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LES VIRUS TRANSMISSIBLES PAR LA TRANSFUSION
Un don de sang sécurisé est une stratégie essentielle pour la prévention de l’infection par le VIH et d’autres infections transmissibles par le sang. La sécurité et la qualité du sang restent des préoccupations majeures dans le monde, en particulier dans les pays en développement où les conséquences en termes de morbidité et mortalités résultent de l’insécurité transfusionnelle [27]. Les progrès considérables réalisés ces dernières années en matière de sécurité virale transfusionnelle ont permis de maitriser quasi totalement le risque de transfusion par un produit sanguin labile de rétrovirus humain et des virus de l’hépatite B et C qui ont été jusqu’à présent les virus majeurs impliqués dans le risque de contamination lié à la transfusion [18].
VIRUS DE L’HEPATITE B
Structure
Morphologie
Le virus de l’hépatite B (VHB) fait partie de la famille des Hepadnaviridae; c’est un petit virus composé d’une nucléocapside entourée d’une bicouche lipidique sur laquelle s’insèrent les protéines de surface [72].
L’examen du sang infecté par le VHB à l’aide du microscope électronique montre l’existence des trois formes suivantes [59]: (figure 1)
Des particules dites sub-virales qui sont de forme sphérique ou filamenteuse.
Des particules virales complètes ou particules de DANE qui représentent le virion complet.
Particules sub-virales
Les particules sub-virales sont des enveloppes lipoprotéiques vides constituées de lipides d’origine cellulaire et d’antigènes viraux de surface (Ag HBs) [35]. Elles peuvent être de formes sphériques ou filamenteuses :
Les particules sphériques de 22 nm de diamètre constituant l’Ag HBs synthétisés en excès.
Les particules filamenteuses résultent des particules sphériques mises bout à bout ; elles sont de 40 à 400 nm de diamètre, composées d’une nucléocapside entourée d’une bicouche lipidique dans laquelle sont insérés des protéines de surface [13].
Particules virales complètes
Le virion complet ou particule de DANE est une particule sphérique de 42 à 47 nm de diamètre [59,68], il est constitué : (figure 2)
d’une enveloppe formée d’une bicouche lipidique d’origine cellulaire, à la surface de laquelle sont ancrées trois protéines virales de tailles croissantes ; S (protéine majeure), M (protéine moyenne) et une grande protéine dite ‘’L’’.
d’une nucléocapside centrale de 27 nm de diamètre que l’on peut extraire par des détergents. Elle est formée de protéines antigéniques portant l’Ag de capside, Ag HBc et l’Ag HBe et à l’intérieur on trouve le génome du VHB.
d’une polymérase virale du VHB qui possède une activité de transcription inverse et une activité d’ADN-polymérase. L’activité de l’enzyme ne s’exprime dans la cellule infectée qu’à l’intérieur de nouvelles capsides virales.
Organisation génomique
Le génome du VHB est l’un des plus petits génomes connus parmi les virus à ADN avec seulement près de 3200 nucléotides (nt). L’ADN du virion est sous forme circulaire relâchée, partiellement bicaténaire, composé d’un brin complet long ou brin (-), et d’un brin court ou brin (+) (Figure 3). Le brin long est le brin codant, de longueur constante. Il possède en 5’ une courte redondance terminale de 9 bases qui chevauche l’extrémité 3’ et présente donc à cet endroit une courte interruption de séquence appelée « gap ». La polymérase virale est liée de façon covalente à un pont phosphodiester à l’extrémité 5’ du brin (-). Le brin court, non codant, a une extrémité 5’ bien définie qui porte un oligonucléotide de 18 bases, mais une extrémité 3’ variable. Sa longueur n’est donc pas constante et représente 30 à 85 % de la taille du brin (-). Le maintien de la forme circulaire est assuré par l’appariement des extrémités 5’ de chaque brin sur une longueur de 200 nt appelée région cohésive. En outre, le génome contient de part et d’autre du gap deux séquences répétées de 10 à 12 bases, appelées DR1 et DR2, qui sont essentielles pour la réplication du virus.
