LES SYSTEMES CATALYSANT L’OXYDATION DES RESIDUS CYSTEINES: LES VOIES ERO1/PDI1 ET ERV1/MIA40 

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Le rôle du FAD dans la régénération de la forme oxydée active des flavine oxydases

L’activité d’oxydation des flavines oxydases provoque la réduction de leur centre CXXC. Elles nécessitent alors des équivalents oxydants pour la régénération de leur forme oxydée. Cette régénération est réalisée par transfert de deux électrons (sous forme de protons) du motif CXXC réduit sur le groupement FAD situé à proximité. Le FADH2 formé transmet ensuite ces protons à l’O2. Ces réactions aboutissent à la régénération du site actif CXXC sous une forme oxydée et à la production d’H2O2 (voir schéma 15). La production d’H2O2 qui témoigne de l’activité catalytique des flavines oxydases est observée in vitro avec Ero1 (Gross et al., 2006) et chez C.elegans dans des conditions où Ero1 est surexprimé (Harding et al., 2003).
Ero1 et, par extension, les flavines oxydases sont donc potentiellement une source de stress oxydant, justifiant ainsi l’importance de réguler leur activité (voir paragraphe ci-dessus) afin de minimiser la production d’H2O2, pouvant conduire à un environnement trop oxydant, provoquant la formation de ponts disulfures aberrants.
La ré oxydation d’Ero1 par transfert des électrons de son groupement FAD sur l’O2 permet de maintenir l’activité d’oxydase de Pdi1 afin de former les ponts disulfures dans les protéines sécrétées. Schéma tiré de la revue (Tu and Weissman, 2004).
Cependant, l’accepteur final des électrons n’est pas toujours l’O2, que ce soit pour Ero1 ou les autres membres des flavines sulfhydryles oxydases. En effet, l groupement FAD de l’ALR transfère ses électrons 100 fois mieux au cytochrome c qu’à l’O2 (Farrell and Thorpe, 2005). Ceci semble également être le cas pour Erv1 (Allen et al., 2005). De plus, contrairement à Erv2 (Sevier et al., 2001), le maintien de l’activité d’Ero1 en anaérobiose (Sevier et al., 2001) suggérerait soit que l’accepteur d’électrons d’Ero1 n’est pas l’O2, soit qu’il existe un second accepteur d’électrons en anaérobiose. Le FAD pourrait éventuellement jouer ce rôle (Gross et al., 2006), d’autant plus que le FAD libre intracellulaire semble moduler l’activité d’Ero1 (Tu et al., 2000), (Tu and Weissman, 2002).

Bases moléculaire de la spécificité des substrats des flavines oxydases

La présence de deux enzymes d’activité similaire dans le RE, à savoir Ero1 et Erv2, pourrait être expliquée par leur différence de spécificité vis-à-vis de leurs substrats respectifs. Le motif di-thiol localisé dans le domaine non-structuré et flexible des flavines oxydases semble déterminer leur spécificité d’interaction avec leurs substrats. Cette région peptidique mobile permet en fait non seulement le transfert des équivalents oxydant du centre catalytique aux substrats, mais aussi de restreindre l’accès des substrats au site catalytique, afin d’empêcher des réactions d’oxydations non spécifiques. Cette hypothèse a été confirmée par des analyses de l’effet de la mutation du motif di-thiol d’Ero1 (Sevier and Kaiser, 2006) et d’Erv2 (Vala et al., 2005) (Vitu et al., 2006). Notons qu’un mécanisme similaire semble existerpour les Trr et Glr des eucaryotes supérieurs (pour revue voir (Williams et al., 2000)): le motif di-thiol mobile des Trr restreint l’accès au site actif aux petites molécules comme le GSSG, afin de réduire préférentiellement des thiorédoxines, et inversement, le motif di-thiol des Glr doit permettre de sélectionner préférentiellement le GSSG (pour revue voir (Williams et al., 2000)).

Les protéines relais des flavines oxydases

Les flavines oxydases Erv1 et Ero1/Erv2 oxydent leur substrats par l’intermédiaire de protéines «relais» Mia40 et Pdi1, respectivement.

