Les sortases et l’art d’accrocher des protéines cibles à la paroi bactérienne

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Les facteurs de virulence du pneumocoque

La virulence est liée aux caractéristiques inhérentes de la bactérie et réside dans la capacité d’une souche à échapper aux systèmes de défense de l’hôte et à se multiplier chez celui-ci. En revanche, le pouvoir pathogène d’une souche bactérienne s’exprime par la création de lésions tissulaires caractéristiques suite à la réaction inflammatoire engendrée par la libération et à l’activation de différents composants bactériens. (AlonsoDeVelasco et al., 1995)
La connaissance des facteurs de virulence de S. pneumoniae et leur action représente une voie prometteuse pour le développement de nouveaux traitements. Par conséquent, un effort important a été réalisé ces dernières années pour les identifier et les caractériser. 387 gènes pneumococciques impliqués dans la virulence ont ainsi été récemment mis en avant, sans pour autant que toutes leurs fonctions soient déterminées (Hava and Camilli, 2002). La figure 3 représente les facteurs de virulence du pneumocoque dont nous allons discuter le rôle ci-après.

Les polysaccharides capsulaires

Outre son caractère immunogène qui est à l’origine de la production d’anticorps protecteurs spécifiques chez l’hôte, la capsule polysaccharidique est un déterminant essentiel à la virulence du pneumocoque ; sans capsule, la dose létale augmente d’un facteur supérieur à 106 lors d’infections expérimentales (Watson and Musher, 1990). La capsule protège la bactérie de la phagocytose des macrophages et des neutrophiles, permettant ainsi la colonisation in vivo. De plus, elle protége certaines protéines de surfaces (telles PspA ou CbpA) des anticorps circulants de l’hôte, leur évitant ainsi une inhibition fonctionnelle (Watson and Musher, 1990). L’épaisseur de la capsule ainsi que sa composition déterminent, à divers degrés, l’habileté d’un sérotype à survivre dans le sang et à causer une infection invasive (Kelly et al., 1994).

La paroi bactérienne

La paroi est composée du peptidoglycane, d’acides teichoïques (polymères contenant de la phosphorylcholine et liés au peptidoglycane) et d’acides lipoteichoïques (polymères contenant de la phosphorylcholine mais ancrés à un glycolipide de la membrane cytoplasmique). Ces deux derniers sont de puissants inducteurs de la réaction inflammatoire capable de provoquer des dommages tissulaires irréversibles (Varon, 2001). La paroi est également impliquée dans l’attachement de pneumocoques non encapsulés sur les cellules endothéliales humaines (Geelen et al., 1993).

Les protéines pneumococciques

Le pneumocoque possède de nombreuses protéines jouant un rôle dans la pathogénie, que ce soit en permettant l’adhésion, en agissant directement sur les tissus de l’hôte ou encore en médiant l’inflammation. Ces principales protéines sont la protéine A de surface du pneumocoque (PspA), l’adhésine CbpA, la pneumolysine, la neuraminidase, la hyaluronidase et l’autolysine.

La protéine de surface PspA

PspA est une protéine produite par toutes les souches pneumococciques qui inhibe l’activité du complément de l’hôte. Le pneumocoque évite ainsi les mécanismes de défense humains via une diminution du mécanisme d’opsonophagocytose (phagocytose par les macrophages ou neutrophiles facilitée par les anticorps qui recouvrent la cible) (Briles et al., 1988). De plus, PspA joue un rôle dans l’apport en fer pour la croissance in vivo du pneumocoque. En effet, elle se lie et inhibe la lactoferrine humaine qui est une protéine ayant un rôle dans la séquestration du fer (Hammerschmidt et al., 1999). Des souches pneumococciques, dans laquelle le gène codant pour PspA a été délété, sont significativement moins virulentes comparées aux souches sauvages (Berry and Paton, 2000).

