LES RADICAUX PROTEIQUES ET LA CATALYSE ENZYMATIQUE.

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Les réactions de transfert d’atome d’hydrogène.

Le processus le plus classique, dans les ruptures de liaisons, associé aux réactions radicalaires est le transfert d’un atome d’hydrogène dans lequel le proton et l’électron constituant l’atome d’hydrogène sont simultanémentarrachés du substrat5,6,7,8,9. L’arrachement d’un atome d’hydrogène implique la rupture d’une liaison simple. Le transfert concerté du proton et de son électron permet d’éviter une sépartion de charges, défavorable pour la réaction. L’équation bilan d’une réaction de transfert d’un atome d’hydrogène est donnée par l’équation 2 : X• + YH XH + Y• Equation 1-2
La force motrice des réactions de transfert d’hydrogène est basée sur la stabilité relative des radicaux X• et Y• entre eux. Cela peut être simplement analysé en rmete d’enthalpie de liaison entre l’état X-H et Y-H8. La force de liaison apparaît donc comme un facteur déterminant de la réactivité des radicaux.

Les réactions de transfert couplé proton-électron.

Les réactions de transfert couplé proton-électrononts les processus les plus rencontrés dans les réactions radicalaires non concertées. Lestransferts non concertés d’un proton et d’un électron impliquent soit une résolution spatiale soit une résolution temporelle des deux processus élémentaires. Les deux éléments (H,e ) peuvent utiliser différents chemins entre l’accepteur et le donneur, comme cela est représenté par le schéma 1-1.
Plus généralement, les transferts couplés (H; e ) sont des processus séquentiels, le transfert des deux entités se faisant donc l’un après l’autre10,11.

Formation du radical tyrosyle chez les RNRs de classe I.

Les RNRs de classe I sont constituées de deux sous-unités homodimériques R1 et R2. La réduction du nucléotide a lieu dans la sous-unité R1. La sous-unité R2 contient le radical tyrosyle (formé sur la Tyr122 dans la RNR d’E. coli) et le centre à fer, constitué de deux atomes de fer spin fort en interaction antiferromagnétique via un pont µ -oxo [Fe(II)-O-Fe(II)]51,52,53,54. Des expériences de spectroscopie RPE et de marquage isotopique sur la sous-unité R2 ont révélées que la bande d’absorption 10à4 nm en UV-visible et le doublet centré à g=2,004, observés pendant le cycle catalytique, étaient dus à la formation d’un radical tyrosyle55,12,56,57,58.

Dans la forme inactive de la protéine, les deux atomes de fer sont au degré d’oxydation +II, distants de 3,9 Å et reliés entre eux par des ponts carboxylates bidentates créés par deux résidus glutamates. Au cours de laremièrep étape une molécule de dioxygène se lie à l’un des centres métalliques de la forme réduite. Un tel complexe n’a pas pu être observé dans le cas de la RNR mais des cristaux de la protéine R2, contenant une molécule d’azoture liée au centre bimétallique, ont été obtenus avec un mutant de la RNR d’ E.coli59. Le centre binucléaire à Fe(II) réagit ensuite avec le dioxygène pour former un composé peroxo (composé P). Cette espèce n’a pu être observée quedans des complexes modèles60 ou avec des mutants de R261,62. La réduction, couplée à une protonation de ce complexe, conduit à l’intermédiaire X, au sein duquel les deux atomes de fer sont distants de 2,5 Å 63. Cette espèce a été formellement décrite comme un complexe mixteFe(IV)-Fe(III)64. Au sein de cette espèce, le résidu tyrosine est alors oxydé formantainsi l’intermédiaire catalytiquement actif. L’espèce active est constituée du centre binucléaire, Fe(III)-Fe(III) liés par un pont µ -oxo, et du radical tyrosyle. La figure 1-4 reprend le mécanisme proposé pour le passage de la forme inactive à la forme active des RNRs de classe I. Un troisième intermédiaire, appelé composé U, contenant un radical tryptophanyle protoné couplé à un centre Fe(III)-Fe(IV) a été également proposé. Ce radical, localisé sur le tryptophane 48, a été observé lorsque l’apport enerf est limité65,66.

Le radical tyrosyle est nécessaire à l’activité catalytique des RNRs de classe I. Le site actif de la réaction est localisé dans la sous-unité R1 et contient la Cys439, essentielle pour la catalyse, car elle initie la réduction du nucléotide67,68. La Cys439 et la Tyr122 étant distantes de 35 Å, d’autres acides aminés assurent le transfe rt d’électron entre ces deux résidus69. Récemment, Seyedsayamdost etcoll. ont montré que la Tyr356 est impliquée dans ce transfert d’électron mais le chemin complet n’est pas encore tout à fait élucidé70.