Malgré sa petite taille, l’ADN du VHB est porteur d’une très grande quantité d’informations, le brin long possédant des séquences codantes dans les trois cadres de lecture transcriptionnelle [18]. On distingue quatre phases ouvertes de lecture (Open Reading Frame: ORF) (Figure 3).
l’ORF S contient 3 codons d’initiation de transcription et code donc trois protéines de surface : le gène S code l’Ag HBs ou protéine majeure S (Small protein : S), le gène préS2/S code la protéine moyenne préS2 (medium protein : M) et le gène préS1/préS2/S code la grande protéine préS1 (large protein : L).
l’ORF C code les protéines de core ou protéines de capside. Un premier codon d’initiation permet la synthèse d’une séquence signal (à partir du gène préC) nécessaire à la translocation de la protéine HBe dans le réticulum endoblastique (RE) et à sa sécrétion dans le plasma. En l’absence de cette séquence signal (la transcription débute au second codon d’initiation), la protéine HBc est synthétisée. Elle n’est pas excrétée dans le plasma et s’assemble pour former la capside virale.
l’ORF P, la plus longue phase ouverte de lecture, code l’ADN polymérase virale. Elle couvre 80 % du génome et chevauche donc partiellement ou totalement toutes les autres phases ouvertes de lecture.
la plus petite ORF code une protéine transactivatrice X.
Marqueurs viraux de l’hépatite B
Ag HBs
L’antigène HBs correspond à une production en excès d’enveloppe virale. Il traduit la présence du VHB alors que les antigènes préS1 ou préS2 traduisent la réplication virale mais ne sont pas recherchés en diagnostic de routine. L’Ag HBs est le premier marqueur retrouvé dans le sang environ 1 à 3 mois après la contamination. Il est détecté dans le sérum à l’aide de tests sérologiques immunoenzymatiques de type ELISA, utilisant des anticorps monoclonaux.
Les anticorps anti-HBs apparaissent progressivement au cours de l’élimination virale. L’apparition de ces anticorps signe soit l’arrêt de la réplication virale avec guérison, soit une protection post-vaccinale. Ils sont recherchés dans le sérum par des techniques ELISA.
Ag HBc
L’antigène HBc n’étant pas excrété dans le sérum, sa détection n’est pas réalisée en pratique courante.
Les anticorps anti-HBc apparaissent précocement dans le sérum, quelle que soit l’évolution de la maladie. Ce ne sont pas des anticorps protecteurs mais seulement les témoins d’une infection par le VHB. Ils sont détectés dans les primo-infections mais sont inconstamment retrouvés lors des réactivations.
Ag HBe
L’antigène HBe est détectable dans le sérum par ELISA mais aussi par RIA, Immunodiffusion. Il témoigne d’une réplication virale. La disparition de l’Ag HBe, mais surtout l’apparition des Ac anti-HBe sériques sont en faveur d’une rémission. Cependant, la présence d’Ac anti-HBe ne suffit pas pour affirmer la négativation de la réplication virale : dans certains cas, malgré la présence d’Ac anti-HBe, l’ADN viral reste détectable et l’infection poursuit son évolution.
Cinétique d’apparition des marqueurs
• hépatites B aiguë : Après une incubation variant de 10 semaines à 6 mois l’infection par le VHB entraîne une hépatite aiguë. Les formes asymptomatiques de l’infection à VHB sont les plus fréquentes et représentent 70 % des hépatites B ; cependant l’absence de symptômes n’empêche pas le virus de s’attaquer au foie. La forme symptomatique de l’hépatite aiguë se caractérise par un ictère, une grande fatigue (asthénie), une perte d’appétit (anorexie), des nausées et parfois de la fièvre, ainsi que des taux très élevés de transaminases sériques [72].La réplication virale est intense et la charge virale peut atteindre 1010 copies de génome/ml de sérum. Puis elle décroît progressivement et devient indétectable lorsque l’hépatite est spontanément résolutive. L’antigène HBs apparaît en moyenne 1 à 3 mois après la contamination et précède parfois l’élévation des transaminases et les signes cliniques. Il disparaît généralement en 1 ou 2 mois après la normalisation des transaminases. L’antigène HBe apparaît peu après l’Ag HBs et disparaît rapidement (sa persistance au-delà de trois semaines après le début des manifestations cliniques suggère une évolution vers la chronicité).Ce marqueur, témoin de la réplication du VHB, n’a pas d’intérêt diagnostique au stade aigu. En revanche la séroconversion HBe annonce un arrêt de la réplication virale. Les anticorps anti-HBe deviennent détectables dans le sérum entre 2 à 4 semaines après l’Ag HBs et persistent toute la vie. Ainsi, une évolution favorable est annoncée par la normalisation des transaminases et successivement, les séroconversions HBe et HBs. [49]
• Hépatite chronique
Au cours des hépatites chroniques, la charge virale varie selon les phases de l’infection : elle est relativement élevée pendant la phase d’immunotolérance, puis chute lors de la phase d’équilibre jusqu’à devenir parfois indétectable (selon la sensibilité de la technique utilisée). Les réactivations virales s’accompagnent d’une réascension de l’ADN sérique à des niveaux élevés.
