Les ribosomes eucaryotes
Le ribosome est un complexe macromolรฉculaire qui catalyse la synthรจse protรฉique ร partir du dรฉcodage de lโinformation gรฉnรฉtique contenue dans les ARN messagers (ARNm). Cโest une machine molรฉculaire ribonuclรฉoprotรฉique universelle, composรฉe dโARN ribosomiques (ARNr) et protรฉines ribosomiques (RP). Les ribosomes ont รฉtรฉ dรฉcouverts en 1955 par George E. Palade (Palade., 1955) avec l’observation de particules globulaires autour de la membrane du rรฉticulum endoplasmique en microscopie รฉlectronique en transmission. Par la suite, de nombreuses รฉtudes biochimiques et fonctionnelles ont รฉtรฉ entreprises afin de mettre en lumiรจre la composition et la fonction de ces complexes dans la synthรจse protรฉique (Mcquillen et al., 1959 ; Palade 1975). Au cours des annรฉes 1980-90, la recherche sur la structure des ribosomes a rapidement progressรฉe, grรขce en particulier ร la cryo microscopie รฉlectronique en transmission (cryo-EM) (Dubochet et al., 1988). Mais cโest au dรฉbut des annรฉes 2000 que des รฉtudes en cristallographie aux rayons X ont rรฉvรฉlรฉ la structure tridimensionnelle de ribosomes bactรฉriens ร l’รฉchelle atomique. Ces travaux ont permis dโรฉlucider la premiรจre structure des ribosomes procaryotes chez lโarchaebactรฉrie Haloarcula marismortui et la bactรฉrie Thermus Thermophilus, ร haute rรฉsolution (Ban et al., 2000 ; Yusupov et al., 2001). Ces modรจles ont contribuรฉ notamment ร une comprรฉhension plus prรฉcise du rรดle enzymatique de lโARNr dans la synthรจse protรฉique. En effet, la structure atomique de la grande sous-unitรฉ ribosomique 50S a mis en รฉvidence que le site actif du ribosome, qui catalyse la rรฉaction de synthรจse des liaisons peptidiques, n’est en effet composรฉ que par l’ARN ribosomique (Nissen, 2000 ; BAN, 2000 ; Muth, 2000). De ce fait, le ribosome s’est rรฉvรฉlรฉ รชtre un vรฉritable ribozyme.
La structure et la composition des ribosomes eucaryotesย
Les ribosomes sont composรฉs de deux sous-unitรฉs de tailles et de morphologies distinctes, appelรฉes communรฉment petite et grande sous-unitรฉs. Chez les eucaryotes, la petite sous-unitรฉ est gรฉnรฉralement nommรฉe 40S (S, pour le coefficient de sรฉdimentation Svedberg) et la grande sous-unitรฉ 60S (Figure 1). Le ribosome eucaryote comprend quatre ARNr et environ 80 protรฉines ribosomiques. Ainsi chez la levure Saccharomyces cerevisiae, la petite sous-unitรฉ est formรฉe de lโARNr 18S et de 33 protรฉines ribosomiques appelรฉes RPS (Ribosomal Protein of the Small subunit). La grande sous-unitรฉ 60S est composรฉe de trois ARNr dรฉnommรฉs 5S, 5.8S et 25S associรฉs ร 47 protรฉines nommรฉes RPL (Ribosomal Protein of the large Subunit) (Ben-Shem et al., 2011 ; woolford et al., 2013). Chez lโHomme, la composition est similaire, seule change la taille du l’ARNr le plus grand appelรฉ 28S (Anger et al., 2013 ; Khatter et al., 2015). La petite sous-unitรฉ constitue la plateforme de lecture du code gรฉnรฉtique ร travers l’appariement correct des ARN de transfert (ARNt) sur les codons de lโARNm.