L’adhésine CbpA

Des souches mutées de S. pneumoniae ne produisant plus la protéine CbpA présentent une diminution de leur capacité à coloniser le nasopharynx, à provoquer une pneumonie et une bactériémie dans le modèle murin (Balachandran et al., 2002). Ces observations indiquent que CbpA est un important facteur de virulence, même si le mécanisme d’action de cette protéine est encore pauvrement compris. CpbA jouerait le rôle d’une adhésine de surface et serait impliquée dans l’adhésion au cellules de la muqueuse nasopharyngeale et aux cellules endothéliales pulmonaires. C’est en interagissant avec le récepteur aux immunoglobulines IgR, présent à la surface cellulaire de l’hôte, que CbpA interviendrait dans l’adhésion du pathogène (Zhang et al., 2000).

La pneumolysine

La pneumolysine est une cytotoxine initialement présente dans le cytoplasme de toutes les souches pneumococciques et excrétée lors de leur lyse. Des monomères de pneumolysine se fixent sur la membrane de la cellule cible par l’intermédiaire du cholestérol, s’insèrent puis forment des oligomères intra-membranaires qui s’organisent pour former des pores transmembranaires. Ceci autorise alors l’entrée d’eau dans la cellule qui conduit, le plus souvent, à la lyse cellulaire (Andrew et al., 1997). La dissémination du pneumocoque se retrouve ainsi facilitée (Rubins et al., 1992 ; Rayner et al., 1995). En dehors de son activité toxique, la pneumolysine est également capable d’inhiber la clairance bactérienne des poumons en supprimant le mouvement ciliaire, augmentant, de cette façon, l’adhérence du pneumocoque à l’épithélium bronchial (Steinfort et al., 1989). De plus, la pneumolysine inhibe également les défenses immunes de l’hôte et facilite ainsi la multiplication du pneumocoque dans les poumons et son invasion dans le sang (Paton and Ferrante, 1983).

La neuraminidase

Cette enzyme, présente chez tous les isolats cliniques du pneumocoque, clive l’acide sialique contenu dans les glycolipides, les glycoprotéines et les oligosaccharides présents à la surface des cellules hôtes. Il en résulte alors des dommages cellulaires mais également une exposition de récepteurs utilisés par le pneumocoque pour son adhésion (Paton and Ferrante, 1983). Une diminution de la colonisation du nasopharynx est observée avec des souches de pneumocoque déficientes en neuraminidase (Winter et al., 1997).

La hyaluronidase

Cette enzyme est retrouvée dans la majorité des isolats de S.pneumoniae et contribue à la virulence de celui-ci en dégradant l’acide hyaluronique, composant important de la matrice extracellulaire. La migration de la bactérie du site de colonisation vers le système sanguin est, de ce fait, facilitée (Paton and Ferrante, 1983).

L’autolysine LytA

LytA est une enzyme intervenant dans la dégénérescence de la paroi bactérienne en hydrolysant spécifiquement le peptidogycane (Mosser and Tomasz, 1970). Elle est ainsi impliquée dans l’autolyse cellulaire, à travers laquelle des substances toxiques sont relarguées, comme la pneumolysine, la neuramidase ou encore des produits de dégradation du peptidoglycane qui sont de puissants stimulants de la réaction inflammatoire (Berry and Paton, 2000). LytA joue un rôle important dans la virulence du pneumocoque. En effet, une souche déficiente en cette protéine possède un sévère défaut de virulence dans le modèle murin (Berry et al., 1989).

