Les sites d’interactions de l’ARN sur Rho

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Régulation de la transcription 

La transcription est un mécanisme essentiel extrêmement bien régulée. La bactérie orchestre un réglage précis du niveau d’expression de la plupart de ses gènes afin d’avoir une quantité de protéine suffisante. Ces différentes régulations jouent un rôle majeur dans l’aptitude de la cellule à s’adapter à des changements environnementaux.

Régulation de l’initiation de la transcription 

Un des moyens de réguler l’expression d’un gène est d’altérer l’initiation de sa transcription. Ce phénomène peut se faire de deux manières : en l’inhibant ou en permettant son activation. Ce mécanisme peut être effectué grâce à des éléments de séquences présents sur l’ADN et/ou à l’aide de facteurs protéiques.

Facteur Anti-σ

Comme nous l’avons vu précédemment, la cellule utilise différents promoteurs afin de pouvoir exprimer certains gènes au moment opportun. Le nombre de facteurs σ disponible impacte directement l’initiation de la transcription. Afin de moduler la quantité de facteurs disponibles, la cellule peut utiliser des protéines spécifiques appelées facteur anti-σ. Ces protéines se lient de manière spécifique aux facteurs sigma et inhibent par conséquent l’expression des gènes dépendant de ces mêmes facteurs [62]. Ce mécanisme permet ainsi d’inhiber l’expression d’un ensemble de gènes dont les promoteurs sont spécifiques de ces facteurs σ (Figure 2).

Facteur de transcription

La cellule utilise également un grand nombre de protéines nommées facteurs de transcription. Plus de 300 ont été identifiés chez E.coli. Ces derniers interagissent avec une séquence d’ADN nommée opérateur, généralement proche du promoteur cible. Cette interaction modifie ainsi l’activité du promoteur en l’activant soit en le réprimant [63]. Les répresseurs empêchent la fixation de l’ARN polymérase alors que les activateurs améliorent l’affinité du promoteur pour cette même enzyme. Les facteurs de transcription régulent un nombre variable des gènes allant de 1 à plusieurs centaines. Cela permet de réguler de façon synergique l’expression d’un ensemble de gènes d’une même voie métabolique. Parmi ce grand nombre de facteurs de transcription, il existe sept facteurs généraux de la transcription (Lrp, IHF, Fis, FNR, CRP, ArcA et NarL) qui régulent près de la moitié des gènes d’E. coli.

Les activateurs transcriptionnels

Ces facteurs de transcriptions vont agir de manière positive sur l’initiation de la transcription en se liant au promoteur ou à l’ARN polymérase afin de faciliter leurs activités. Les différentes études réalisées autour de ces protéines ont permis d’identifier 3 classes d’activateurs transcriptionnels :
– L’activateur de classe 1 se lie à son opérateur en amont de l’élément « -35 » du promoteur cible et favorise le recrutement de l’ARN polymérase par des interactions avec sa sous-unité α et plus particulièrement l’ α-CTD [64].
– L’activateur de classe 2 favorise le recrutement de l’ARN polymérase en améliorant la reconnaissance du promoteur par le facteur σ. L’activateur interagit avec son opérateur présent au niveau de l’élément « -35 » du promoteur cible et avec le domaine σ4 du facteur sigma [65].
– L’activateur de classe 3 remodèle l’architecture du promoteur. Il se lie à son opérateur qui est situé entre les éléments « -35 » et « -10 » du promoteur et réorganisée ce dernier afin d’optimiser la distance séparant ces deux éléments [66].

Les répresseurs transcriptionnels

À l’inverse des activateurs transcriptionnels, les répresseurs, en se liant au promoteur ou à l’ARN polymérase, vont inhiber l’initiation de la transcription. Ces derniers vont agir de différentes manières afin d’exercer leurs activités répressives :
– En se liant à son opérateur, le répresseur va empêcher l’ARN polymérase de se lier au promoteur par des phénomènes d’encombrements stériques [67].
– À l’inverse des activateurs de classe 3, la fixation du répresseur sur son opérateur modifie l’architecture du promoteur et ainsi diminuer l’affinité du facteur σ pour ce dernier [68].
– La fixation du répresseur sur son opérateur bloque la liaison d’un activateur à sa cible et ainsi inhiber son activation [68].
Les promoteurs peuvent avoir un certain nombre d’opérateurs et donc être régulés par plusieurs facteurs de transcriptions différents. Cette pléiade de possibilités permet de moduler l’expression d’un gène de multiples manières, soit de façon coopérative, synergique ou antagoniste. Ces situations complexes permettent d’adapter le niveau d’expression d’un gène en réponse à un ou plusieurs signaux environnementaux.

