Les Récepteurs Couplés aux Protéines G 

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Propriétés des canaux KAT P

Composition et stœchiométrie des canaux KAT P

L’association de deux sous–unités est à l’origine de la formation du canal KAT P (fig. 1.1) : le récepteur des sulfonylurées (SUR, 140-170 kDa) et le canal potassique rectifiant entrant (Kir6.x, 40 kDa). Il existe deux gènes codant pour SUR chez les mammifères, abcc8 (SUR1) et abcc9 (SUR2), localisés sur deux chromosomes différents (11 et 12 respectivement). Les deux isoformes de SUR2, SUR2A et SUR2B sont obtenues par épissage alternatif au niveau des deux derniers exons du gène. On dénombre deux isoformes de Kir6.x : Kir6.1 et Kir6.2, codés pas les gènes kcnj8 et kcnj11, respectivement. Chez l’Homme, leurs gènes sont situés sur les chromosomes 12 et 11, respectivement. De ce fait, Kir6.1 et SUR2 sont localisés sur le même chromosome, sous l’influence de promoteurs différents, tout comme Kir6.2 et SUR1.
La topologie du canal KAT P a été mise en évidence grâce à l’utilisation de pro-téines de fusion SUR1–Kir6.2 et SUR1–Kir6.2–Kir6.2 [53]. Des expériences de co-purification de SUR1 et Kir6.2 ont de plus montré que les deux sous–unités étaient associées. La protéine de fusion SUR1–Kir6.2 est capable de former un canal KAT P fonctionnel ayant des propriétés semblables au canal natif. Elle constitue un com-plexe de 950 kDa, ce qui correspond à la somme des masses moléculaires de quatre Kir6.2 et quatre SUR1. Des expériences complémentaires ont permis de confirmer que le canal KAT P présente une stœchiométrie 1 :1 [53]. Cet ensemble présente l’ar-chitecture suivante : les quatre Kir6.2 se situent au centre constituant ainsi le pore du canal, lequel est entouré par les quatre sous–unités SUR [53, 131, 281] (fig. 1.1). Cette hypothèse est également appuyée par la structure tridimensionnelle à basse résolution (18 Å) du canal obtenue par microscopie électronique qui met en évidence un pore central (Kir6.2) englobé par quatre SUR [193].
Au sein de ce complexe, SUR est capable de réguler l’activité du canal. La pré-sence à la membrane du canal KAT P fonctionnel repose sur cette association octa-mérique [129]. De plus, suivant les tissus dans lesquels le canal KAT P est exprimé, différentes isoformes de Kir6.x et SUR sont impliquées (cf. tableau 1.1).

Assemblage et adressage membranaire

La formation de ce complexe octamérique requiert un contrôle très strict qui est jalonné par différentes étapes. Tout d’abord, il a été démontré, sur la base du calcul du temps de demi–vie de chaque sous–unité, que celles–ci s’assemblent probablement suivant la séquence ci–après : un Kir6.2 et un SUR1 s’associent pour former un hété-rodimère et ces derniers se rencontrent pour constituer un tétramère de SUR1/Kir6.2
[59]. Plusieurs zones d’interaction entre les deux composants du canal KAT P ont été identifiées et certaines d’entre elles sont suspectées comme ayant un rôle dans sa bio-genèse. Ainsi, Rainbow et al. ont constaté qu’un fragment de SUR2A, situé entre les domaines TMD2 et NBD2 et plus exactement entre les acides aminés 1294 et 1358, coprécipitait avec Kir6.2. En outre, la coexpression de ce fragment avec SUR2A et Kir6.2 altère l’adressage du canal natif [244, 245]. Le domaine TMD0 a également la capacité de s’associer avec Kir6.2 et modifie son activité [46, 81, 20]. La partie C–ter de Kir6.2 a aussi été reconnue comme étant impliquée dans l’interaction entre les deux sous–unités du canal KAT P [90, 270].
Le réticulum endoplasmique (RE) possède un système de contrôle qualité très drastique, et le canal KAT P se doit de montrer patte blanche pour pouvoir accéder à la membrane plasmique par la suite. Sur chacune des sous–unités se trouve un signal de rétention au RE (RXR) qui, lorsqu’il est accessible à la protéine COPI (Coat Protein Complex 1), l’empêche de sortir du RE (fig. 1.1). L’observation selon laquelle une forme tronquée de Kir6.2 ( C36) est capable d’atteindre la membrane en absence de SUR s’est justifiée par le fait que ce fragment contient le signal de rétention RKR [314]. De plus, la présence d’un signal semblable, entre les domaines TMD1 et NBD1 de SUR1, fut établie [341]. Ainsi, il semblerait que SUR1 masque, par encombrement stérique, le signal RKR présent sur Kir6.2 [116]. Reste alors le signal de rétention porté par SUR1 qui serait pris en charge par un dimère de la protéine 14–3–3 [340]. En effet, 14–3–3 reconnaîtrait le signal de rétention de SUR1, le masquant ainsi. Ceci réduit alors l’accès de ces sites à COPI qui laisse s’échapper le complexe octamérique du RE [116].