Les pili

Ces fibres protéiques, qui seront décrites plus en détail dans le paragraphe suivant, sont présentes dans 30% des souches pneumoccocciques et constituent un facteur de virulence qui n’a été découvert que récemment (Basset et al., 2007 ; Barocchi et al., 2006). La figure 5 met en avant la présence de ces structures filamenteuses à la surface du pneumocoque.
Du fait de leur récente découverte, les études concernant leur rôle dans la pathogénie sont encore restreintes aujourd’hui. Néanmoins, in vitro, il a été montré que les pili participent au processus d’adhésion du pneumocoque sur les cellules épithéliales pulmonaires (Barocchi et al., 2006). Il a été également reporté que les pili jouent un rôle dans la colonisation et l’invasion des poumons dans le modèle murin (Barocchi et al., 2006 ; Rosch et al., 2008).
D’autre part, il a été montré que les pili augmentent la réponse inflammatoire de l’hôte. En effet, les souches piliées élicitent une réponse immunitaire élevée à cytokines (protéine impliquée dans la communication des cellules immunitaires) comparée aux souches non piliées (Barocchi et al., 2006). L’utilisation potentielle des pili pneumococciques comme vaccin candidat a été étudiée par Gianfaldoni et ses collègues qui ont montré que les sous-unités protéiques du pilus constituent des antigènes protecteurs (Gianfaldoni et al., 2007). Du fait que les pili ne se retrouvent pas dans l’ensemble des souches pneumococciques, un vaccin combinant les protéines du pilus avec d’autres antigènes serait souhaitable.

Les pili, organelles de surface bactériens

L’adhésion des bactéries sur les cellules et tissus hôtes, ainsi que sur les composants de la matrice extracellulaire, constitue une des étapes cruciales dans le processus infectieux. Les adhésines, protéines localisées à la surface bactérienne, sont responsables de cet attachement. Du fait de leurs charges nettes négatives, la bactérie et la cellule hôte se répulsent naturellement rendant difficile l’adhésion du pathogène. Afin de contourner ce problème, ce dernier a mis en place un système permettant à l’adhésine d’être située à distance de la surface bactérienne. Il s’agit d’une structure protéique appelée pili ou fimbriae, péritriche, non flagellaire et filamenteuse, qui s’étend hors de la paroi et sur laquelle l’adhésine est localisée.
Les pili sont composés d’unités protéiques nommées sous-unités pilines. Bien qu’ils aient été décrits comme des organelles de surface jouant un rôle dans l’adhésion, ils sont également impliqués dans d’autres fonctions comme le transfert d’ADN, la formation de biofilm, la motilité de type « twitching » ou encore l’agrégation cellulaire (Koebnik, 2001 ; Manetti et al., 2007 ; Edwards et al., 2008 ; Mattick, 2002).
Les pili sont présents chez les bactéries à Gram-négatif et à Gram-positif. Cependant, leurs études chez l’un et l’autre de ces microorganismes ne sont pas équivalentes. En effet, les pili des bactéries à Gram-négatif ont été découverts les premiers et restent encore aujourd’hui les mieux décrits et compris. En revanche, peu de choses sont connues sur les pili des bactéries à Gram-positif du fait de leur récente découverte, bien que leur intérêt suscite, de nos jours, de nombreuses recherches.

Les pili des bactéries à Gram-négatif

Les pili des bactéries à Gram-négatif ont été découverts à la fin des années 1940. Depuis, ces structures ont fait l’objet d’intenses recherches et leurs structures, leurs assemblages, leurs régulations et leurs rôles dans la pathogénie sont bien compris.
Classés suivant leur voie d’assemblage, 4 groupes distincts de pili existent : les pili assemblés par la voie « chaperonne/usher », les pili de type IV, les pili curli et les pilis assemblés par la voie chaperonne/usher » alternative (Soto and Hultgren, 1999). Les pili les plus étudiés et les mieux compris sont ceux qui sont assemblés par la voie « chaperonne/usher ». Les gènes requis pour l’assemblage des pili par cette voie sont généralement organisés en opéron. Durant la formation du pilus, les sous-unités pilines sont tout d’abord secrétées dans le périplasme par la voie générale de sécrétion (système Sec). Elles sont ensuite prises en charge par une chaperonne spécifique, évitant ainsi l’assemblage prématuré du pilus dans le périplasme et l’agrégation des sous-unités pilines. Une protéine, localisée dans la membrane externe bactérienne et appelée « usher », sert ensuite de transporteur pour mener la sous-unités piline à l’extérieur de la bactérie et constitue ainsi une plateforme pour l’assemblage du pilus (Sauer et al., 2004). L’assemblage des pili de ce type est schématisé figure 6.
Une des caractéristiques principales de ces pili est qu’ils sont composés de protéines qui sont liées non-covalemment entre elles. De plus, l’adhésine est retrouvée au sommet du pilus. L’assemblage du pilus chez les bactéries à Gram-négatif ne nécessite pas d’activité enzymatique. En effet, la cohésion des sous-unités pilines entre elles se fait par un mécanisme d’échange de brin donneur. Les sous-unités pilines possèdent une structure apparentée à celle des immunoglobulines (Ig) mais incomplète car un des brins β est manquant. La chaperonne, par le biais d’un de ses brins β, vient complémenter le brin manquant de la sous-unité piline. Ensuite, une autre sous-unités piline vient déplacer le brin donneur de la chaperonne et compléter le repliement de type Ig en apportant son extension N-terminale (Scott and Zahner, 2006).