Régulation de la terminaison de la transcription

À juste titre, la régulation de la transcription se fait en grande partie au niveau de l’initiation. Mais il existe également des mécanismes précis qui permettent de moduler l’expression d’un gène en aval du processus d’initiation. Parmi ces mécanismes, la terminaison précoce de la transcription est une des stratégies utilisées par les bactéries.
Au cours de l’évolution, les différents organismes ont mis en place un grand nombre de signaux permettant la régulation de la terminaison. Ces signaux peuvent être classés en deux catégories bien distinctes : l’atténuation et l’anti-terminaison de la transcription [69].

Le phénomène d’atténuation de la transcription :

L’atténuation, ou terminaison prématurée de la transcription correspond au contrôle de la transcription d’un ou plusieurs gènes proches les uns des autres par la régulation de la terminaison. Ce mécanisme dépend de séquences d’ARN capables de former des structures alternatives nommées anti-terminateurs et terminateurs. Les deux structures, anti-terminatrice et terminatrice, partagent une partie de leurs séquences de sorte que leurs formations soient mutuellement exclusives [70-72].
La plupart des opérons impliqués dans la synthèse ou l’utilisation des acides aminés sont régulés au niveau transcriptionnel par ce type de mécanisme. D’ailleurs, ce type de mécanisme a été identifié lors de l’étude de l’opéron trp permettant la synthèse du tryptophane (Trp) chez E.coli ainsi que dans la régulation de l’opéron his, permettant la synthèse de l’histidine (His), chez S. Typhimurium [73,74]. Dans ces opérons, le phénomène d’atténuation est régulé par la concentration intracellulaire de leurs propres produits, dans ce cas, les acides aminés tryptophane et histidine respectivement. Cette régulation est caractérisée par la présence d’une région « leader » présente en amont du premier gène de l’opéron. Cette région « leader » contient une phase ouverte de lecture (ORF) permettant la synthèse d’un petit peptide ou peptide leader. Ce dernier contient plusieurs codons de l’acide aminé synthétisé par l’opéron. Dans le cas de l’opéron his, le petit peptide codé par la région leader contient sept codons His répétés en tandem [74]. Lorsque l’histidine est en excès dans la cellule, la traduction du peptide leader est couplée à la transcription de l’ARN. Ce couplage entraine la formation d’un terminateur de la transcription Rho-indépendant qui inhibe la transcription du reste de l’opéron his. À l’inverse, lorsque la cellule est en pénurie d’histidine, le ribosome n’arrive pas à synthètiser le peptide leader, ce qui entraine un découplage de la traduction et de la transcription. Ce découplage permet la formation de l’anti-terminateur. Cette structure inhibe la formation du terminateur intrinsèque et permet à l’ARN polymérase de continuer la transcription de l’intégralité de l’opéron his (Figure 4) [74].