Elle est de forme allongรฉe et possรจde 5 domaines caractรฉristiques : la tรชte, le bec, la plateforme, le corps et les pieds. La grande sous-unitรฉ 60S assure la synthรจse des liaisons polypeptidiques entre les acides aminรฉs durant la traduction par le biais de son domaine catalytique peptidyl-transfรฉrase. Elle est de forme globulaire et se caractรฉrise par la prรฉsence dโun domaine central associรฉ ร trois protubรฉrances : la protubรฉrance centrale, les tiges P et L1.
Malgrรฉ le grand nombre des protรฉines ribosomiques, cโest lโARNr qui demeure majoritaire en masse dans les ribosomes. Par ailleurs, par son arrangement spatial, imposรฉ par sa sรฉquence nuclรฉotidique et l’appariement des bases complรฉmentaires, c’est lui qui constitue le squelette de la structure du ribosome. Cette structure permet d’รฉtablir des sites d’interaction spรฉcifiques entre les sous-unitรฉs ribosomiques et les acteurs de la traduction, en particulier les ARN de transfert (ARNt) et les ARNm. Ainsi, ร lโinterface des deux sous-unitรฉs existent trois sites de fixation pour les ARNt porteurs des acides aminรฉs pendant la traduction (Figure 2). A chaque รฉtape de traduction, le site A (pour Aminoacyl-ARNt) est occupรฉ par l’ARNt porteur de l’acide aminรฉ en attente d’รชtre liรฉ ร la chaรฎne polypeptidique ; le site P (pour Peptidyl-ARNt) est occupรฉ par l’ARNt porteur de l’acide aminรฉ liรฉ ร la chaรฎne polypeptidique en cours de synthรจse ; enfin, le site E (pour Exit) permet la libรฉration de l’ARNt dรฉsacรฉtylรฉ qui a livrรฉ son acide aminรฉ. ZLa structure des ribosomes s’est complexifiรฉe au cours de lโรฉvolution (Figure 3). Les ribosomes eucaryotes incluent ร la fois plus de protรฉines ribosomiques et des ARNr de plus grande taille. Ainsi la masse du ribosome bactรฉrien 70S, composรฉ de la petite sous-unitรฉ 30S et la grande sous-unitรฉ 50S, est dโenviron 2,5 MDa contre 3,2 MDa pour le ribosome 80S des eucaryotes unicellulaires et 4,3 MDa pour le ribosome 80S des eucaryotes supรฉrieurs (Tableau 1). Les domaines supplรฉmentaires sur les ARNr eucaryotes sont appelรฉs segments d’extension. Leur allongement chez les mammifรจres pose la question de leurs rรดles dans lโenvironnement complexe des cellules eucaryotes (Angers et al., 2013 ; Klinge et al., 2012).
Du fait de leur complexitรฉ compositionnelle plus grande, la structure 3D des ribosomes eucaryotes a รฉtรฉ รฉlucidรฉe de maniรจre plus tardive. C’est en 2010 qu’a รฉtรฉ publiรฉe la structure du ribosome de levure ร haute rรฉsolution (4,15 ร ) obtenue par cristallographie aux rayons X (BenShem et al., 2010). Un an plus tard, une structure ร une rรฉsolution de 3,0 ร a prรฉcisรฉ les relations entre les protรฉines ribosomiques et lโARNr (Ben-shem et al., 2011). Enfin, concernant le ribosome humain, deux structures dรฉterminรฉes en 2013 (5,4-6 ร ) puis en 2015 ร lโรฉchelle atomique (3 ร ) par cryo-EM ont abouti ร une cartographie complรจte de cette machinerie molรฉculaire ouvrant le champ dโรฉtude ร dโautres applications. En effet ces rรฉsultats pourraient aider ร comprendre les effets des antibiotiques sur ces complexes et permettre de dรฉvelopper de nouveaux traitements contre certaines maladies liรฉes aux ribosomes (Anger et al., 2013 ; Khatter et al., 2015).
