ADN) est une molรฉcule que l’on retrouve dans tous les organismes vivants. L’ADN est prรฉsent dans le noyau des cellules eucaryotes, dans le cytoplasme des cellules procaryotes, dans la matrice des mitochondries ainsi que dans les chloroplastes. Certains virus possรจdent รฉgalement de l’ADN encapsulรฉ dans leur capside. On dit que l’ADN est le support de l’hรฉrรฉditรฉ car il constitue le gรฉnome des รชtres vivants et se transmet en totalitรฉ ou en partie lors des processus de reproduction. Il est ร  la base de la synthรจse des protรฉines.
L’ADN possรจde une structure en forme de double hรฉlice (dรฉcouverte en 1953 par James Dewey Watson, Francis Crick et coll.). L’ADN est un polynuclรฉotide ou polymรจre de nuclรฉotides. Chaque nuclรฉotide est constituรฉ d’un groupement phosphate liรฉ au dรฉsoxyribose, un sucre, lui-mรชme liรฉ ร  une base azotรฉe. Ces bases sont au nombre de quatre : la thymine (T) et la cytosine (C) sont de la famille des pyrimidines, l’adรฉnine (A) et la guanine (G) sont de la famille des purines. Un ยซ brin ยป d’ADN est formรฉ par la rรฉpรฉtition ordonnรฉe de ces nuclรฉotides, le nom dโ€™oligonuclรฉotide lui est frรฉquemment donnรฉ lorsque le nombre de nuclรฉotides le constituant est infรฉrieur ร  la centaine. Les bases azotรฉes sont complรฉmentaires deux ร  deux : l’adรฉnine s’associant avec la thymine et la guanine avec la cytosine. Le second brin d’ADN est donc complรฉmentaire au premier et les bases azotรฉes complรฉmentaires sont reliรฉes entre elles grรขce ร  des liaisons hydrogรจne (figure 15), cette รฉtape de reconnaissance des deux brins dโ€™ADN porte le nom dโ€™hybridation.
Par convention, une chaรฎne oligonuclรฉotidique sโ€™รฉcrit ร  partir de lโ€™extrรฉmitรฉ 5โ€™, associรฉe ร  la fonction phosphate du nuclรฉotide, vers lโ€™extrรฉmitรฉ 3โ€™, associรฉe ร  la fonction alcool du nuclรฉotide. Cette succession de nuclรฉotides correspond ร  une structure primaire simple brin, les deux brins complรฉmentaires รฉtant antiparallรจles, ce qui signifie que pour un brin observรฉ dans le sens 3โ€™ vers 5โ€™, le complรฉmentaire est orientรฉ de 5โ€™ vers 3โ€™. La structure ainsi reformรฉe est alors dite double brin hรฉlicoรฏdale. Sa longueur est donnรฉe frรฉquemment en nombre de base ou mรจre (mer en anglais) ou paire de bases.
Lโ€™ADN contient lโ€™information gรฉnรฉtique, codรฉe par la succession des bases azotรฉes (A, T, C, G), elle est nรฉcessaire ร  la production de protรฉines. Les possibilitรฉs offertes par lโ€™agencement des quatre bases de lโ€™ADN sont donc immenses et permettent de coder les 20 acides aminรฉs constitutifs des protรฉines.
Les รชtre vivants disposent ainsi dโ€™un systรจme informatif ร  une dimension, qui peut รชtre facilement copiรฉ ou dupliquรฉ. De cette sรฉquence linรฉaire dรฉcoule celle des protรฉines, qui adoptent spontanรฉment la structure ร  trois dimensions nรฉcessaire ร  leur fonction. Ce ยซ gain dโ€™information ยป est dรป au reploiement des protรฉines au fur et ร  mesure de leur synthรจse, en fonction des contraintes thermodynamiques imposรฉes par leur sรฉquence et par le milieu dans lequel elles sont synthรฉtisรฉes.
La connaissance thรฉorique sur lโ€™ADN associรฉe ร  un besoin en recherche dโ€™un outil plus performant que ceux dรฉjร  existants ont conduit ร  la naissance du concept des Biopuces au dรฉbut des annรฉes 1990.
Systรจmes de dรฉtection par fluorescence
La fluorescence est la technique la plus utilisรฉe en biologie pour dรฉtecter une cible (qui est marquรฉe par un fluorophore) aprรจs hybridation. En effet elle sโ€™est substituรฉe, peu ร  peu, ร  la mรฉthode par marquage radioactif. Contrairement ร  ce dernier, la dรฉtection indirecte par marquage fluorescent ne permet pas de dรฉterminer le taux absolu dโ€™hybridation sur une biopuce. Ce nโ€™est donc pas une mรฉthode quantitative mais comparative. Une quantification relative du taux dโ€™hybridation est rendue possible par lโ€™utilisation de deux fluorochromes (double marquage).