Mia40 la protéine relais d’Erv1

Mia40 «Mitochondrial intermembrane space Import and Assembly» est une protéine localisée dans l’EIM, hautement conservée chez les eucaryotes et indispensable à la vie chez S.cerevisiae (Chacinska et al., 2004), (Naoe et al., 2004).
Mia40 est synthétisée dans le cytoplasme sous forme d’un précurseur immature, puis transportée dans l’EIM grâce à une séquence N-terminale d’adressage à la mitochondrie. Chez l’homme, la drosophile et C.elegans, Mia40 est ensuite libérée sous une forme soluble dans l’EIM, tandis que chez la levure, Mia40 reste ancrée à la membrane interne mitochondriale. Cependant, l’invalidation de la séquence d’ancrage N-terminale chez S.cerevisiae ne semble altérer ni l’activité, ni la localisation de Mia40 (Naoe et al., 2004).
Mia40 possède 3 paires de résidus cystéines très conservées constituant un motif N-terminal CXC et un double motif C-terminal CX9C. Ce double motif est également présent dans Cox17 ((Arnesano et al., 2005)), un chaperon responsable de l’insertion du cuivre dans la cytochrome c oxydase. Ces résidus sont majoritairement sous forme de pont disulfure (Mesecke et al., 2005), mais sont aus capables de coordonner le zinc et le cuivre (Terziyska et al., 2005), indiquant une activité potentielle de métallo-chaperon. Les résidus cystéines de Mia40 sont d’une part indispensables à son activité catalytique d’oxydase (Naoe et al., 2004) et à la stabilisation de la structure de la protéine (Hofmann et al., 2005) vraisemblablement par des liaisons disulfure ou une coordination des métaux. Après avoir inséré des disulfure ou des cofacteurs métalliques dans les petites protéines pour leur import mitochondrial, Mia40 est à nouveau oxydée par Erv1 (voir schéma 16) (Mesecke et al., 2005), (Rissler et al., 2005).

Pdi1 la protéine relais d’Ero1

Les PDI «Protéine Disulfure Isomérase» sont essentiellement des protéines solubles localisées dans la lumière du RE grâce à une séquence peptidique HDEL signalant leur rétention. Ces protéines appartiennent à la superfamille des thiorédoxines, dont nous avons parlé précédemment (voir paragraphe II.A). Les PDI sont capables de catalyser in vitro l’oxydation de nombreux substrats d’où son nom de disulfure transférase ou disulfure isomérase. Le potentiel redox élevé (-180 mV) des PDI (Aslund et al., 1997) en fait l’une des oxydases les plus efficaces de la superfamille des thiorédoxines et leur concentration de l’ordre du millimolaire, l’une des protéines les plus abondantes du RE (pour revue voir (Wilkinson and Gilbert, 2004)).

La Pdi1

La Pdi1 de S.cerevisiae est une protéine indispensable à la vie cellulaire
(Tachibana and Stevens, 1992). Chez la levure et les mammifères, la Pdi1 est organisée en 4 domaines: 2 domaines catalytiques de type «a» contenant chacun un motif CXXC localisé dans une structure «thioredoxin fold» (« # »–#–«  »#), et deux domaines non catalytiques de type «b» ne comportant pas de motif CXXC mais présentant une structure «thioredoxin fold» (pour revue voir (Gruber et al., 2006)).
Les PDI catalysent des réactions d’oxydation, de réduction et d’isomérisation.
L’activité préférentielle de la Pdi1 in vivo est encore controversée, malgré une étude suggérant qu’elle agit essentiellement en tant que thiol-oxydase (Solovyov et al., 2004). Comme nous l’avons vu auparavant, les caractéristiques de pKa et de localisation structurale des résidus cystéines du motif CXXC vont déterminer l’activité préférentielle de réductase ou d’oxydase des PDI (voir paragraphe II.B.2.a). Par exemple, Pdi1 est majoritairement présente sous une forme oxydée (Frand and Kaiser, 1999), indiquant son rôle préférentiel d’oxydase. Nous verrons ultérieuremen que notre étude nous a permis de confirmer cette donnée (voir partie résultats).
L’activité d’oxydase de la Pdi1 aboutit à l’oxydation de ses substrats sous forme de ponts disulfures et à la réduction de la Pdi1. Pdi1 a alors deux «choix». Le premier est d’être ré-oxydée par Ero1 (Frand and Kaiser, 1999) (Tu et al., 2000).
Dans ce cas, la Pdi1 est semblable à une navette transportant les ponts disulfures générés par Ero1 membranaire, vers la lumière du RE pour les introduire dans les protéines solubles de la voie de sécrétion (voir schéma 15). Le second est d’isomériser les ponts disulfures aberrants en catalysant la réduction des ponts disulfures puis la reformation de nouveaux, afin d’assurer une structure tridimensionnelle thermodynamiquement stable (pour revue voir (Wilkinson and Gilbert, 2004)). Pdi1 catalyse donc des réactions de réduction et d’oxydation itératives s’arrêtant lorsque le substrat acquiert une forme suffisamment stable pour résister à la réduction par la Pdi1.
La Pdi1 a également un rôle de chaperon indépendant de son activité redox, consistant à empêcher l’agrégation des protéines par interaction non covalente (revue (Wilkinson and Gilbert, 2004)).