Les pili des bactéries à Gram-positif

Les premiers pili des bactéries à Gram-positif, détectés par microscopie électronique, ont été décrits en 1968 à la surface du pathogène Corynebacterium renale (Yanagawa et al., 1968). Depuis, la présence de pili a été découverte dans d’autres microorganismes : Streptococcus sanguis (Fives-Taylor and Thompson, 1985), Actinomyces naelundii (Cisar et al., 1988), Streptococcus salivarius (Levesque et al., 2001) ou encore Corynebacterium diphteriae (Ton-That and Schneewind, 2003). Récemment, des pili ont été également caractérisés chez les 3 principaux streptocoques pathogènes pour l’homme : Streptococcus pyogenes (Mora et al., 2005), Streptococcus agalactiae (Lauer et al., 2005) et Streptococcus pneumoniae (Barocchi et al., 2006). Les pili des bactéries à Gram-positif jouent un rôle majeur dans l’interaction hôte/pathogène mais également dans la colonisation des tissus.

Structure générale

Deux types de pili ont été identifiés par microscopie électronique chez les bactéries à Gram-positif. Dans un premier cas, de courtes et fines « tiges », de longueur comprise entre 70 et 500 nm et de diamètre de 1 à 2 nm ont été localisées à la surface de S. gordonii, S. oralis et S. sanguis (McNab et al., 1999 ; Willcox and Drucker, 1989 ; Willcox et al., 1989). En revanche, des pili plus longs, de 0,3 à 3m, flexible, de diamètre compris entre 3 et 10 nm, ont été décrits chez les corynebactéries et chez les 3 streptocoques S. pyogenes, S. agalactiae et S. pneumoniae. La figure 7 illustre quelques différences retrouvées entre les pili des bactéries à Gram-négatif et ceux des bactéries à Gram-positif.
Contrairement aux pili des bactéries à Gram-négatif, ceux des bactéries à Gram-positif sont composés de sous-unités pilines liées covalemment entre elles (Ton-That and Schneewind, 2003, 2004). Ces sous-unités ne peuvent donc pas être dissociées les unes des autres par chauffage ou par l’agent SDS. Cette propriété est notamment utilisée pour déterminer si une protéine fait partie du pilus. Une simple analyse en gel SDS permet alors d’étudier la présence de pilus, caractérisée par des bandes protéiques de haut poids moléculaire.
Le corps du pilus est composé de la polymérisation d’une même sous-unité, appelée piline majeure. Des pilines mineures, ou auxiliaires, sont également présentes sur le corps du pilus (au sommet, à la base ou de part et d’autre de la structure du pilus) mais ne sont pas requises pour l’intégrité du pilus (Ton-That and Schneewind, 2003, 2004). Les pili sont ancrés covalemment au peptidoglycane de la bactérie.