La biogรจnese des ribosomes eucaryotes
Lโassemblage des ribosomes eucaryotes est un processus complexe qui reprรฉsente lโactivitรฉ majeure de toute cellule en croissance. Chez les eucaryotes, ce processus est compartimentรฉ : il dรฉmarre dans le noyau, oรน la transcription des gรจnes ribosomiques entraine la formation du nuclรฉole; il se poursuit dans le nuclรฉoplasme et s’achรจve dans le cytoplasme aprรจs export nuclรฉaire des sous-unitรฉs ribosomiques en formation ou prรฉ-ribosomes. La synthรจse des ribosomes nรฉcessite un grand nombre dโรฉtapes de maturation successives et implique plusieurs processus : la transcription de lโADN ribosomique (ADNr), le clivage et le repliement des ARNr, l’assemblage de lโARNr avec les protรฉines ribosomiques, l’export des sous-unitรฉs ribosomiques vers le cytoplasme oรน se dรฉroulent les derniรจres รฉtapes de maturations. La biogenรจse des ribosomes eucaryotes a รฉtรฉ trรจs รฉtudiรฉe chez la levure Saccharomyces cerevisiae, qui est un modรจle facile ร manipuler dโun point de vue gรฉnรฉtique. Chez cet organisme, en phase exponentielle de croissance, la transcription des gรจnes ribosomiques รฉquivaut ร 60% de lโactivitรฉ transcriptionnelle totale et environ 2000 ribosomes sont produits par minute (Warner, 1999). Ainsi, la majeure partie de lโactivitรฉ mรฉtabolique des cellules en prolifรฉration est dรฉdiรฉe ร la biogenรจse des ribosomes. Les travaux chez la levure ont mis en รฉvidence la participation de centaines de facteurs en trans, protรฉines et particules RNP, dans la synthรจse des ribosomes (Henras et al., 2008 ; 2015). Ces acteurs-clรฉs sont seulement associรฉs aux particules en cours de maturation et absents des sous unitรฉs matures. Ces protรฉines seront nommรฉes co-facteurs de maturation (CFM) dans la suite du manuscrit de thรจse. La plus grande partie de ce processus se dรฉroule dans le noyau, mais les particules prรฉ-ribosomiques exportรฉes dans le cytoplasme ne sont pas encore compรฉtentes pour la traduction et doivent subir d’ultimes รฉtapes de maturation. A lโinstar des autres processus de maturation des ARN impliquรฉs dans la traduction, le confinement de la maturation dans le noyau รฉvite les interactions prรฉmaturรฉes des ARN ribosomiques (ARNr) avec les acteurs de la traduction. La synthรจse des ribosomes est un mรฉcanisme qui semble globalement conservรฉ chez les eucaryotes, mais un nombre croissant dโรฉtudes a montrรฉ quโelle sโest encore complexifiรฉe chez les plantes ou les animaux. En combinant les ARNr et les protรฉines ribosomiques de la bactรฉrie Escherichia coli dans un ordre prรฉcis, il est possible de provoquer l’auto-assemblage de ribosomes procaryotes matures et fonctionnels in vitro (Nomura, 1970). Ceci est impossible avec des ribosomes eucaryotes, ce qui souligne la complexitรฉ plus importante de la structure des sous unitรฉs et des mรฉcanismes de leur synthรจse.