Les canaux potassiques rectifiants entrants : Kir

Caractéristiques principales des canaux Kir

Les différents membres de la famille Kir

La famille des canaux Kir est composée de quinze membres. Elle est divisée en sept sous–familles (Kir1.x à Kir7.1) suivant leur homologie de séquence (fig. 1.2). Ils ont comme rôle commun de maintenir le potentiel membranaire proche du potentiel de repos et de transporter les ions K+ au travers des membranes [218, 74]. Kir1.1 est chargé du transport de K+ au niveau du rein, les Kir2.x contrôlent le potentiel de repos des cellules cardiaques et cérébrales. La sous–famille Kir3.x possède la par-ticularité d’être activée par les sous–unités des protéines G hétérotrimériques. Ces canaux peuvent ainsi transposer l’activation de certains GPCR en activité élec-trique, et ce, dans les cellules cardiaques, neuronales ou encore les cellules sécretrices neuronales [336]. Kir6.1 et Kir6.2 constituent, associés à SUR, le canal KAT P qui est régulé par les nucléotides cytosoliques. Ils permettent de coupler le métabolisme cellulaire à l’activité électrique et au flux de K+ [14]. Ils assurent ainsi la régulation de la libération d’insuline, agissent en réponse à l’ischémie cardiaque ou neuronale ou régulent le tonus vasculaire des muscles lisses (cf. section 1.5.2). Les sous–familles Kir4.x, Kir5.1 et Kir7.1 auraient un rôle de transport d’ions K+ et plus particulière-ment de recyclage de ces derniers. A titre d’exemple, le canal Kir4.1 est exprimé dans le système nerveux central, la cochlée ou encore dans les reins. Leur activité dans cet organe serait liée à celle de la pompe Na+/K+ ATPase. En effet, Kir4.1 est plus précisément exprimé dans les cellules du néphron distal et assurerait la réabsorption de sel (des urines vers le sang) en association avec la Na+/K+ ATPase [266]. Kir5.1, quant à lui, s’associe avec Kir4.1 et est exprimé dans les cellules astrogliales et les cellules rétiniennes de Müller. Ce canal aurait pour rôle la régulation de la concentra-tion extracellulaire de K+ afin d’assurer la bonne fonction des neurones environnants
[117]. Enfin, Kir7.1 est exprimé dans les cellules épithéliales et possèderait un rôle de recyclage des ions potassium [212]. Le lien qui unit ces canaux potassiques est le fait qu’ils présentent une propriété commune : la rectification entrante des courants.