Dans le cas de la lecture directe par fluorescence sur le support, lโ€™orientation du fluorophore sur la surface dรฉpend fortement de celui-ci et de son environnement. La conformation des fluorophores change en fonction du milieu, pouvant influencer lโ€™รฉmission de la fluorescence (nous verrons dans le chapitre 4 lโ€™influence de la mรฉthode de dรฉpรดt sur la conformation et donc la fluorescence). La concentration de surface nโ€™est en gรฉnรฉral pas bien maรฎtrisรฉe, ne facilitant pas la quantification (mรชme remarque que ci-dessus). De plus, la nature du support utilisรฉ influence lโ€™รฉmission de fluorescence ainsi que le bruit de fond. Drexhage a mis en รฉvidence quโ€™il existe une forte interaction en champ proche entre le fluorophore et le substrat [43]. Cette interaction a notamment pour effet la perte dans le substrat de la majeure partie de lโ€™รฉnergie รฉmise par le fluorophore.
Les fluorophores utilisรฉs classiquement sont de la famille des carbocyanines, nous utiliserons plus particuliรจrement par la suite Cy3 et Cy5 (figure 16). Ce sont des petites molรฉcules possรฉdant une bonne solubilitรฉ aqueuse, insensibles aux changements de pH entre 3 et 10. Ils sont photo-stables avec un coefficient dโ€™excitation molaire รฉlevรฉ et un bon rendement quantique. Le marquage par ces fluorophores sโ€™effectue via des groupements chimiques (amine, thiolsโ€ฆ) de faรงon covalente et spรฉcifique.
Parallรจlement au dรฉveloppement des puces ร  ADN, des systรจmes de lecture de lโ€™hybridation ont fait leur apparition. Deux principaux systรจmes de dรฉtection permettent dโ€™acquรฉrir les signaux :
โ€“ Les scanners : utilisent un laser pour exciter les pixels un ร  un et sont couplรฉs ร  des dรฉtecteurs ร  tubes photomultiplicateur.
โ€“ Les CCD (Charge Coupled Device) : associรฉs ร  une source lumineuse pour assurer lโ€™excitation. Contrairement aux scanners qui permettent une dรฉtection plus sensible, il est plus difficile dโ€™atteindre une sรฉparation effective de la lumiรจre dโ€™excitation et dโ€™รฉmission avec les systรจmes CCD.
Aprรจs la lecture des puces, reste la phase dโ€™analyse des images obtenues pour en extraire une information sur le diffรฉrentiel dโ€™hybridation de chaque spot. Lโ€™analyse des puces ร  ADN, produit dโ€™รฉnormes quantitรฉs de donnรฉes, qui tendent ร  croรฎtre exponentiellement. La bioinformatique fournit aux chercheurs les outils informatiques nรฉcessaires pour traiter, organiser, analyser et prรฉsenter ces donnรฉes. Trois รฉtapes sont ร  distinguer dans lโ€™analyse des images :
โ€“ Localisation des spots.
โ€“ Segmentations des spots pour permettre la discrimination entre le pixel signal et les pixels bruit de fond.
โ€“ Extraction des intensitรฉs du signal de fluorescence pour chaque spot.
Microarrays
La problรฉmatique et les solutions existantes
Une puce ร  ADN, aujourdโ€™hui communรฉment appelรฉe ยซ DNA microarray ยป en anglais (de ยซ array ยป = rรฉseau ordonnรฉ), est constituรฉe de fragments dโ€™ADN immobilisรฉs sur un support solide selon une disposition ordonnรฉe. Son fonctionnement repose sur le mรชme principe que des technologies telles que le Southern blot ou le northern blot, qui sont couramment utilisรฉes pour dรฉtecter et quantifier la prรฉsence dโ€™une sรฉquence nuclรฉique spรฉcifique au sein dโ€™un รฉchantillon biologique complexe, par hybridation ร  une sonde de sรฉquence complรฉmentaire portant un marquage radioactif ou fluorescent [44]. La confection des puces ร  ADN a permis dโ€™รฉtendre ce principe ร  la dรฉtection simultanรฉe de milliers de sรฉquences en parallรจle. Une puce comporte quelques centaines ร  plusieurs dizaines de milliers dโ€™unitรฉs dโ€™hybridation appelรฉes ยซ spots ยป (de lโ€™anglais spot=tache), chacune รฉtant constituรฉe dโ€™un dรฉpรดt de fragments dโ€™ADN ou dโ€™oligonuclรฉotides correspondant ร  des sondes de sรฉquences donnรฉes. Lโ€™hybridation de la puce avec un รฉchantillon biologique, marquรฉ par un radioรฉlรฉment ou par une molรฉcule fluorescente, permet de dรฉtecter et de quantifier lโ€™ensemble des cibles quโ€™il contient en une seule expรฉrience par traitement statistique.