Formation du radical glycyle chez les RNRs de classe III

La formation du radical glycyle dans la sous-unité2 des RNRs de classe III est moins bien comprise que celle du radical tyrosyle des RNRs de classe I. Généralement, les enzymes à radical glycyle permettent aux organismes anaérobies stricts ou facultatifs de catalyser des réactions chimiquement difficiles72,73. Le radical glycyle est essentiel pour la catalyse et est très sensible au dioxygène. Par contre, en absencede dioxygène, ce radical est stable pendant plusieurs heures. La stabilité inhérente des radicaux glycyles est due aux effets combinés des substituants NH et CO, respectivement électrodonneu et électroattracteur, et à son enfouissement au sein de la protéine. Les signaux RPE des radicaux glycyles présentent des caractéristiques spécifiques. Il s’agit d’un doublet avec un couplage hyperfin de 1, 4-1,5 mT centré à g=2,0035 en RPE bande X. Ce spectre a été observé notamment dans le casedla Pyruvate Formiate-Lyase (PFL)13,74. Le cycle catalytique de tous les enzymes à radical glycyle débute probablement par le transfert du radical glycyle sur le groupe thiol d’une cystéine spatialement proche du résidu glycine. Le radical thiyle résultant initie ensuitela réaction radicalaire75. Cependant pour être activées, les protéines à radical glycyle nécessitent l’intervention d’une protéine à centre fersoufre. Celle-ci en combinaison avec la S-adénosylméthionine (SAM) peut initier une catalyse radicalaire et réaliser des réactions diverses telles que des méthylations inhabituelles, isomérisations, cyclisations, oxydations, insertion de soufre ou encore la formation de radicaux protéiques76. Malgré la diversité des réactions catalysées, onsuppose que ces protéines utilisent un mécanisme commun de génération des espèces radicalaires qui est représenté par la figure 16.

Le radical 5’-déoxyadénosyle (Ado) issu de la réduction de la SAM oxyde un résidu glycine. Le radical glycyle est réduit par une cystéine du entrec actif, formant un radical thiyle. Le radical thiyle formé est ensuite transféré au substrat qui est converti en produit par un mécanisme radicalaire77.

Rôle du radical thiyle chez les RNRs.

Le radical thiyle est une espèce transitoire capable d’arracher un atome d’hydrogène au substrat sur des positions activées. En effet, l’énergie de dissociation de la liaison S-H est de l’ordre de 90 kcal.mol -1 alors que l’énergie de dissociation mise en jeu lors de la rupture de la liaison du substrat est de l’ordre de 80 kcal.mol-126. Les radicaux thiyles sont très efficaces car ils sont capables d’arracher un atome d’hydrogène avec des vitesses de l’ordre de 104 M-1.s-1, même si cette faculté est masquée par leur capacité à donner un atome d’hydrogène encore plus rapidement78.

LA GALACTOSE OXYDASE.

La galactose oxydase (GO)79 est une métalloprotéine à cuivre de type II, de 68,5 kDa, isolée d’un champignon : Fusarium spp. Elle fait partie de la classe des oxydases radicalaires à cuivre qui incluent également la Glyoxal Oxydase80. Elle catalyse l’oxydation à deux électrons du D-galactose en présence de dioxygène veca départ de l’hydrogène proS- du substrat. Les produits de réaction sont le sucre oxydé et le peroxyde d’hydrogène80. Il est intéressant de noter que la protéine accepte commesubstrat un très grand nombre d’alcools primaires et les oxyde en aldéhydes avec réductionconcomitante de dioxygène en peroxyde d’hydrogène79,33.

La structure cristallographique de la forme inactive de la galactose oxydase a été résolue par Ito etcoll. en 199481. Le site actif de la forme inactive est constituéd’un atome de cuivre dans une géométrie de type pyramidal à base carrée, avec le résidu tyrosine 495 en position axiale. Les histidines 581 et 496, la tyrosine 272 et un ligand exogène (eau ou acétate) coordinent le cuivre en position équatoriale. Un fait remarquable dans cette structure est la présence d’une liaison covalente entre le soufre de la cystéine 228 et la tyrosine 27281 (en position ortho de la fonction phénol de la tyrosine).