La rectification

La rectification entrante est l’une des caractéristiques des canaux Kir. Cela signifie qu’ils conduisent mieux les ions potassium dans le sens entrant que sortant (fig. 1.3). En conditions physiologiques, lorsque la membrane est dépolarisée, la conductance des canaux Kir est faible alors qu’en cas d’hyperpolarisation, l’entrée des ions K+ est favorisée. L’explication de ce mécanisme réside dans la liaison de cations (Mg2+ et polyamines) au niveau des domaines transmembranaires et cytoplasmiques de Kir. Ils bloquent le passage des K+ de façon voltage dépendante [176]. Ces cations interagiraient avec des résidus situés au niveau du segment M2 et de la partie C-terminale du canal.
Tous les Kir ne possèdent pas les mêmes propriétés de rectification. En effet, au moins un résidu, qui se trouve au niveau de la partie transmembranaire M2 permet de déterminer si la rectification est faible (Kir1.1 et Kir6.x), forte (Kir2.x et Kir3.x) ou intermédiaire (Kir4.x). Ainsi, Kir2.1, qui possède un résidu chargé négativement (Asp) en position 172, est rectifiant fort, alors que Kir1.1, qui a une Asn (neutre) en position 171, est faible. Néanmoins, la mutation de ce résidu en Asp permet de transformer ce dernier en canal présentant une forte rectification [178, 288]. Cet acide aminé (site D/N) est en fait un des sites d’interaction des cations avec le canal.

Caractéristiques structurales

Les canaux Kir possèdent deux hélices transmembranaires (M1 et M2), une région formant le pore, H5 et des domaines C-terminal et N-terminal cytoplasmiques. H5 constitue le filtre de sélectivité et contient, tout comme les autres canaux potassiques, la séquence TXGY(F)G [32]. Les Kir forment des homotétramères (4 sous–unités identiques) ou des hétérotétramères (sous–unités distinctes) [243, 133]. En général, le phénomène d’hétéromérisation a lieu entre deux membres de la même sous–famille (e.g. Kir3.1 avec Kir3.4, Kir3.2 ou Kir3.3), à l’exception de Kir4.1 et Kir5.1 qui s’associent dans les astrocytes. La possibilité de former ainsi des combinaisons aboutit
à des canaux Kir présentant des propriétés biophysiques différentes. Parmi la famille des canaux Kir, Kir6.1 et Kir6.2 sont des membres à part puisqu’ils interagissent avec la sous–unité régulatrice SUR pour former le canal KAT P .

Lumière sur les canaux Kir6.1 et Kir6.2

Caractéristiques Structurales

Les canaux Kir6.x possèdent une particularité de séquence au niveau du filtre de sélectivité. En effet, la séquence TXGYG est remplacée par TXGFG. De plus, Kir6.2 et Kir6.1 sont des canaux potassiques rectifiant faibles, ce qui s’explique par la présence d’une asparagine (en position 160 pour Kir6.2) au niveau du site D/N (cf. section 1.3.1.2). La mutation de ce résidu en aspartate dans Kir6.2 donne lieu à une rectification forte [281].

Localisation tissulaire

Kir6.1 Kir6.1 est exprimé de façon ubiquitaire et de manière plus soutenue au niveau des cellules musculaires lisses dans lesquelles il ne côtoie pas l’autre isoforme, Kir6.2 [297]. En outre, des expériences d’immunomarquage et de microscopie électro-nique ont montré la présence de Kir6.1 dans les membranes internes des mitochon-dries [296]. Toutefois, cette observation est actuellement remise en question à cause de résultats contradictoires obtenus par différentes équipes [216, 51, 84]. L’expression de Kir6.1 serait de plus induite suite à une ischémie cardiaque [5].
Kir6.2 Kir6.2 est fortement représenté dans les cellules , , des îlots pancréa-tiques [295] et, dans une moindre mesure, dans le cœur, les muscles squelettiques ou encore dans le cerveau [150].