Les sortases, enzymes catalysant la formation du pilus

Chez les bactéries à Gram-positif, la biogenèse du pilus nécessite une activité enzymatique qui est réalisée par les sortases et qui va permettre de lier de manière covalente les sous-unités pilines entre elles. Une ou plusieurs sortases peuvent être impliquées dans la formation du pilus. Nous discuterons en détail de ces sortases, ainsi que du mécanisme par lequel elles assemblent le pilus, dans la partie IV de ce manuscrit.

Les pilines majeures et auxiliaires

La polymérisation de la piline majeure en pilus est nécessaire pour que s’insèrent dessus les protéines auxiliaires ; sans polymérisation, ces dernières restent ancrés sur le peptidoglycane. Toutes ces protéines possèdent un motif bien particulier, appelé motif CWSS (Cell Wall Sorting Signal) (figure 8A). Ce signal, localisé en C-terminal, comprend :
– une séquence peptidique appelé motif LPXTG
– un domaine hydrophobe, de longueur variable (15 à 30 résidus)
– une queue chargée positivement, de 4 à 9 résidus dont au moins une arginine.
Il a été montré que le motif CWSS d’une protéine est indispensable pour son ancrage sur le peptidoglycane bactérien (Schneewind et al., 1992). Ainsi, la queue chargée positivement évite l’excrétion totale de la protéine et le domaine hydrophobe permet l’ancrage de la protéine à la membrane cytoplasmique (figure 8B). Le motif LPXTG, quant à lui, permet la reconnaissance de la protéine par les sortases provoquant son attachement sur les autres protéines du pilus et/ou sur le peptidoglycane. En absence de motif LPXTG, la protéine reste ancrée sur la membrane (Schneewind et al., 1993).
Les sous-unités pilines possèdent également un peptide signal situé du côté N-terminal leur permettant d’être exportée via le système Sec. Ce peptide signal est composé de 1 à 3 résidus chargé positivement (domaine N), suivis d’une région hydrophobique de 10 à 15 résidus (domaine H) puis d’une région polaire qui constitue le site de clivage (domaine C). La sous-unité piline est synthétisée dans le cytoplasme bactérien et va être transloquée à travers la membrane cytoplasmique grâce à la machinerie cellulaire Sec (figure 8B). Cette dernière est composée d’un complexe protéique membranaire (SecYEG) et d’une protéine périphérique (SecA) fournissant l’énergie nécessaire au transport. Une signal-peptidase, liée à la membrane cytoplasmique, intervient pour cliver le peptide signal de la protéine précurseur dans le périplasme (Driessen and Nouwenn, 2008).
Toutefois, deux autres motifs sont également distinguables et importants pour l’attachement des protéines du pilus entre elles. Il s’agit du motif piline et du motif E-Box (Ton-That and Schneewind, 2003 ; Ton-That et al., 2004) (figure 8A). Le motif piline, composé de la séquence peptidique WXXXVXVYPKN, n’est présent et conservé que dans les protéines majeures. La lysine de ce motif joue un rôle crucial : le remplacement de cette lysine dans la protéine majeure de C. diphteriae abolit la polymérisation du corps du pilus (Ton-That et al., 2004). Cette lysine est pontée à la thréonine du motif LPXTG d’une sous-unité suivante, via l’activité sortasique, et permet ainsi à deux pilines majeures d’être liée covalemment entre elles et de constituer ainsi, au fur et à mesure, le corps du pilus. Le motif E-Box, dont la séquence peptidique YXLXETXAPXGY comporte un glutamate hautement conservé, n’est également présent que dans les pilines majeures. Il a été suggéré que ce motif jouait un rôle dans l’attachement des pilines auxiliaires sur le pilus, bien que le mécanisme exact reste encore inconnu. La mutation du glutamate du motif E-Box dans la piline majeure de C. diphteriae abolit effectivement l’incorporation de la piline mineure sur la structure du pilus (Ton-That et al., 2004). Il est à noter que les sous-unités auxiliaires peuvent éventuellement se retrouver localisées sur le peptidoglycane et non sur le pilus, comme cela est le cas chez S. agalactiae (Krishnan et al., 2007). Bien que le rôle des pilines mineures n’ait pas été entièrement analysé, il semblerait qu’elles puissent jouer le rôle d’adhésine (Nelson et al., 2007 ; Mandlik et al., 2007 ; Krishnan et al., 2007).