Les homologues de la Pdi1 dans le RE

Il existe 4 homologues de la Pdi1 chez la levure S.cerevisae: Mpd1, Mpd2, Eps1, Eug1 (voir schéma 15), qui contrairement à Pdi1, ne sont pas essentiels (Norgaard et al., 2001). Cependant, la surexpression de l’un de ces 4 homologues restaure le phénotype sauvage de la souche $pdi1, indiquant un certain degré de redondance fonctionnelle entre les différentes PDI. Ces homologues pourraient assister Pdi1 dans l’isomérisation des protéines (Xiao et al., 2004). D’après son interaction avec Ero1, Mpd2 pourrait aussi avoir une activité d’oxydase, semblable à la Pdi1 (Frand and Kaiser, 1999). Ero1 semble sélectionner les substrats qu’il oxyde (Pdi1 et Mpd2), ce qui permettrait par exemple aux autres PDI d’agir en tant que réductases et non pas qu’oxydases.

Le relais disulfure Erv1/Mia40 de l’EIM

Erv1 est impliqué dans deux fonctions mitochondriales distinctes: l’import des protéines dans l’EIM en collaboration avec l’oxydase Mia40 (Mesecke et al., 2005), (Rissler et al., 2005), et l’export de la mitochondrie des centres Fer/S, pour la maturation des protéines cytoplasmiques à centres Fe/S (Lange et al., 2001). Ces deux fonctions cellulaires pourraient être liées à une même fonction moléculaire d’Erv1.

Le relais redox Erv1-Mia40 pour l’import des protéines dans l’EIM (schéma 16)

La majorité des protéines mitochondriales sont codées par le génome nucléaire, synthétisées dans le cytosol, puis importées dans la mitochondrie selon différents mécanismes (pour revue voir (Herrmann and Hell, 2005)). Ces protéines sont toutes transférées du cytoplasme à l’EIM à travers le canal TOM (Translocase
Outer Membrane). La plupart des protéines mitochondriales possèdent une pré- séquence N-terminale de localisation permettant leur reconnaissance par des récepteurs en surface de la mitochondrie et la translocation à travers le canal TOM.

Le rôle d’Erv1 dans le métabolisme des centres Fe/S (schéma 12)

Les données de génétique indiquent que la maturation des protéines cytoplasmiques à centres Fe/S nécessite l’export d’un facteur encore inconnu, provenant de la machinerie d’assemblage de centres Fe/S mitochondriale, vers le cytoplasme, à travers le transporteur Atm1, une protéine de structure de type ATPcassette de la membrane interne mitochondriale (pour revue voir (Lill et al., 2006).
Cet export nécessite aussi du GSH (Sipos et al., 2002), Grx3 et/ou Grx4 (voir schéma 12), et Erv1 (Lange et al., 2001). Aucune donnée mécanistique ne relie pour l’instant Erv1 à cette fonction. Cependant, étant donné son rôle dans l’import et la maturation des petites protéines Tim, elles-mêmes nécessaires à l’insertion de certaines protéines dans la membrane interne de la mitochondrie, on peut imaginer qu’un défaut d’Erv1 puisse provoquer un défaut d’import des composants indispensables à la maturation des centres Fe/S cytoplasmiques. Nous pourrions également supposer qu’Erv1 catalyse l’oxydation du composant exporté par Atm1, avant d’être transporté dans le cytoplasme. L’identification des protéines de l’EIM dont l’import dépend de la voie Erv1/Mia40 présente donc un grand intérêt dans la compréhension de la biosynthèse des centres Fe/S des protéines cytoplasmiques (voir partie résultats).