La galactose oxydase catalyse la réduction des alcools primaires en aldéhydes. Cette réaction met en jeu deux électrons, alors que son ites actif ne contient qu’un seul atome de cuivre (susceptible de ne transférer qu’un seul électron par la réaction Cu(II) + 1e- Cu(I)). Ce problème n’est qu’apparent, car au cours de son cycle catalytique la galactose oxydase met en jeu un autre site redox, non métallique, qui à été identifié comme un radical protéique. La forme active de l’enzyme contient donc un ion de cuivre (II) et un radical organique. L’oxydation, via le dioxygène, de l’apoprotéine génère ce radical rsula Tyr495 puis, par transfert d’électron le radical est formé sur la Tyr272 liée par liaison covalente au résidu cystéine79,80,81,82. En spectroscopie RPE cela se traduit par la présence d’un couplage hyperfin avec un seul hydrogène en ortho de la fonction phénol.

LA PROSTAGLANDINE H SYNTHASE.

La prostaglandine H synthase (PGHS) catalyse les premières étapes de la biosynthèse des prostaglandines85,86,87,88. Une première activité de type cyclooxygénase permet la conversion de l’acide arachidonique (AA) en prostaglandine G2 (PGG2) grâce à deux molécules de dioxygène. Puis grâce à une activité peroxydase, la PGG2 pourra être réduite en prostaglandine PGH2. La PGHS existe sous deux isoformes PGHS-1 et PGHS-2. Les deux activités catalytiques peuvent être observées pourchacune des deux isoformes. Les sites actifs de ces deux activités sont différents, cependant d’un point de vue mécanistique l’activité cyclooxygénase est liée à l’activité peroxydase le composé I [Fe(IV)=O Por ]. Ce composé est formé initialement d’une espèce xoferryle en interaction avec un radical porphyrinique cationique89,17,90, mais ce radical est réduit par un acide aminé aromatique, respectivement la Tyr38591,92 pour la PGHS-1 et la Tyr371 pour la PGHS-293,94. Il se forme donc l’espèce [Fe(IV)=O Tyr•]. Ce radical tyrosyle est responsable de l’abstraction d’un atome d’hydrogène de l’acide ara chidonique, ce qui constitue l’étape d’initiation du cycle cyclooxygénase. L’oxydation de l’hème (activité peroxydase), conduisant au composé I, est donc nécessaire à l’activité cyclooxygénase. En revanche, l’activité peroxydase peut très bien exister indépendamment de l’activité cyclooxygénase95,96.
Depuis que Ruf et coll. ont mis en évidence la formation d’une espèce active en spectroscopie RPE dans le cycle catalytique, de nombreuses équipes ont cherché à définir la structure de cette espèce paramagnétique17. Trois états différents de la PGHS-1 peuvent être observés en RPE. Les spectres associés correspondent à un doublet large, un singulet large et un singulet étroit92,97,98. Plusieurs études suggèrent que l’espèce, dont lespectre est le doublet large (3,5 mT) est un intermédiaire du cycle de cyclooxygénation. Son apparition est corrélée avec la consommation de peroxyde et sa disparition avec la formation de PGG299,92. De plus, avec le mutant Y385F plus aucune activité cyclooxygénase n’est détectée et le doublet large n’est effectivement plus observé100,101. Avec ce mutant, l’activité peroxydase est, elle aussi, réduite de 50 % par rapport à la souche sauvage. Ceci corrobore donc l’idée que les deux sites actifs sont indépendants l’un de l’autre mais partage le même cofacteur héminique102.
Lorsque l’échantillon correspondant au doublet large est incubé dans la glace plusieurs minutes, le signal évolue vers un signal singulet stable d’approximativement la même largeur. Si l’incubation est prolongée quelques heures, ce singulet large évolue vers un singulet plus étroit, d’environ 2,5 mT de largeur98, qui apparaît après la formation de PGG2.
Des expériences menées dans des conditions anaérobies ont montré qu’en absence d’acide arachidonique, le spectre correspondant au doublet large est détecté. Si l’acide arachidonique est ajouté au milieu, le doublet large disparaît au profit d’un nouveau signal 91.
Des expériences de marquages isotopiques de l’acide arachidonique ont montré que ce nouveau signal provenait du substrat lui même (AA). En revanche, lors d’une expérience de marquage réalisée lorsque seul le singulet étroitste détecté, aucun nouveau signal radicalaire n’est détecté91. Le signal du doublet large semble donc correspondre à une espèce qui initie la chimie d’oxydation du substrat, tandis que celui du singulet étroit, à une espèce dégradée. Des résultats encore plus convaincants93 sont obtenus avec l’incubation de l’enzyme PGHS-2 avec du peroxyde d’éthyle. En RPE, un singulet large, correspondant à un radical tyrosyle, est détecté. Ce radical va réagir avec l’acide arachidonique pour générer en RPE un signal à sept raies qui peut être simulé par un radical pentadienyle. Ce dernier pourrait être une espèce dérivée de l’acide arachidonique.

LE PHOTOSYSTEME II.