Quelques exemples de pili de bactéries à Gram-positif

Corynebacterium diphteriae

C. diphteriae, agent causal de la diphtérie, est un des premiers organismes où la présence de pili a été décrite (Yanagawa and Honda, 1976). Trois types de pili sont présents à sa surface : pili SpaA, pili SpaD et pili SpaH (pour Sortases-mediated pili assembly). Ces pili sont nommés suivant la piline majeure qui les structure. Ainsi, les pili SpaA sont composés de la protéine SpaA qui est polymérisée pour former le corps du pilus et de pilines auxiliaires SpaB, localisée à intervalles réguliers le long du pilus, et SpaC, située au sommet du pilus (Ton-That and Schneewind, 2003). Trois clusters qui incluent les gènes codant pour les sous-unités pilines et les sortases sont présents chez C. diphteriae (figure 9).
La présence de multiples sortases pose la question de la spécificité de substrats. Le rôle de certaines sortases de C. diphteriae a été ainsi investi. La sortase A (SrtA) a été montrée comme essentielle à l’assemblage des pili de type SpaA ; SrtA polymérise la piline majeure SpaA en pilus (Ton-That and Schneewind, 2003). Au niveau du second opéron, aussi bien SrtB que SrtC sont capables de polymériser la piline majeure SpaD en pilus. Cependant, seule SrtB est requise pour l’incorporation de la piline auxiliaire SpaE sur le pilus (Gaspar and Ton-That, 2006). Un gène additionnel codant pour la sortase F (ou SrtF) est localisé dans le génome en dehors des 3 opérons mentionnés ci-dessus. SrtF, quant à elle, est requise pour l’ancrage du pilus sur le peptidoglycane, mais n’intervient pas dans son assemblage (Swaminathan et al., 2007).
Les pili de C. diphteriae, et plus précisément les pilines mineures SpaB et SpaC, sont impliqués dans l’adhérence et la colonisation des cellules humaines pharyngeales (Mandlik et al., 2007).

Streptococcus agalactiae

Ce streptocoque colonise principalement, de façon asymptomatique, les tractus digestif et génital de l’homme. Cependant, il peut être la cause d’infections invasives, comme la septicémie ou la méningite, dans trois populations distinctes : les nouveau-nés, les femmes enceintes et les personnes de plus de 65 ans ou immunosupprimées.
Figure 10 : Ilots de pathogénicité groupant les gènes du pilus chez S. agalactiae, d’après (Mandlik et al., 2007). Les gènes codant pour les sortases sont représentés en noir, ceux codant pour les pilines majeures en rouge et ceux codant pour les pilines mineures en bleu. En gris sont représentés les gènes non caractérisés. Les rectangles bleus se référent à des séquences d’insertions.
Deux types de pili, dont les composants sont codés par les îlots PI-1 et PI-2, sont présents à la surface de S. agalactiae. Suivant les souches, les deux îlots peuvent être distribués simultanément ou non. L’îlot PI-1, représenté en figure 10, code pour deux sortases et 3 sous-unités pilines. Le corps du pilus est formé par la polymérisation de la piline majeure gbs80 tandis que les protéines gbs52 et gbs104 sont localisées de part et d’autre du pilus (Lauer et al., 2005). En ce qui concerne le second type de pilus, gbs59 est polymérisée pour former le corps du pilus sur lequel est insérée gbs67 et gbs150 (Rosini et al., 2006).
Chez S. agalactiae également le rôle des sortases dans la formation du pilus a été étudié. L’une ou l’autre des sortases srt647 et srt648 est requise pour polymériser gbs80. srt647 est, de plus, impliquée dans l’incorporation de gbs52 sur la structure du pilus alors que srt648 est, elle, impliquée dans l’incorporation de gbs104. En ce qui concerne le pilus codé par l’îlot PI-2, les sortases sag1405 et sag1406 sont capables, toutes les deux, de polymériser gbs59 pour former le corps du pilus. Néanmoins, sag1405 est spécifique de l’incorporation de gbs67 sur le pilus et sag1406 spécifique de l’incorporation de gbs150 (Rosini et al., 2006).
Il a été montré que les pili de S. agalactiae jouent un rôle dans l’adhérence de la bactérie ainsi que dans son invasion au niveau du cerveau (Maisey et al., 2007). Gbs52 a été la première piline mineure d’un pilus d’une bactérie à Gram-positif dont la structure cristallographique a été résolue (Krishnan et al., 2007). Cette protéine possède deux domaines, N1 et N2, ayant un repliement type immunoglobuline. Chaque domaine comprend 7 brins β antiparallèles qui s’assemblent pour former un tonneau β (figure 11). Le domaine N1 est suffisant pour permettre l’adhésion sur les cellules épithéliales pulmonaires.