Similarités avec la voie Dsb du périplasme des bactéries

Chez la bactérie, la voie de formation des ponts disulfures la mieux caractérisée est celle des Dsb «Disulfide Bond Formation» du périplasme. Les protéines DsbA et DsbB catalysent la formation des ponts disulfure alors que les protéines DsbC et DsbD sont impliquées dans la réduction et l’isomérisation des disulfures (voir schéma 17) (pour revue voir (Messens and Collet, 2006)). Ero1/Erv2 peuvent donc être assimilé à DsbB (Sevier et al., 2005) et Pdi1 à DsbA et DsbC.
Ainsi chez les eucaryotes la même protéine, PDI, a une fonction d’oxydase, de réductase et d’isomérase alors que chez la bactérie ces fonctions sont dissociées entre l’oxydase DsbA et la réductase DsbC. DsbB situé dans la membrane périplasmique ré-oxyde DsbA à partir d’équivalents oxydants provenant de la quinone de la chaine respiratoire bactérienne, qui les transmet alors aux cytochromes puis à l’O2 (Kobayashi et al., 1997) (Bader et al., 1999), (Bader et al., 2000). DsbD, également dans la membrane périplasmique, réduit DsbC avec des électrons fournis par la thiorédoxine cytoplasmique (Rietsch et al., 1997), (Collet et al., 2002). Le mécanisme de transfert des électrons à travers la membrane périplasmique, à savoir de la thiorédoxine sur la DsbD, n’est pas clairement défini. Le périplasme comme le RE est donc un compartiment dans lequel deux systèmes catalysant des réactions opposées coexistent, à savoir la réduction/isomérisation et l’oxydation. L’absence de réactions croisées entre ces deux voies est principalement expliquée par deux facteurs. Le premier est la différence entre les structures tertiaires et quaternaires de DsbA et DsbC (Bader et al., 2001), imposant des interactions spécifiques avec des substrats différents: DsbA interagit préférentiellement avec des substrats réduits et non conformés et DsbC avec des substrats oxydés et mal conformés. Le mécanisme de reconnaissance des substrats de la Pdi1 qui possède les fonctions d’oxydase, de réductase et d’isomérase reste donc à expliquer. Le second facteur est du à la présence des deux protéines membranaires, l’oxydase DsbB et de la réductase DsbD, qui agissent respectivement en amont de DsbA et DsbC afin d’assurer le cheminement des électrons vers cesderniers et de maintenir leur activité catalytique.