Dโ€™abord conรงues sur des membranes poreuses de nylon (appelรฉes parfois ยซ macroarrays ยป par opposition aux ยซ microarrays ยป), les puces ร  ADN ont รฉtรฉ progressivement mises au point sur lames de verre ร  la fin des annรฉes 90. La miniaturisation, rendue possible par lโ€™utilisation dโ€™un support solide, de marqueurs fluorescents et par les progrรจs de la robotique, permet aujourdโ€™hui de fabriquer des puces comportant une trรจs haute densitรฉ de spots, susceptibles de recouvrir lโ€™intรฉgralitรฉ du gรฉnome dโ€™un organisme sur une simple lame de microscope. On distingue plusieurs types de puces selon la densitรฉ des spots, le mode de fabrication, la nature des fragments fixรฉs ร  la surface et les mรฉthodes dโ€™hybridation. Les caractรฉristiques des puces les plus courantes sont rรฉsumรฉes dans le Tableau 2.

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Table des matiรจres

Introduction
Chapitre I : Micro et nanotechnologie
1-LES METHODES DE LITHOGRAPHIES :
1-1-LES DIFFERENTES APPROCHES DE LA LITHOGRAPHIE
1-1-1-Approche Top down
1-1-2-Approche Bottom-up
1-2-LES TECHNOLOGIES CLASSIQUES DE LITHOGRAPHIE
1-2-1-Photolithographie par proximitรฉ
1-2-2-Lithographie par Balayage de faisceau dโ€™รฉlectrons/ions
1-3-LES TECHNOLOGIES DE LITHOGRAPHIE DOUCE
1-3-1-Technologies dโ€™โ€œEmbossingโ€ et de Molding
1-3-2-Technologies de ยซ contact printing ยป
2-BIOPUCES A ADN
2-1-GENERALITES
2-1-1-Le marchรฉ des Biopuces
2-1-1-ADN et hybridation
2-1-2-Systรจmes de dรฉtection par fluorescence
2-2-MICROARRAYS
2-2-1-La problรฉmatique et les solutions existantes
2-2-2-ยซ Microarray ยป obtenus par dรฉpรดt robotisรฉ de gouttes
2-2-3-Puce in-situ
2-3- MOLECULES UNIQUES
2-3-1-Peignage molรฉculaire
2-3-2-Suivi de molรฉcules uniques
3-VERS LA FABRICATION DE BIOPUCES PAR LITHOGRAPHIE DOUCE5 REFERENCES
1-MOULES
1-1-FABRICATION DES MOULES
1-2-TRAITEMENTS DE SURFACE
1-2-1-Les diffรฉrentes mรฉthodes
1-2-2-Le traitement en phase liquide
2-TIMBRES
2-1-PDMS
2-1-1-Une formulation commerciale: Sylgard
2-1-2-Hard PDMS
2-1-3-Timbre hybride
2-2-POLLUTION OCCASIONNEE LORS DU CONTACT PAR LE TIMBRE DE PDMS
2-2-1- Caractรฉrisation du procรฉdรฉ de contamination
2-2-2-Influence des conditions de rรฉticulation sur le degrรฉ de contamination
2-2-3-Influence de la composition du PDMS
2-2-4-Nettoyage des timbres de PDMS
2-3-PROPRIETES MECANIQUES DU TIMBRE EN PDMS
2-3-1-Conformation du timbre sur le substrat
2-3-2-Effondrement du timbre
2-3-3-ยซ Retrait thermochimique ยป du PDMS
REFERENCES :
Chapitre III : Encrage des timbres
1-PREPARATION DES SURFACES
1-1-PLASMA
1-1-1-Impact du processus de nettoyage sur la persistance du traitement de surface par plasma O2 des timbres de PDMS
1-1-2-Effet du plasma sur le PDMS
1-2-TRAITEMENTS CHIMIQUES
2-ENCRE MOLECULAIRE
2-1-MOLECULES BIOLOGIQUES (SOLVANTS PROTIQUES)
2-1-1-Adsorption de lโ€™ADN sur un timbre de PDMS
2-1-2-Impact du processus de nettoyage du PDMS sur lโ€™encrage des molรฉcules d’ADN
2-1-3-Adsorption des protรฉines sur un timbre de PDMS
2-2-MOLECULES SYNTHETIQUES (SOLVANTS POLAIRES APROTIQUES)
2-2-1-Molรฉcules infรฉrieures au nm
2-2-2-Molรฉcules synthรฉtiques hydrophiles
2-2-3-Molรฉcules synthรฉtiques hydrophobes
3-SUBSTRATS
3-1-SILANES
3-2-DENDRILAMES
REFERENCES :
CHAPITRE IV : BIOPUCES
1-DENDRIMERES
1-1-PRINCIPE DU DEPOT
1-2-LES DIFFERENTS REGIMES DE DEPOT
1-2-1-Rรฉgime dโ€™excรจs
1-2-2-Rรฉgime de dรฉficit
1-3-HAUTE RESOLUTION
2-BIOPUCES A ADN
2-1-ETUDE DU NOMBRE ET DU TEMPS DE CONTACT
2-2-COMPARAISON ENTRE LE SPOTTER ET LE ยตCP
2-3-FABRICATION DE BIOPUCES POUR LA DETECTION DE MUTATION, MULTIPLEXAGE
3-BIOPUCES A MOLECULES UNIQUES : PERSPECTIVES
3-1-OBJECTIFS ET CONTEXTE
3-2-PEIGNAGE Dโ€™ADN
REFERENCES :

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