Régulation physiologique

Les nucléotides L’observation selon laquelle le canal Kir6.2 tronqué de 26 rési-dus en C–ter (i.e. sans signal de rétention) pouvait accéder seul à la membrane, a mené à la conclusion qu’il pouvait être inhibé de manière directe par l’ATP [314]. L’identification du site de fixation de l’ATP fut laborieuse étant donné l’absence de séquence signature des sites de liaison des nucléotides. En effet, il a fallu combiner des études impliquant la mutagénèse des régions N–ter et C–ter cytoplasmiques aux informations apportées par les structures de canaux Kir alors disponibles [161, 222]. Ainsi, un site de liaison de l’ATP a été identifié à l’interface entre deux sous–unités Kir6.2 adjacentes, mettant en jeu le domaine C–ter de l’une et le N–ter de l’autre [73, 11]. Par la suite, il a été montré que la liaison d’une seule molécule d’ATP sur une sous–unité Kir6.2 était suffisante à la fermeture du canal [185]. De plus, Il s’agit d’un site très sélectif puisqu’il ne tolère pas de modification, même minime, du noyau adénine [63] et que l’affinité de liaison décroît avec la diminution du nombre de phos-phates [313, 251]. SUR modifie la sensibilité à l’ATP de Kir6.2. En effet, l’IC50 de l’ATP pour Kir6.2 se situe aux environs de 200 M alors que, en présence de SUR, celle–ci est déplacée vers 10 M.
Les lipides Tout comme pour l’ensemble des canaux Kir, le PIP2 joue un rôle central dans la régulation du « gating » de Kir6.2 et Kir6.1. Il permet non seulement d’atténuer le phénomène de « run–down » [119, 79] mais diminue aussi l’affinité appa-rente de l’ATP pour Kir6.2 modifiant ainsi son pouvoir inhibiteur [282, 28, 80]. Le PIP2 interagit de manière électrostatique avec Kir6.2 au niveau de résidus chargés positivement et localisés en C–ter, à proximité du site de fixation de l’ATP [78, 279].
Une autre famille de lipides anioniques est impliquée dans la régulation de Kir6.x. Il s’agit des esters d’acides gras à longue chaîne associés au Co-enzyme A (LC–CoA). S’appuyant sur un mécanisme semblable à celui du PIP2, ils diminuent le « run–down » et la sensibilité à l’ATP [96, 41, 278].
Phosphorylation La PKA et la PKC modulent l’activité de Kir6.x en phospho-rylant certains résidus Ser/Thr. Ainsi la phosphorylation par la PKA du canal KAT P contenant Kir6.2 et SUR1 a un effet positif [30]. Il en est de même pour Kir6.1 + SUR2B [242]. Les résidus S372 et T224 de Kir6.2 et S385 de Kir6.1 ont été identifiés comme étant des sites de phosphorylation de la PKA [30, 242, 173] tandis que seul le résidu T180 de Kir6.2 a été montré comme étant la cible de la PKC [170]. Influence du pH L’effet du pH sur l’activité des canaux Kir6.x revêt trois aspects :
– Lors d’une acidification modérée, on observe une activation.
– Une acidification importante provoque l’inactivation du canal.
– La basification du milieu a pour conséquence une augmentation de la rectifi-cation.
Quand le pH diminue, il est possible d’observer, dans un premier temps, une acti-vation réversible (pKa 7.2) qui est suivie par une inactivation irréversible (pKi 6.8) [333]. La phase d’activation est le résultat de la réduction du temps de fermeture des canaux [330]. L’activation fait intervenir le résidu His175 qui se situe au niveau de l’hélice M2 et l’inactivation implique les His186, 193, 216 qui sont localisées dans la partie C–ter cytoplasmique [334]. L’augmentation de la rectification constatée en cas de basification est supportée par la déprotonation de H216 [29].