Table des matières

INTRODUCTION
I. LES DIFFERENTS ETATS REDOX DU GROUPEMENT THIOL DES RESIDUS CYSTEINES
A. Les paramètres de réactivité du résidu cystéine
B. Les réactions d’oxydation des résidus cystéines
1. La formation de l’acide sulfénique
2. La formation du disulfure
3. La formation des acides sulfiniques et sulfoniques
4. La formation du thiyl
5. La formation du nitrosothiol
6. Les modifications par les électrophiles
II. DES SYSTEMES D’ECHANGES DI-THIOL/ DISULFURE PERMETTENT DE REDUIRE OU D’OXYDER LES RESIDUS CYSTEINES
A. Deux systèmes cellulaires catalysent les échanges di-thiol/disulfure
B. Oxydases ou réductases?
1. Le potentiel redox
2. Les paramètres régissant l’activité des thiol-transférases de la superfamille des thiorédoxines
a. Les propriétés redox du motif catalytique CXXC
b. Des systèmes assurant un flux opposé d’électrons
i. Les systèmes de réduction des ponts disulfures
ii. Les systèmes de formation des ponts disulfures
iii. La compartimentation des flux d’électrons
c. Le paramètre essentiel
III. LES SYSTEMES CATALYSANT LA REDUCTION DES RESIDUS CYSTEINES: LES VOIES DES THIOREDOXINES ET DU GLUTATHION
A. Présentation des composants de la voie des thiorédoxines et du glutathion
1. La voie des thiorédoxines
a. Les thiorédoxines
b. La thiorédoxine réductase
2. La voie du glutathion GSH
a. Le glutathion
b. Les glutarédoxines
B. Les fonctions cellulaires de la voie des thiorédoxines et du glutathion
1. La voie des thiorédoxines
a. Le rôle des thiorédoxines dans le métabolisme des peroxydes
i. Le métabolisme des peroxydes
ii. Les thiorédoxines fournissent les électrons aux enzymes du catabolisme des peroxydes
iii. Les données génétiques sur la fonction des thiorédoxines dans le métabolisme des peroxydes
b. Les autres fonctions cellulaires des thiorédoxines
i. Le métabolisme de l’ADN
ii. Le métabolisme de l’assimilation du sulfate
iii. Les autres fonctions cellulaires des Trx
2. La voie du GSH
a. Les données génétiques sur la fonction essentielle du GSH
b. Le GSH intervient dans la détoxication cellulaire de plusieurs composés
i. L’élimination des composés toxiques
ii. L’élimination des peroxydes
c. Le GSH intervient dans la glutathionylation des protéines
i. Le GSH a un rôle de tampon redox par la glutathionylation des cystéines
ii. Un exemple illustrant le rôle du GSH dans la glutathionylation
d. Le GSH intervient dans la voie de sécrétion
e. Le GSH intervient dans l’élimination du fer
3. La redondance entre les deux voies de réduction existe-t-elle?
a. La spécialisation des deux voies de réduction
b. La spécificité des substrats des Trx et Grx
IV. LES SYSTEMES CATALYSANT L’OXYDATION DES RESIDUS CYSTEINES: LES VOIES ERO1/PDI1 ET ERV1/MIA40 
A. Les flavines oxydases génèrent les équivalents oxydants
1. Les membres de la famille des flavines sulfhydryles oxydases
a. Les protéines QSOX
b. Les protéines ERV/ALR
2. La flavine oxydase Ero1
3. Le rôle du FAD dans la régénération de la forme oxydée active des flavine oxydases
4. Bases moléculaire de la spécificité des substrats des flavines oxydases
B. Les protéines relais des flavines oxydases
1. Mia40 la protéine relais d’Erv1
2. Pdi1 la protéine relais d’Ero1
a. La Pdi1
b. Les homologues de la Pdi1 dans le RE
C. Le relais disulfure Erv1/Mia40 de l’EIM
1. Le relais redox Erv1-Mia40 pour l’import des protéines dans l’EIM (schéma 16)
2. Le rôle d’Erv1 dans le métabolisme des centres Fe/S (schéma 12)
D. Similarités avec la voie Dsb du périplasme des bactéries
V. LES METHODES D’IDENTIFICATION DES PROTEINES OXYDEES
A. Pourquoi développer des méthodes d’identification des protéines oxydées?
B. Les méthodes globales d’identification des protéines oxydées
1. La détection et l’identification des protéines sous forme de disulfure par les électrophorèses diagonales
2. La détection et l’identification des protéines glutathionylées
3. La détection et l’identification de toutes les formes oxydées
a. Détection d’un ensemble spécifique de thiols oxydés
b. Détection de l’ensemble des thiols oxydés
c. Limites de ces méthodes globales
C. Les méthodes d’identification des cibles des thiol-transférases