Les antigènes HBs et HBe restent détectables pendant plus de 6 mois, parfois même durant quelques décades, et les transaminases sont retrouvées à des taux élevés. Après plusieurs années, on peut observer une séroconversion HBe (disparition de l’Ag HBe, apparition des Ac anti-HBe). Elle n’est pas toujours associée à une négativation de l’ADN viral sérique. Il arrive qu’à long terme l’Ag HBs disparaisse à son tour et que, parfois, des Ac anti-HBs émergent à des taux très faibles : cette séroconversion HBs ne survient que chez 5 à 10 % des patients. Dans ce cas, seuls les Ac anti-HBc restent détectables, quasi indéfiniment. Il faut noter que chez les patients immunodéprimés et/ou co-infectés par le VIH, les épisodes de réapparition de l’Ag HBs après la « guérison » de l’infection ne sont pas rares. Ils soulignent soit une réactivation de la souche initiale soit une réinfection par une autre souche de VHB [20].
VIRUS DE L’HEPATITE C
Structure
Morphologie
Le VHC appartient à la famille des Flaviviridae et au genre hépacivirus. [7] L’absence de systèmes cellulaires capables de répliquer efficacement le virus in vitro rend difficile l’étude de ce virus. Sa structure a été déduite en grande partie de celle des flavi et pesti virus, autres virus de la famille des Flaviviridae, et ses protéines ont été obtenues par des expériences de transcription, traduction et expression d’ADN complémentaire (ADNc) dans des cellules eucaryotes ou procaryotes [16]. C’est un virus de 55 à 65 nm de diamètre avec un génome constitué d’une molécule d’ARN monocaténaire de polarité positive et logée dans une coque protéique icosaédrique, la capside. La nucléocapside est entourée d’une enveloppe de nature lipidique provenant des membranes du réticulum endoplasmique des cellules infectées et sur laquelle sont ancrées deux glycoprotéines virales, E1 et E2.
Organisation génomique
Le génome viral est constitué d’un ARN simple brin de polarité positive d’environ 9600 kb. Il est composé de 3 régions principales : d’une extrémité 5’ non-codante (5’UTR), d’un cadre ouvert de lecture unique codant la polyprotéine virale et d’une extrémité 3’ non-codante (3’UTR).
La région 5’UTR est constituée de 341 nucléotides très conservés. Sa structure en tige-boucle et pseudo-nœud a permis d’identifier 4 domaines distincts (nommés de I à IV) contenant les fonctions régulatrices de la traduction et de la réplication virale. Les domaines I et II sont impliqués dans la réplication du génome et les domaines II, III et IV constituent le site interne d’entrée du ribosome (IRES) qui permet la fixation des ribosomes et l’initiation de la traduction de la polyprotéine virale [33,44].
La région 3’UTR est de taille variable (environ 250 nucléotides) et présente 3 régions distinctes : une région peu conservée de 40 à 50 nucléotides, une zone poly (U/UC) de longueur variable et une région 3’ terminale très conservée de 98 nucléotides, la région X (ou X-tail), repliée en 3 tiges boucles. Celle-ci semble jouer un rôle important dans l’initiation de la synthèse du brin d’ARN négatif au cours de la réplication du génome, et la traduction du génome viral [32]. Le génome viral possède un cadre ouvert de lecture unique codant une polyprotéine d’environ 3000 acides aminés. Cette polyprotéine est synthétisée au niveau du réticulum endoplasmique (RE) et subit différents clivages enzymatiques co- et post-traductionnels permettant la libération des protéines virales individuelles :
les protéines structurales (Core, E1 et E2) qui constituent les composants structuraux des virions;
les protéines non structurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A et NS5B) qui coordonnent les processus intracellulaires du cycle viral.
Le VHC, comme tous les virus à ARN, présente une grande variabilité génomique liée en grande partie aux erreurs de transcription de l’ARN polymérase. Ces erreurs sont à l’origine de mutations qui peuvent s’observer sur la totalité du génome. Toutefois, la région 5’NC est très conservée. L’accumulation des mutations au cours du temps, la sélection des mutants les mieux adaptés à l’environnement et leur transmission au sein des populations, ont conduit à l’émergence des principaux types de VHC [17,60].