Table des matières

INTRODUCTION
I. Streptococcus pneumoniae
I.1. Présentation
I.2. Un pathogène pour l’homme
I.2.1. Les infections associées
I.2.2. Le processus de l’infection
I.3. Les traitements disponibles
I.3.1. Les vaccins
I.3.2. Les antibiotiques
II. Les facteurs de virulence du pneumocoque
II.1. Les polysaccharides capsulaires
II.2. La paroi bactérienne
II.3. Les protéines pneumococciques
II.3.1. La protéine de surface PspA
II.3.2. L’adhésine CbpA
II.3.3. La pneumolysine
II.3.4. La neuraminidase
II.3.5. La hyaluronidase
II.3.6. L’autolysine LytA
II.4. Les pili
III. Les pili, organelles de surface bactériens
III.1. Les pili des bactéries à Gram-négatif
III.2. Les pili des bactéries à Gram-positif
III.2.1. Structure générale
III.2.2. Les sortases, enzymes catalysant la formation du pilus
III.2.3. Les pilines majeures et auxiliaires
III.2.4. Quelques exemples de pili de bactéries à Gram-positif
III.2.4.1. Corynebacterium diphteriae
III.2.4.2. Streptococcus agalactiae
III.2.4.3. Streptococcus pyogenes
III.2.4.4. Streptococcus pneumoniae
IV. Les sortases et l’art d’accrocher des protéines cibles à la paroi bactérienne
IV.1. Classification des sortases
IV.1.1. Les sortases de classe A (SrtA)
IV.1.2. Les sortases de classe B (SrtB)
IV.1.3. Les sortases de classe C (SrtC)
IV.1.4. Les sortases de classe D (SrtD)
IV.2. Informations structurales sur les sortases ancrant des protéines cibles sur la paroi bactérienne
IV.2.1. Le repliement des sortases de classes A et B
IV.2.2. L’historique controversé du site actif
IV.2.3. La triade catalytique
CONTEXTE ET OBJECTIF DES TRAVAUX
MATERIEL ET METHODES
I. Biologie moléculaire
I.1. Clonage
I.2.1. Construction des mutants SrtC-1C193A, SrtC-1H131D, SrtC-R202E, SrtC-1D58GW60G, SrtC-1D58GW60GC193A
I.2.2. Construction des mutants SrtC-1_lid2 et SrtC-2_lid1
II. Biochimie
II.1. Surexpression de la protéine d’intérêt
II.2. Purification de la protéine d’intérêt
II.2.1. Chromatographie d’affinité sur colonne HisTrapTMHP
II.2.2. Coupure de l’étiquette hexahistidine
II.2.3. Chromatographie d’exclusion de taille
II.2.4. Production de SrtC-1 et RrgB séléniées
II.3. Formation in vitro des fibres de RrgB
III. Analyses biophysiques
III.1. Spectrométrie de masse
III.2. Séquençage protéique N-terminal
III.3. Étude de la thermostabilité des protéines par fluorescence : Thermal Shift Assay (TSA)
III.3.1. Principe
III.3.2. Acquisition des données
III.4. Microscopie électronique
III.4.1. Principe
III.4.2. Analyse des fibres de RrgB
IV. Études cristallographiques des protéines SrtC-1, SrtC-3 et RrgB
IV.1. Introduction à la cristallographie des rayons X
IV.1.1. Cristallogenèse