1. Par réduction des extraits de protéines avec une thiorédoxine ou glutarédoxine
2. Par utilisation de versions modifiées des thiorédoxines et glutarédoxines
D. L’émergence de nouvelles méthodes de quantifications de l’état redox des thiols
VI. PRESENTATION DU PROJET DE THESE
RÉSULTATS
I. RESULTATS ET DISCUSSION 1: ETUDE DE L’ETAT REDOX DU RESIDU CYSTEINE
A. Les techniques de marquage des thiols oxydés
1. Aspects théoriques et expérimentaux
a. Aspects théoriques de la réactivité des résidus cystéines
b. Contrôle de la réactivité des résidus cystéines par abaissement du pH
c. Description générale de la méthode de marquage des thiols oxydés
d. Importance d’un marquage saturant des thiols
2. Etude de l’état d’oxydation des résidus cystéines de deux protéines modèles
a. Mesure in vivo de l’état redox de la thiorédoxine de levure par l’AMS
b. Mesure de l’état redox in vitro de la peroxydase Tsa1 par le NEM C14
3. Etude de l’état d’oxydation des résidus cystéines à l’échelle du protéome
a. Marquage des thiols oxydés et totaux par le NEM C14
i. Marquage des thiols oxydés d’un extrait de protéines (figures 3 et 4)
ii. Marquage des thiols totaux (réduits et oxydés) (figure 5 et 6)
iii. Limites de la méthode de marquage par le NEM C14
b. Marquage des thiols oxydés et réduits par le NEM fluorescent
i. La concentration d’IAM (figure 7)
ii. Le pH et la température (figure9)
iii. Application de cette méthode de marquage sur la protéine Tsa1 purifiée (figure 10)
iv. Conclusion
c. Marquage des thiols oxydés par la Biotine-HPDP et purification des protéines contenant des thiols oxydés
i. Marquage différentiel des thiols par la Biotine-HPDP
ii. Contrôle des différentes étapes de purification des protéines contenant des thiols marqués par la Biotine-HPDP
iii. Spécificité de marquage par la Biotine-HPDP et de purification des protéines marquées
iv. Spécificité de marquage des thiols oxydés et de purification des protéines oxydées
v. Limites de la méthode de purification par la Biotine-HPDP
4. La méthode d’égalisation
a. Modification de la méthode d’extraction des protéines en en milieu acide
b. Principe de la méthode d’égalisation (figure 13)
c. Purification des protéines oxydées de l’égalisat (figure 14)
5. Les méthodes de quantification de l’état redox des thiols
a. Le NEM C14
i. Définition de l’indice d’oxydation des protéines
ii. Calcul de l’indice d’oxydation des protéines
iii. Vérification de la corrélation entre la valeur I ox calculée et la quantification de l’état redox de Tsa1 et Sod1 en western blot
iv. Comparaison avec le calcul de l’état d’oxydation des protéines réalisé par d’autres auteurs.. 118
v. Limites de la méthode de quantification par le NEM C14
b. Le NEM fluorescent
i. Quantification de l’état d’oxydation des protéines
ii. Comparaison avec d’autres méthodes de quantification des thiols oxydés
iii. Limites de notre méthode de quantification par le NEM fluorescent
B. Identification des protéines oxydées
1. Identification des protéines oxydées dans une souche sauvage non traitée
2. Identification des protéines oxydées après égalisation
C. Etude de l’altération de l’état redox du résidu cystéine
1. Croissance en conditions anaérobiques
2. Effet d’un traitement au peroxyde d’hydrogène
3. Effet de l’absence d’une des deux voies cytoplasmiques de réduction des thiols
a. Invalidation de la voie des thiorédoxines
i. !trr1 !trx1!trx2
ii. !trr1
b. Invalidation de la voie du glutathion
i. L’oxydation des thiols par le GSSG
ii. Analyse du rôle du glutathion à l’échelle du protéome
iii. Analyse du rôle du glutathion sur une protéine modèle
iv. Conclusions
4. En l’absence de chaine respiratoire mitochondriale fonctionnelle (Rho0)
D. Discussion
II. RESULTATS ET DISCUSSION 2: ETUDE DU MECANISME D’OXYDATION DE LA SOD1
A. La Superoxyde Dismutase 1 (Sod1)
1. Mécanisme enzymatique des superoxyde dismutases (Pelmenschikov and Siegbahn, 2005)
2. Données de la littérature
a. Les SOD sont essentielles au métabolisme aérobie
b. Sod1 participe au métabolisme des métaux
c. Le rôle de Ccs1 «Copper Chaperone for Sod1» dans l’activation de Sod1
i. Sod1 nécessite du cuivre pour son activité catalytique