SUR, un transporteur ABC à part

La grande famille des transporteurs ABC

Le récepteur des sulfonylurées (SUR) appartient à la famille des transporteurs ABC (ATP Binding Cassette). Ces protéines membranaires ont pour mission de transporter des substrats de part et d’autre d’une bicouche lipidique. Chez les pro-caryotes, elles assurent l’incorporation de nutriments essentiels ainsi que l’expulsion de certaines substances toxiques. De cette manière, ces protéines sont, par exemple, impliquées dans des phénomènes de résistance aux antibiotiques. Chez l’Homme, de nombreux mutants sont responsables de certaines maladies héréditaires telles que la mucoviscidose ou encore la maladie de Tangier. De surcroît, leur rôle dans la résis-tance des cellules cancéreuses à la chimiothérapie a été démontré maintes fois. Plus de 1000 transporteurs ABC ont été répertoriés jusqu’à présent, ce qui en fait l’une des plus grandes familles de protéines membranaires.

Membres

Il existe sept sous–familles de transporteurs ABC eucaryotes (de A à G), cette classification étant basée sur l’homologie présentée par les différentes régions ABC.
ABCA La sous–famille ABCA possède douze membres, classés en deux sous– groupes. Le premier contient ABCA1, 2, 3, 4, 7, 12 et le second ABCA5, 6, 8, 9, 10, 11. Les gènes codants pour ces derniers sont rassemblés au niveau du chromo-some 17 humain. Il s’agit des plus grands transporteurs ABC connus puisque certains comptent plus de 2000 acides aminés. Leur arrangement correspond à celui de trans-porteurs « complets » (i.e. TMD1–NBD1–TMD2–NBD2, fig.1.10). La majeure partie de ces protéines est impliquée dans le transport des lipides et est exprimée dans dif-férents organes (e.g. rétine, ABCA4 ; intestin, ABCA1). En outre, certains membres comme ABCA2 confèrent, aux lignées cellulaires les exprimant, une résistance aux médicaments.
ABCB Cette sous–famille est composée de douze membres, quatre sont des trans-porteurs complets (dont ABCB1 aussi appelé MDR1 pour « MultiDrug Resistance » 1), possédant donc un arrangement TMD1–NBD1–TMD2–NBD2 et sept sont des « demi–transporteurs », TMD–NBD (fig. 1.10). ABCB1 est exprimé au niveau de la barrière hémato–encéphalique ou encore dans le foie. Il permet à certaines lignées cellulaires cancéreuses de résister à la chimiothérapie. ABCB2 et ABCB3 forment des hétérodimères impliqués dans le transport des antigènes avant leur présentation par les molécules CMH (Complexe Majeur d’Histocompatibilité) de classe I.
ABCC La sous–famille ABCC présente treize membres, certains possédant un do-maine transmembranaire N–terminal supplémentaire, TMD0. CFTR (« Cystic Fibro-sis Transmembrane conductance Regulator » ou ABCC7) est un canal chlore régulé par la liaison et l’hydrolyse de l’ATP, SUR1 et SUR2 (ou ABCC8, ABCC9) sont les sous–unités régulatrices du canal KAT P . Des mutations de CFTR sont respon-sables de la mucoviscidose. Les autres membres sont des transporteurs similaires à MRP1, qui sont répartis dans deux sous–groupes : MRP1, 2, 3, 6, 7, qui possèdent un domaine TMD0 et MRP4, 5, 8, 9, 10 qui n’en possèdent pas. Ils sont capables de transporter des métaux lourds, des médicaments, des nucléosides. . .
ABCD Les demi–transporteurs ABCD sont au nombre de quatre. Ils sont essen-tiellement exprimés dans le peroxisome dans lequel ils forment des homo ou hétéro-dimères. ALDP (ABCD1) a été identifié comme transporteur d’esters d’acides gras à très longue chaîne associés au coenzyme A. Des mutants causeraient une maladie héréditaire liée au chromosome X : l’adrenoleucodystrophie.
ABCE/F Les membres de ces deux familles ne présentent pas de domaine trans-membranaire mais possèdent un ou deux NBD. On ne leur connait aucune fonction de transport. La famille ABCE ne comprend qu’un seul membre avec un NBD : OABP (« oligo–adenylate binding protein »). Cette protéine est synthétisée en réponse à une infection virale. Les protéines appartenant à la famille ABCF sont composées de deux NBD (fig.1.10). Chez l’Homme, ABCF1 aurait pour rôle d’activer une kinase, et ce, en association avec le ribosome [315].
ABCG Les demi–transporteurs qui constituent cette famille ont une topologie in-versée : NBD–TMD. Chez les mammifères, ABCG1 est responsable du transport de cholestérol [155], ABCG5 et 8 transportent des stérols dans le foie et l’intestin.