L’anti-terminaison processive de la transcription

À la différence du phénomène d’atténuation, ce mécanisme agit sur le complexe d’élongation par des interactions directes avec des protéines ou des acides nucléiques. Ces modifications affectent la terminaison intrinsèque, mais peuvent également altérer l’activité de la protéine Rho. À l’inverse du phénomène d’atténuation, l’anti-terminaison est un mécanisme processif, c’est-à-dire que l’ARN polymérase peut résister à des terminateurs situés loin en aval du signal d’anti-terminaison. Ce mécanisme a été découvert, dans un premier temps, chez le phage λ. Par la suite, il a également été mis en évidence dans la régulation de certains opérons bactériens dont notamment les opérons rrn codant pour les ARN ribosomaux et certains ARN de transfert (ARNt) [75-77].Chez E. coli, la biosynthèse des ribosomes consomme environ 50 % de l’énergie disponible chez la bactérie en phase exponentielle de croissance [78]. La synthèse des ARN et des protéines composant les ribosomes doit donc être extrêmement bien régulée. De plus, malgré la présence de nombreux terminateurs Rho-dépendants et l’absence de traduction de ces ARN, ces opérons ne sont pas soumis au phénomène de polarité [79,80]. Cette absence de polarité transcriptionnelle peut être liée à un mécanisme d’anti-terminaison. Chez E.coli, l’anti-terminaison de la transcription fait intervenir les protéines NusA, NusB, NusG ainsi que la protéine ribosomale S10 (codé par le gène nusE) en plus de l’ARN polymérase. [81-83] Bien que ces protéines soient indispensables pour réaliser l’anti-terminaison, elles ne sont pas suffisantes [84,85]. Ceci indique qu’il existe d’autres facteurs intervenant dans ce mécanisme [86]. L’étude de l’opéron rrn a pu mettre en évidence deux structures conservées composées d’une séquence conservée de 12 nucléotides (UGCUCUUUAACA) nommée BoxA, localisée entre les gènes codant les ARNr 16S et 23 S. La seconde séquence nommée BoxB forme une structure en tige-boucle, présente à 10nt en aval du promoteur P2 de l’opéron rrn [87]. NusB reconnait la séquence BoxA et s’y fixe grâce à la protéine S10 [88]. Ceci initie la création d’un complexe multiprotéique qui va stabiliser le complexe d’élongation et former le complexe d’anti-terminaison. Ce nouveau complexe peut maintenant franchir les terminateurs Rho-dépendant, mais pas les terminateurs intrinsèques [89,90]Le facteur de terminaison de la transcription Rho
Le facteur de terminaison de la transcription Rho a été découvert en 1969 à partir d’un extrait bactérien par Roberts JW. Il a, dans un premier temps, été identifié comme un facteur protéique capable de modifier la taille de transcrit d’ARN du phage λ au cours de synthèse in vitro [75]. De nombreuses études ont suivi cette découverte du facteur Rho et ont permis de mettre en évidence son rôle dans la terminaison de la transcription d’un grand nombre d’ARN [49,56,91]. Le facteur Rho est une protéine très bien conservée et est présente dans environ 90 % des espèces bactériennes séquencées [92]. Pourtant il existe des différences sur la nécessité de ce facteur entre ces différentes espèces. En effet, le facteur Rho est une protéine essentielle chez E. coli et S. Typhimurium, il en est tout autre chez B. subtilis et S. aureus où cette même protéine peut-être supprimée sans engendrer une mort cellulaire [13,93-96]. Cette différence de sensibilité au facteur Rho ne semble pas être dû à une différence de fonction puisque des expériences de complémentations ont montré que le facteur Rho de S. aureus est capable de remplacer ce même facteur chez E. coli [96].
Au cours de ce chapitre, nous allons analyser le facteur Rho ainsi que sa fonction.

Structure 

Bien avant l’obtention de structure cristallographique de la protéine Rho, les études, à partir de l’image obtenue à l’aide d’un microscope électronique, ont montré que la protéine Rho forme un hexamère dont les différentes sous-unités forment un anneau de 120Å de diamètre doté d’un pore central d’une taille de 30Å (Figure 6) [97,98]. Par la suite, le séquençage du gène rho a permis de mieux appréhender la structure ainsi que certaine propriété physico-chimique de la protéine [99]. Rho est une protéine de 419 acides aminés et est composé de deux domaines fonctionnels distincts, le domaine N-terminal et le domaine C-terminal, relié par un linker [100,101]. Le domaine N-terminal, correspondant aux 130 premiers acides aminés de la protéine, a pour fonction la liaison de la protéine à l’ARN (Figure 5) [102,103]. Ce dernier possède des motifs similaires à ceux qui peuvent être trouvés dans différentes classes de protéines se liant à l’ARN [51]. Le domaine C-terminal, constitué des 268 derniers acides aminés, intéragit également avec l’ARN mais possèdent également une fonction ATPase, indispensable à son rôle dans la terminaison de la transcription (Figure 5) [104-106].
L’obtention de la structure cristallographique de la protéine Rho a confirmé et complété les différentes informations obtenues au cours des précédentes études et a ainsi offert une meilleure compréhension de la structure et de la conformation de la protéine Rho [26]. La cristallisation du domaine N-terminal a permis de mieux comprendre son organisation ainsi que sa fonction. Notamment la structure des 50 premiers résidus qui sont organisés dans une série de 3 hélices α terminée par un tonneau β caractéristique des motifs «OB» (oligosaccharide/oligonucleotide-binding) [107]. Le domaine C-terminal possède, quant à lui, différents motifs structuraux présentant différentes caractéristiques. Le premier de ces motifs structuraux est homologue à ceux retrouvés dans différentes ATPases [108]. Il s’agit de la P-loop qui est formée entre le feuillet β6 et l’hélice α7 [59]. Ce domaine possède également un site secondaire d’interaction aux ARN (ou SBS : « Secondary RNA Binding Sites ») constitués de deux motifs structuraux : Q et R-loops [109].
Figure 5 : Structure du protomère de Rho.
Structure cristallographique du protomère de la protéine Rho (PDB = 2HT1) [13]. Le domaine N–terminal est représenté en bleu, le domaine C–terminal est représenté en rouge. Les Q–R et P–loop sont représentés respectivement en magenta, vert et cyan.
Comme vu précédemment, Rho est une protéine fonctionnelle sous la forme d’homohexamère composé en trimères de dimères qui peut adopter différentes conformations en fonction de son ligand [13,14,26]. Lors de l’acquisition de la première structure quaternaire de Rho, il a pu être identifié un écart de 12Å entre les protomères A et F au niveau de pore central laissant ouvert la structure sous forme d’anneau (Figure 6 A et C) [26]. Cette ouverture permettrait le passage du transcrit d’ARN en cours de synthèse. Par la suite, une structure de la protéine Rho a été obtenue sous une forme d’anneau fermé (Figure 6 B et D) [13]. Cette modification de structure entrainant la fermeture de l’anneau de Rho serait due à une rotation de l’ensemble des sous-unités de la protéine [13]. Ces deux structures, ouvertes
Figure 6 : Structure de l’hexamère de la protéine Rho.
Les différentes formes de la structure de l’hexamère de la protéine ont été obtenues à partir de différentes techniques, mais présentent des résultats similaires. A–B : Images obtenues à partir d’un microscope électronique de l’hexamère de la protéine Rho sous forme d’un anneau ouvert A) et d’un anneau fermé B) [25] . C–D, Structure cristallographique de l’hexamère de la protéine Rho sous forme d’un anneau ouvert C) (PDB = 1PV4) et d’un anneau fermé D) (PDB = 3ICE) [5,14,26]. Chacun des monomères est représenté avec une couleur différente et fermées, confirmaient les résultats obtenus précédemment grâce à la microscopie électronique (Figure 6 A et B) [25]. La dernière structure obtenue de la protéine Rho présente une conformation différente pour ces différentes sous-unités [14]. Ensemble, ces différentes structures proposent différentes conformations que peut adopter la protéine en fonction de ses ligands.