ii. Sod1 nécessite un pont disulfure intramoléculaire pour être active
d. La localisation de Sod1 et Ccs1 dans l’espace intermembranaire mitochondrial (EIM)
e. L’invalidation de la Sod1 chez l’homme
3. Notre hypothèse de la formation du pont disulfure de Sod1 (schéma 25)
B. Résultats
1. Données expérimentales du protéome oxydé
a. La Sod1
b. La Ccs1
2. Analyse de l’état d’oxydation de Ccs1
3. Etat redox et activité de la Sod1
a. Etat redox de Sod1
b. Activité de Sod1
4. Interaction de Sod1 et Ccs1
a. Visualisation d’une interaction Sod1/Ccs1 in vivo
i. Extraction des protéines totales en milieu acide
ii. Co-précipitation de Sod1 et Ccs1
b. Effet de la mutation des cystéines de Sod1 sur l’interaction avec Ccs1
i. Extraction des protéines totales en milieu acide
ii. Co-précipitation de Sod1 et Ccs1
c. Effet de la mutation des cystéines de Ccs1
5. Effets de l’inactivation de la voie Erv1/Mia40
a. La répression d’Erv1 est létale
i. L’effet de la température
ii. L’effet de la tétracycline
iii. Combinaison de la température et de la tétracycline
iv. Conclusion
b. Analyse du niveau d’expression d’Erv1
c. L’effet de l’extinction de l’expression d’Erv1 sur l’état redox de son substrat Mia40
i. Analyse de l’état d’oxydation de Mia40-Flag dans les mitochondries
ii. Analyse de la réduction de Mia40 par différents agents réducteurs
iii. Analyse de l’oxydation de la protéine endogène Mia40 dans un extrait brut
d. L’effet de l’extinction de l’expression de Erv1 sur Sod1 et Ccs1
i. Contrôle des conditions expérimentales
ii. Localisation de Ccs1
iii. Localisation de Sod1
iv. Oxydation et activité de Sod1
6. Recherche de nouvelles cibles de la voie Erv1/Mia40
7. Analyse des cystéines de Mia40 impliquées dans le mécanisme d’échange di-thiol/disulfure avec Erv1
C. Discussion
III. CONCLUSION
MÉTHODES EXPÉRIMENTALES
I. MILIEUX ET CONDITIONS DE CULTURE
A. Souches utilisées dans cette étude
B. Conditions de cultures des cellules
1. De Saccharomyces cerevisiae
2. D’Escherichia coli
C. Techniques de manipulation de S. cerevisiae
1. Transformation par choc thermique de S. cerevisiae
2. Test de sensibilité en milieu solide
a. Sensibilité aux agents oxydants
b. Thermosensibilité
3. Fractionnement cellulaire pour l’isolement des mitochondries de levure (d’après le protocole de (Daum et al., 1982))
4. Obtention d’une souche dépourvue d’ADN mitochondrial (Rho0)
5. Sporulation et dissection des tétrades pour obtenir une souche invalidée pour ERV1
II. BIOLOGIE MOLECULAIRE
A. Construction des plasmides
B. Liste des plasmides
C. Techniques
1. Invalidation de gène par recombinaison homologue
2. Extraction de l’ADN génomique
3. Transformation des bactéries compétentes E.coli par électroporation
4. Séquençage
III. BIOCHIMIE DES PROTEINES
A. Purification des protéines étiquetées
1. Purification de Ccs1-8His et de ses partenaires à partir de S. cerevisiae
2. Co-purification de Sod1-8His et Ccs1-HA
3. Expression et purification de Tsa1 chez E. coli pour obtenir des échantillons sous différents état redo
a. Expression
b. Purification
c. Réduction, Oxydation et Suroxydation in vitro
B. Méthode d’extraction des protéines pour l’analyse de l’état d’oxydation in vivo des protéines
1. En milieu acide (protocole adapté de (Delaunay et al., 2000))
2. En milieu natif contenant un agent alkylant (pour l’égalisation)
C. Marquage des protéines oxydées (pour revue voir (Le Moan N., 2007))
1. Pour le marquage par le NEM C14
2. Pour le marquage par la Biotine-HPDP
3. Pour le marquage par le NEM fluorescent
D. Purification des protéines oxydées marquées par la Biotine-HPDP
E. Séparation sur un gel bidimensionnel et révélation des protéines oxydées
1. Première dimension
2. Seconde dimension
3. Méthodes de détection
F. Analyse de l’état redox des protéines en western blot
G. Méthode d’égalisation (réalisée par Luc Guerrier CIPHERGEN-Biorad)
H. Identification des protéines par spectrométrie de masse
1. L’analyse par MALDI-TOF-MS
2. L’analyse par LC-MS/MS
I. Test NBT (d’après le protocole de (Flohe and Otting, 1984))
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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