Caractéristiques structurales des transporteurs ABC

Les domaines transmembranaires : TMD Les différentes structures de trans-porteurs ABC disponibles témoignent d’une grande variabilité au niveau des do-maines transmembranaires (fig.1.11). En effet, d’un ABC à l’autre, la séquence, la taille, l’architecture et le nombre de TMD varient. De manière générale, les expor-teurs ABC comptent douze hélices transmembranaires tandis que les importeurs ABC possèdent entre dix et vingt hélices transmembranaires.
Les domaines de liaison de nucléotides : NBD Les NBD correspondent à la partie la plus conservée au sein des transporteurs ABC. C’est d’ailleurs eux qui per-mettent de déterminer l’appartenance d’une protéine candidate à cette famille. Ils contiennent plusieurs séquences consensus, chacune ayant des fonctions spécifiques
[143]. Le motif A de Walker est situé au niveau du sous–domaine « RecA–like » (une enzyme de réparation de l’ADN chez E. coli) et LSGGQ (signature ABC) se trouve dans le sous–domaine hélicoïdal. Dans le cas des transporteurs dits « complets », les deux NBD s’assemblent de manière à disposer ces motifs tête–bêche. Ainsi, cet arran-gement engendre la formation de deux domaines de liaison et d’hydrolyse de l’ATP, associant le motif A de Walker d’un NBD avec le LSGGQ de l’autre. La liaison de l’ATP provoque le rapprochement des deux NBD [48].
Hélices de couplage La transmission des changements conformationnels au ni-veau des NBD, induits par la liaison d’ATP, vers les TMD serait possible grâce à la présence d’une hélice entre ces deux domaines. En effet, l’observation des structures des exporteurs Sav1866, MsbA et P–gp [66, 324, 9] montre la présence d’une hélice à ce niveau, interagissant avec le NBD opposé (i.e. l’hélice présente dans TMD1–NBD1 est en contact avec NBD2). Il a été montré que des mutations dans cette région pro-voquent un découplage ou un mauvais assemblage du transporteur. C’est le cas de la mutation R659N dans TAP1/2(ABCB2/ABCB3) qui donne lieu à un transporteur incapable de véhiculer des substrats même si celui–ci peut lier l’ATP et les peptides antigèniques [47, 261].