Cinétique des marqueurs du VHC
L’antigène de la capside du VHC, comme l’ARN viral, fait partie intégrante du virus. Ces deux marqueurs suivent donc une cinétique parallèle d’apparition dans le plasma. Cependant la sensibilité des techniques de détection de l’ARN étant supérieure à celle de l’antigène. Les premières études ont montré que la détection de l’ARN précédait de quelques jours celle de l’Ag VHC [44,63].
Les anticorps apparaissent en moyenne 14 à 18 semaines après l’infection et sont dirigés contre la plupart des protéines virales. La réponse est toujours forte et stable vis-à-vis de la capside et du NS3.Cette réponse persiste après élimination virale avant de disparaitre progressivement [36]. L’ordre chronologique d’apparition des marqueurs spécifiques de l’infection par le VHC dans le sérum d’un individu en phase de primo-infection est l’ARN du VHC ensuite l’Ag VHC et enfin les anticorps anti-VHC. Dans un pourcentage important de primo-infections, une élévation des transaminases (ALAT) est observée après l’apparition des marqueurs de virémie (ARN, Ag) et avant la séroconversion.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
I. LES VIRUS TRANSMISSIBLES PAR LA TRANSFUSION
I.1.VIRUS DE L’HEPATITE B
I.1.1. Structure
I.1.1.1. Morphologie
I.1.1.2. Organisation génomique
I.1.2. Marqueurs viraux de l’hépatite B
I.1.3. Cinétique d’apparition des marqueurs
I.2.VIRUS DE L’HEPATITE C
I.2.1. Structure
I.2.1.1. Morphologie
I.2.1.2.Organisation génomique
I.2.2. Cinétique des marqueurs du VHC
I.3.VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE : VIH
I.3.1. Structure
I.3.1.1. Morphologie
I.3.1.2. Organisation génomique
I.3.2. Marqueurs viraux du VIH
I.3.3. Cinétique des marqueurs du VIH
II. LES TECHNIQUES DE DEPISTAGE DES AGENTS INFECTIEUX TRANSMISSIBLES PAR LA TRANSFUSION
II.1. La technique immuno-enzymatique
II.2. La technique d’agglutination
II.3. Western-blot
II.4. Les tests rapides spécifiques
II.5. La détection des acides nucléiques viraux
II.5.2. La Polymerase Chain Réaction
DEUXIEMEPARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
III. CONTEXTE ET CADRE D’ETUDE
IV. OBJECTIFS
IV.1. Objectif général
IV.2. Objectifs spécifiques
V. MATERIELS ET METHODE
V.1. MATERIELS
V.1.1. ARCHITECT i1000 SR
V.1.2. Matériels des tests rapides
V.2. METHODES
V.2.1. Type et population d’étude
V.2.2. Critères d’inclusion et de non inclusion
V.2.3 .Collecte des échantillons
V.2.4. Recueil des données
V.2.5. Algorithme de dépistage des agents infectieux
V.2.6. Techniques d’analyses
V.2.6.1. Principe de dosage par l’ARCHITECT
V.2.6.1.1. Dépistage du VHB avec l’Architect i1000SR
V.2.6.1.2. Dépistage du VHC avec l’ARCHITECT
V.2.6.1.3. Dépistage du VIH avec L’ARCHITECT
V.2.6.2.TECHNIQUES DES TESTS RAPIDES
V.2.6.2.1. Alere Determine TM HIV ½
V.2.6.2.2. Immunocomb II HIV 1 & 2 BiSpot
VI.1. Résultats globaux
VI.1.1. Evolution du nombre de donneurs de sang
VI.1.2.Répartition de la population d’étude selon le sexe
VI.1.3.Répartition de la population d’étude selon la fréquence des dons
VI.1.4. Prévalence des marqueurs sérologiques viraux
VI.2. Résultats analytiques
VI.2.1. Répartition des trois profils sérologiques viraux selon le sexe
V.2.2.Répartition des trois profils sérologiques viraux selon la tranche d’âge
VI.2.3. Evaluation de l’algorithme de dépistage du VIH
VI.2.4. Suivi des cas Architect positifs et Determine/ BiSpot négatifs ou discordants
VII. DISCUSSION
VII.1. Prévalence des trois profils sérologiques viraux étudiés
VII.2. Evaluation de l’algorithme dépistage du VIH
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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