Lโassemblage des ribosomes commence de maniรจre co-transcriptionnelle dans le nuclรฉole. La transcription des gรจnes ribosomiques sโopรจre grรขce ร lโARNr polymรฉrase I (ARN POL I) et donne naissance ร un long prรฉcurseur polycistronique (prรฉ-ARNr primaire) contenant la sรฉquence des ARNr 18S, 28/25SS et 5,8S (Figure 4 et Figure 6). La production des ribosomes requiert รฉgalement lโintervention cordonnรฉe de deux autres ARN POL : la transcription des ARNm des protรฉines ribosomiques est assurรฉe par lโARN POL II et la production de lโARNr 5S est effectuรฉe par lโARN POL III. Dans le nuclรฉole, le long prรฉcurseur des ARNr polycistronique, sโassocie ร la majoritรฉ des RP, des snoRNP ainsi que des co facteurs de maturation afin de former une particule nommรฉe 90S. Ce long transcrit subit des modifications chimiques sur des nuclรฉotides spรฉcifiques telles que la mรฉthylation en position 2′ des riboses ou encore lโisomรฉrisation d’uridines en pseudo-uridines (pseudouridylation) par des snoRNPs. Ces modifications sont guidรฉes par de petits ARN nuclรฉolaires (les snoARN) qui s’hybrident au niveau des nuclรฉotides ร modifier. Les sรฉquences flanquantes des ARN ribosomiques dans le prรฉ-ARNr sont par ailleurs excisรฉes par l’action concertรฉe d’endo- et d’exonuclรฉases, afin de gรฉnรฉrer un prรฉcurseur de la petite sous-unitรฉ ribosomique (prรฉ-40S) et un prรฉcurseur de la grande sous-unitรฉ ribosomique (prรฉ-60S) (Figure 4). Ces deux particules prรฉ-ribosomiques empruntent ensuite des voies de maturation indรฉpendantes dans le noyau et le nuclรฉoplasme. Aprรจs transport du nuclรฉoplasme vers le cytoplasme ร travers le complexe de pore nuclรฉaire (CPN), les particules prรฉ ribosomiques subissent les รฉtapes finales de leur maturation qui permet leur participation ร la traduction. En ce qui concerne les particules prรฉ-40S, les grandes รฉtapes de maturation cytoplasmique se caractรฉrisent par l’association des derniรจres protรฉines ribosomiques, la libรฉration sรฉquentielle des co-facteurs de maturation qui accompagnent la particule dans le cytoplasme, et le clivage ร lโextrรฉmitรฉ 3โ de lโARNr 18S mรฉdiรฉ par lโactivitรฉ endonuclรฉolytique du co-facteur de maturation Nob1. Chez la levure, ces derniรจres รฉtapes impliquent รฉgalement une association transitoire entre les particules prรฉ-40S et la grande sous-unitรฉ 60S formant ainsi des particules ยซย pseudo-80Sย ยป potentiellement impliquรฉes dans une รฉtape de contrรดle-qualitรฉ. Ces รฉtapes de maturation cytoplasmique sont globalement comparables entre lโHomme et la levure, mais des diffรฉrences soulignent la complexitรฉ accrue de ce processus au cours de l’รฉvolution. Par la suite, je mโattacherai ร dรฉcrire la biogenรจse de la petite sous-unitรฉ ribosomique eucaryote qui a fait l’objet de mon travail de thรจse.
Les acteurs de lโassemblage de la petite sous-unitรฉ ribosomique 40S
La maturation de lโARNr : Du prรฉ-ARNr primaire ร lโARNr 18Sย
La sรฉquence de lโARNr 18S (composant de la petite sous-unitรฉ 40S) comprise dans le prรฉ-ARNr polycistronique, est dรฉlimitรฉe par lโextrรฉmitรฉ 5โ flanquante (5โ ETS) et lโespaceur interne ITS1 (Figure 6). La formation de lโARNr 18S mature nรฉcessite donc lโรฉlimination de ces deux sรฉquences. Pour ce faire, trois รฉtapes successives sont requises chez la levure : la maturation progressive de lโextrรฉmitรฉ 5โ-ETS pour former lโextrรฉmitรฉ 5โ de lโARNr ; le clivage endonuclรฉolytique dans lโespaceur ITS1 ; le clivage de lโextrรฉmitรฉ 3โ au site D par lโendonuclรฉase Nob1 dans le cytoplasme, afin de former lโextrรฉmitรฉ 3โ mature de lโARNr 18S. Chez lโHomme, la maturation de l’extrรฉmitรฉ 3′ du 18S fait รฉgalement intervenir des exonuclรฉases 3′-5′ (Carron et al., 2011; Preti et al, 2013; Sloan et al., 2013; Montellese et al., 2018).