Table des matières

Préface
I Introduction 
Rappel sur la membrane plasmique et ses propriétés électriques 
0.1 Structure et fonction de la membrane plasmique
0.2 Propriétés électriques des membranes et canaux ioniques
0.2.1 Concepts de base
0.2.2 Modèle électrique de la membrane
0.2.3 Répartition ionique de part et d’autre de la membrane
0.2.4 Fonctions cellulaires des canaux ioniques
1 Les Canaux Potassiques Sensibles à l’ATP
1.1 Bref historique
1.2 Propriétés des canaux KAT P
1.2.1 Composition et stœchiométrie des canaux KAT P
1.2.2 Assemblage et adressage membranaire
1.3 Les canaux potassiques rectifiants entrants : Kir
1.3.1 Caractéristiques principales des canaux Kir
1.3.2 Lumière sur les canaux Kir6.1 et Kir6.2
1.4 SUR, un transporteur ABC à part
1.4.1 La grande famille des transporteurs ABC
1.4.2 Le récepteur des sulfonylurées
1.5 Un biocapteur naturel : Le canal KAT P
1.5.1 Communication entre Kir6.x et SUR
1.5.2 Physiologie des canaux KAT P à l’échelle de la cellule et de l’organe ; pathologies associées
1.5.3 Pharmacologie des canaux KAT P
2 Les Récepteurs Couplés aux Protéines G 
2.1 Généralités
2.1.1 Caractéristiques générales des GPCR
2.1.2 Classification
2.1.3 Structures connues de GPCR eucaryotes
2.2 Voies de signalisation
2.2.1 Les protéines G
2.2.2 La signalisation indépendante des protéines G
2.2.3 Réponses induites à l’échelle cellulaire
2.3 Régulation de l’expression et de l’activité des GPCR
2.3.1 Adressage membranaire
2.3.2 Oligomérisation
2.3.3 Désensibilisation
2.3.4 Régulation négative
2.3.5 Internalisation
2.4 Les GPCR, cibles pharmaceutiques de choix
2.4.1 Pathologies associées
2.4.2 Médicaments
2.5 GPCR étudiés
2.5.1 Récepteur β2 adrénergique
2.5.2 Récepteur dopaminergique D3
2.5.3 Récepteur cannabinoïde 1
2.5.4 Rhodopsine
2.5.5 Récepteur des CC–chimiokines 2
3 Biocapteurs Faisant Intervenir des Canaux Ioniques 
3.1 Pores modifiés
3.2 Protéines de fusion ou mutants
3.2.1 Canaux photoactivés
3.2.2 Le récepteur 5–HT3A
3.2.3 Ion Channel–Coupled Receptors
4 Biologie Moléculaire 
4.1 Clones et Vecteurs d’Expression
4.2 Construction des protéines de fusion et mutants
4.2.1 Sous-clonage par ligation
4.2.2 Mutagénèse dirigée
4.2.3 Fusions GPCR-Kir6.2
4.2.4 Délétion de grands fragments
4.3 Amplification du matériel génétique
4.3.1 Transformation des bactéries compétentes
4.3.2 Purification de l’ADN plasmidique
4.4 Séquençage
4.5 Transcription in vitro
5 Expression Hétérologue 
5.1 L’ovocyte de xénope comme outil d’expression hétérologue
5.2 Extraction et préparation des ovocytes
5.3 Microinjection des ARNm
6 Caractérisation Fonctionnelle 
6.1 Patch-clamp
6.1.1 Principe
6.1.2 configurations utilisées en patch-clamp
6.1.3 Description du poste de patch–clamp
6.1.4 Conditions expérimentales
6.1.5 Traitements des données
6.2 Double micro–électrodes
6.2.1 Principe
6.2.2 Conditions expérimentales
6.2.3 Traitement des données
III Résultats 
7 Canal KAT P 
7.1 Test de composés sur le canal KAT P
7.1.1 Position du problème
7.1.2 Test de composés sur le canal KAT P
7.2 Etude de l’effet de pesticides sur le canal KAT P
7.2.1 Position du problème
7.2.2 Résultats
7.2.3 Discussion
8 ICCR 
8.1 Nouveaux ICCR : de la conception à la caractérisation
8.1.1 Position du problème
8.1.2 Construction des couples β2–Kir6.2
8.1.3 Le couple D3–Kir6.2
8.1.4 Le couple CB1–Kir6.2
8.1.5 Le couple opsine–Kir6.2
8.1.6 Le couple CCR2–Kir6.2
8.2 M2–Kir6.2, outil d’exploration de l’arrangement du complexe
8.2.1 Sensibilité à l’ATP
8.2.2 Association SUR/M2–K0-25
8.2.3 Discussion
Conclusions et Perspectives 
Bibliographie

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