IV.1.2. Le principe de diffraction des rayons X par un cristal de protéine
IV.1.2.1. Note préliminaire sur les cristaux de protéines
IV.1.2.2. Diffraction des rayons X par les protéines du cristal
IV.1.2.3. Facteur de structure et densité électronique
IV.1.3. Détermination des intensités de diffraction
IV.1.4. Résolution du problème de phase
IV.1.4.1. Préambule : la loi de Friedel
IV.1.4.2. La diffusion anomale
IV.1.4.3. Le remplacement moléculaire
IV.1.5. Construction du modèle et affinement
IV.1.6. Analyse des structures
IV.2. Cristallogenèse et cristallographie de SrtC-1
IV.2.1. Cristallogenèse de SrtC-1
IV.2.2. Enregistrement des données de diffraction
IV.2.3. Structure de SrtC-1
IV.3. Cristallogenèse et cristallographie de SrtC-3
IV.3.1. Cristallogenèse de SrtC-3
IV.3.2. Structure de SrtC-3
IV.4. Cristallogenèse et cristallographie de RrgB
IV.4.1. Cristallogenèse de RrgB
IV.4.2. Enregistrement des données de diffraction
RESULTATS ET DISCUSSION
I. Etude fonctionnelle des composants du pilus de S. pneumoniae
I.1. Rôle des sortases SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3 dans la polymérisation de RrgB
I.1.1. Analyse in vitro
I.1.2. Analyse in vivo
I.2. Caractérisation des fibres de RrgB formées in vitro
I.2.1. Purification des fibres
I.2.2. Spectrométrie de masse des fibres
I.2.3. Microscopie électronique des fibres
II.1. Structure de SrtC-1
II.1.1. Production de SrtC-1
II.1.2. Cristallogenèse de SrtC-1
II.1.3. Production de cristaux de SrtC-1 séléniée
II.1.4. Résolution de la structure de SrtC-1
II.1.4.1. Collecte des données natives et séléniées
II.1.4.2. Traitement des données
II.1.5. Analyse de la structure de SrtC-1
II.1.5.1. Structure globale de SrtC-1
II.1.5.2. Site actif de SrtC-1
II.2. Structure de SrtC-3
II.2.1. Production de SrtC-3
II.2.2. Cristallogenèse
II.2.3. Résolution de la structure
II.2.4. Analyse de la structure de SrtC-3
II.2.4.1. Structure globale de SrtC-3
II.2.4.2. Site actif
II.3. La structure des sortases formant le pilus se distinguent des structures de sortases classiques
III. Caractérisation de la région du site actif de SrtC-1
III.1. Étude du couvercle de SrtC-1
III.1.1. Activité du mutant du couvercle SrtC-1D58GW60G
III.1.2. Stabilité thermique des mutants du couvercle SrtC-1D58GW60G et SrtC-1D58GW60G
III.1.3. Analyse des mutants SrtC-1_lid2 et SrtC-2_lid1
III.2. Étude du site actif de SrtC-1
III.2.1. Activité des mutants du site actif
III.2.2. Stabilité thermique des mutants
IV. Formation in vitro d’un complexe covalent entre SrtC-1 et RrgB
V. Étude structurale de RrgB
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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