Interaction de Rho avec l’ARN

Le facteur Rho est une protéine essentielle chez les entérobactéries intervenant dans la terminaison de la transcription de l’ARN. Ce mécanisme nécessite une interaction directe entre la protéine Rho et l’ARN en cours de transcription. De nombreuses études ont permis de mieux comprendre comment se font ces interactions.
Comme dit précédemment, le domaine N-terminal de la protéine Rho contient des motifs qui lui permettraient de se lier à l’ARN. Les structures du domaine N-terminal en présence ou en absence d’ARN ont mis en évidence la présence d’un motif «OB» caractéristique des domaines de liaisons aux ADN / ARN simple brin [107,110,111]. In vitro, Rho a démontré une forte affinité pour les séquences d’ARN poly(C) qui stimulent son activité ATPase [104]. L’obtention d’une structure cristalline du domaine N-terminal de Rho lié à un oligonucléotide composé de 9 cytosines a permis de mieux comprendre l’affinité de Rho pour ce type de séquences [110]. Différentes études utilisant de grandes variétés de substrats ARN ont permis de mieux comprendre les interactions entre Rho et l’ARN [110,112]. En particulier, l’étude de la terminaison de la transcription de deux ARNm ont permis d’avancer grandement dans la compréhension de ces interactions : les ARNm trp t’ et λ cro [53,113-115].