Les รฉtapes prรฉcoces de la maturation de l’ARNr 18S prennent place dans une particule prรฉ-ribosomique, dite particule 90S ou SSU processome, qui s’assemble cotranscriptionnellement et dans laquelle on trouve la snoRNP U3 et plus de 72 co facteurs de maturation.
La composition de cette particule de 2,2 MDa a รฉtรฉ รฉlucidรฉe grรขce ร des approches biochimiques et structurales telles que la purification dโaffinitรฉ couplรฉe ร la spectromรฉtrie de masse et ร la cryo-EM (Krogan et al., 2004 ; Grandi et al., 2002 ; Kornprobst et al., 2016 ; Cheng et al., 2017). L’assemblage du SSU processome fait intervenir l’association sรฉquentielle de plusieurs modules appelรฉs complexes UTP (pour U three proteins), comme UTP-A, UTP-B et snoRNP U3 au prรฉ-ARNr. Ce prรฉcurseur est รฉgalement composรฉ de lโARNr 5S associรฉ ร un complexe protรฉique (Zhang et al., 2007). Les รฉtudes sur la maturation du prรฉ-ARNr 35S, chez la levure S. cerevisiae, montre que chez cet organisme, en phase exponentielle de croissance, 70% des transcrits primaires sont clivรฉs de maniรจre co-transcriptionnelle dans l’ITS1 contre 30% de faรงon post-transcriptionnelle (Fernandez et al., 2015). Cela a รฉtรฉ observรฉ en microscopie รฉlectronique en transmission (MET) par รฉtalement de gรจnes ribosomiques en transcription, ou arbres de Miller (Miller et al., 1969 ; Osheim et al., 2004) (Figure 5). D’autres รฉtudes suggรจrent que ce mรชme clivage est principalement posttranscriptionnel chez les vertรฉbrรฉs (Mougey et al., 1993). Les รฉtapes de maturation du prรฉ-ARNr primaire sont relativement conservรฉes entre la levure et lโHomme.
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Table des matiรจres
I. INTRODUCTION
I.A Les ribosomes eucaryotes
I.A.1 La structure et la composition des ribosomes eucaryotes
I.A.2 La biogรจnese des ribosomes eucaryotes
I.B Les acteurs de lโassemblage de la petite sous-unitรฉ ribosomique 40S
I.B.1 La maturation de lโARNr : Du prรฉ-ARNr primaire ร lโARNr 18S
I.B.1.1 Maturation de lโextrรฉmitรฉ 5โ-ETS de lโARNr 18S
I.B.1.2 Maturation de lโextrรฉmitรฉ 3โ de lโARNr 18S
I.B.1.3 Les modifications post-transcriptionnelles de lโARNr
I.B.2 Lโassemblage des protรฉines ribosomiques (RP)
I.B.3 Le rรดle des co-facteurs de maturation (CFM)
I.B.3.1 Activitรฉ enzymatique des CFM
I.C Etapes de la maturation des particules prรฉ-40S
I.C.1 Export nuclรฉo-cytoplasmique des particules prรฉ-40S eucaryotes
I.C.2 Etapes de maturation cytoplasmique des particules prรฉ-40S de levure
I.C.3 Les รฉtapes de maturation cytoplasmique des particules prรฉ-40S de lโHomme
I.D Apport de la cryo-EM dans lโรฉtude des ribosomes
I.D.1 Etude structurale des ribosomes matures
I.D.2 Etude structurale des particules prรฉ-40S cytoplasmiques
I.D.3 Positionnement et rรดle des CFM cytoplasmiques impliquรฉs dans lโassemblage de la petite sous-unitรฉ 40S, chez la levure