Table des matières

I) Introduction
La transcription
Les acteurs de la transcription
L’ARN polymérase
Les facteurs sigma
Le promoteur
Mécanisme de la transcription
Initiation de la transcription
Élongation de la transcription
Terminaison de la transcription
Régulation de la transcription
Régulation de l’initiation de la transcription
Régulation de la terminaison de la transcription
Le facteur de terminaison de la transcription Rho
Structure
Interaction de Rho avec l’ARN
Les sites d’interactions de l’ARN sur Rho
Le site d’interaction de Rho sur l’ARN
Activité ATPase de Rho
Activité Hélicase de Rho
Modèle de terminaison Rho-dépendante
La traduction
Les acteurs de la traduction,
L’Acide RiboNucléique messager
Le ribosome
L’ARN de transfert
Autres facteurs
Mécanisme de la traduction
Initiation de la traduction
Élongation de la traduction
Terminaison de la traduction
Régulation de la traduction
Régulation de l’initiation de la traduction
Protéine inhibitrice de la traduction
Régulation de la traduction par des molécules d’ARN
Les ARN régulateurs bactériens
LES ARN CRISPR
Les ARN agissants en cis
Les riboswitchs
Les thermosenseurs
Les petits ARN régulateurs bactériens
Les petits ARN régulateurs ciblant les protéines
Les petits ARN régulateurs en cis
Les petits ARN régulateurs en trans
RyhB et l’homéostasie du fer
GcvB et les acides aminés
ChiX et les chitosucres
La protéine chaperonne d’ARN Hfq
Expression et régulation
Structure
Interaction avec les ARN
Site d’interaction
Hfq et l’inhibition du facteur Rho
Hfq et les ribonucléases
Protéine chaperonne
Régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs
Hfq et la virulence
Interaction avec l’ADN
II) Résultats
Étude de la régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs : Rôle des 1.sites de fixation d’Hfq
Introduction
Étude préliminaire : Étude du rôle des sites de fixation d’Hfq aux ARN par 1.2)l’intermédiaire de chimères
Étude préliminaire : ARNm chimères
Étude préliminaire : Chimères de petits ARN régulateurs
Étude préliminaire : Fusion des chimères
Article 1 : Distinct Pathways of Hfq:mRNA recognition revealed by the 1.3)analysis of sRNA targeted mini mRNA chimeras
Étude complémentaire : Rôle de la structure en tige-boucle en aval du site 1.4)de fixation d’Hfq
Étude complémentaire : Formation du complexe ternaire ARNm : Hfq : 1.5)petit ARN régulateur in vitro
Étude complémentaire : Rôle du domaine C-terminal d’Hfq dans la 1.6)régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs.
Polarité transcriptionnelle dans la régulation par ChiX de l’opéron chiPQ
Introduction
Article 2 : A role for Rho-dependent polarity in gene regulation by a non-2.2)coding small RNA
Conclusion et perspectives
La répression de l’opéron dppABCDF de S. Typhimurium par GcvB implique-t-3.elle un mécanisme de polarité Rho-dépendant ?
L’opéron dppABCDF
Approches expérimentales mises en oeuvre pour tester l’hypothèse
Participation du facteur Rho dans la régulation de l’expression de l’opéron 4.pgaABCD d’Escherichia coli.
Introduction
Article 3 : RNA remodeling by bacterial global regulator CsrA promotes 4.2)Rho-dependent transcription termination
Caractérisation de la terminaison Rho-dépendante
La régulation de l’opéron chiPQ par le petit ARN ChiX comme modèle pour 5.1)la caractérisation de la terminaison Rho-dépendante NusG-dé
La position du site rut au sein de la séquence de l’ARNm chiPQ influence-t-5.1.1)elle la terminaison de la transcription Rho-dépendante
La terminaison Rho-dépendante NusG-dépendante du site rut de chiP est 5.1.2)fonctionnelle même accolée au +5 de transcription.
Etude de la différence d’activité entre le site rut cryptique de chiP chez S. 5.2)Typhimurium et E. coli.
III) Discussion
Étude de la régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs : Rôle des 1.sites de fixation d’Hfq
Étude de la terminaison prématurée Rho-dépendante
Caractérisation de la terminaison Rho-dépendante
IV) Matériels et Méthodes
Matériel
Conditions de cultures
Plasmides et ADN matrices
Constructions de souches
Étude de la régulation des ARNm par les petits ARN régulateurs : Rôle des 1.3.1)sites de fixation d’Hfq
La répression de l’opéron dppABCDF de S. Typhimurium par GcvB implique-t -1.3.2)elle un mécanisme de polarité Rho-dépendant ?
Caractérisation de la terminaison Rho-dépendante
Techniques génétiques
Transduction généralisée
Préparation du lysat transducteur
Protocole de transduction
Ingénierie du chromosome
Préparation et transformation de cellules électrocompétentes
Méthode de recombinaison médiée par λ Red.
Variation sur la technique de recombinaison λ Red
Génération de fusion lacZ dans un site spécifique
Techniques Biochimiques
Dosage de l’activité β-galactosidase
Techniques de Biologie Moléculaire
Extraction d’ARN
Analyse des ARN par Northern Blot.
Radiomarquage des oligonucléotides.
Transcription et radiomarquage in vitro d’ARN.
Expérience d’interaction ARN : ARN in vitro en retard sur gel
Expérience d’interaction ARN : Hfq : ARN in vitro en retard sur gel
BIBLIOGRAPHIE
V) ANNEXES
Annexe 1 : Structure des ARNm chimères
Annexe 2 : Structure des petits ARN régulateurs chimériques.
Annexe 3 : Liste des souches et leurs génotypes par thématique
Annexe 4 : Liste des oligonucléotides par thématique

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