I.D.4 Positionnement et rรดle des CFM cytoplasmiques impliquรฉs dans lโassemblage de la petite sous-unitรฉ 40S, chez lโHomme
I.E Contexte, problรฉmatique et objectifs de la thรจse
II. MATERIELS ET METHODES
II.A. Purification des particules prรฉ-ribosomiques prรฉ-40S
II.A.1 Purification des particules prรฉ-40S de levures Tsr1-FPZ
II.A.2 Particules prรฉ-40S de levures : Tsr1-TAP rps20ฮloop
II.A.3 Purification des particules prรฉ-40S humaines RIO1(kd)-TAP
II.B Microscopie รฉlectronique en transmission
II.B.1 Grilles de microscopie รฉlectronique en transmission
II.B.2 Ionisation des grilles
II.B.3 Principes gรฉnรฉraux
II.B.3.1 Source dโรฉlectrons
II.B.3.2 La colonne
II.B.3.3 Les lentilles รฉlectromagnรฉtiques
II.B.3.4 Dรฉtecteurs dโรฉlectrons
II.B.3.5 LโIntรฉractions des รฉlectrons avec lโรฉchantillon et formation dโimage
II.B.3.6 Formation dโimages
II.B.3.7 La fonction de transfert de contraste (CTF)
II.C Prรฉparation et acquisition dโimages de lโรฉchantillon biologique
II.C.1 Prรฉparation de lโรฉchantillon
II.C.1.1 Prรฉparation de lโรฉchantillon pour la coloration nรฉgative
II.C.1.2 Prรฉparation de lโรฉchantillon pour la cryo-congรฉlation
II.C.2 Acquisition des images en cryo-EM
II.D Analyse dโimages
II.D.1 Principes gรฉnรฉraux
II.D.2 Le programme RELION 2.1.0
II.D.2.1 Prรฉ-traitement
II.D.2.2 La classification 2D
II.D.2.3 La classification 3D
II.D.2.4 Auto-raffinement
II.D.2.5 Post-traitement
II.D.2.6 Auto-raffinement et classification masquรฉs avec ou sans soustraction du signal
II.D.3 Interprรฉtation des cartes de densitรฉ : construction d’un modรจle atomique
II.D.4 Les ressources informatiques
III. RESULTATS
III.1 Dรฉtermination de la structure de particules prรฉ-40S cytoplasmiques de levures (Tsr1-FPZ)
III.1.A Purification des particules Tsr1-FPZ
III.1.B Analyse structurale des particules prรฉ-40S Tsr1-FPZ par cryo-EM
III.1.B.1 Acquisition dโimages au NeCEN
III.1.B.2 Acquisition dโimages ร lโESRF
III.1.B.2.1 Analyse dโimages par classification ยซ globale ยป
III.1.B.2.2 Analyse dโimages par classification localisรฉe
III.1.C Discussion
III.1.D Perspectives
III.2 Dรฉtermination de la structure de particules prรฉ-40S cytoplasmiques de levures (Delta-loop Rps20)
III.2.A Objectifs et rรฉsumรฉ de lโarticle
III.2.B Article : Conformational proofreading of distant 40S subunit maturation events by a long-range communication Mechanism
III.3 Dรฉtermination de la structure de particules prรฉ-40S cytoplasmiques humaines tardives (RIO1(kd)-TAP)
III.3.A Purification et analyse compositionnelle des particules RIO1(kd)-TAP
III.3.B Analyse structurale des particules prรฉ-40S RIO1(kd)-TAP par Cryo-EM
III.3.B.1 Analyse du modรจle ยซ consensus ยป
III.3.B.2 Analyse par classification 3D globale
III.3.B.3 Analyse par auto-raffinement et classification localisรฉ
III.3.C Discussion
III.3.D Perspectives
IV. Conclusion gรฉnรฉrale