Au cours de la photosynthèse oxygénique, un transfert d’électron, induit par l’énergie solaire, a lieu. Les systèmes impliqués dans ce transfert sont le photosystème I (PS I) et le photosystème II (PS II). Le photosystème II est constitué d’un ensemble de protéines membranaires contenant, entre autre, des chlorophylles et un centre à manganèse, site catalytique pour la réaction d’oxydation de l’eau103,104.
Dans le PSII, l’eau est oxydée en dioxygène et en protons, tandis qu’une plastoquinone est réduite en quinol. Ces réactionsse produisent dans des sites distincts de la protéine, connectés entre eux par une série de cofacteurs permettant le transfert d’électron de l’un vers l’autre. Une chlorophylle initie le mouve ment des électrons: son état initialement réducteur évolue par perte d’électron vers une espèce fortement oxydante (P680+).

Chaîne de transfert d’électron au sein du photosystème

La photochimie du PSII105,103 commence par l’excitation d’une paire spéciale de molécules de chlorophylle liées aux sous-unités Det D . Cette paire absorbe des radiations de longueurs d’ondes 680 nm et est appelée P680 (figure 1-10). A la suite de l’excitation, le P680 transfère, en quelques picosecondes, un électron àune molécule de phéophytine voisine + 2+ ) formant ainsi le (une chlorophylle démétallée avec deux ions Hà la place de l’ion Mg cation correspondant P680+. L’électron est ensuite successivement transféré à une plastoquinone, QA, accepteur d’un électron, puis à une autre plastoquinone QB, qui peut accepter deux électrons. P + est suffisamment puissant pour oxyder le centre à m anganèse du centre de dégagement de l’oxygène et ce via une tyrosine (YZ), qui forme un radical intermédiaire. Dans ce modèle, la tyrosine Z fait partie intégrante du site catalytique.
La réaction d’oxydation de l’eau est une réaction à quatre électrons dont l’équation bilan est la suivante : 2 H O O + 4H+ + 4e- Equation1-3.

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Table des matières

NTRODUCTION GENERALE
LES RADICAUX PROTEIQUES IMPLIQUES DANS LA CATALYSE ENZYMATIQUE
INTRODUCTION
I. LES RADICAUX PROTEIQUES EN BIOLOGIE
I.1-Principe de la catalyse radicalaire
I.1-1 Le transfert mono-électronique
I.1-2 Les réactions de transfert d’atome d’hydrogène.
I.1-3 Les réactions de transfert couplé proton-électron.
I.2-Identification et propriétés des radicaux protéiques
II. LES RADICAUX PROTEIQUES ET LA CATALYSE ENZYMATIQUE.
II.1-Les Ribonucléotides Réductases
II.1-1 Formation du radical tyrosyle chez les RNRs de classe I.
II.1-2 Formation du radical glycyle chez les RNRs de classe III
II.1-3 Rôle du radical thiyle chez les RNRs.
II.2-La Galactose Oxydase
II.3-La Prostaglandine H Synthase
II.4-Le Photosystème II.
II.4-1 Chaîne de transfert d’électron au sein du photosystème II.
II.4-2 Rôle proposé pour les radicaux tyrosyles Z et D
II.5-La cytochrome c oxydase
II.6-La cytochrome c peroxydase.
CONCLUSIONS
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
APPROCHE EXPERIMENTALE : SPECTROSCOPIE DE RESONANCE PARAMAGNETIQUE ELECTRONIQUE ET SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION ELECTRONIQUE UV-VISIBLE
INTRODUCTION
I. LA SPECTROSCOPIE DE RESONANCE PARAMAGNETIQUE ELECTRONIQUE (RPE)
I.1-Les principes fondamentaux de la spectroscopie RPE
I.1-1 Généralités.
I.1-2 L’effet Zeeman isotrope
I.1-3 Les interactions hyperfines
I.1-4 Le facteur g.
I.1-5 La transition RPE
I.1-6 Levée de dégénérescence en champ nul
I.1-7 Généralités sur le spectre RPE.
I.1-7 a) Interactions magnétiques.
I.1-7 b) Position de raie et anisotropie
I.1-7 c) Origine de la forme et de la largeur de raie
I.1-7 d) Amplitude du signal RPE
I.1-7 e) Le phénomène de saturation
I.1-7 f) Le phénomène de relaxation
I.2-Les différentes techniques de la spectroscopie RPE.
I.2-1 La spectroscopie RPE conventionnelle
I.2-2 La spectroscopie RPE à champ intense et à haute fréquence.
I.3-Les spectres RPE dans le cas de poudres et de solutions gelées.
I.3-1 Allure générale d’un spectre à symétrie axiale
I.3-2 Allure générale d’un spectre à symétrie rhombique
I.4-Spectres des espèces d’interêt de ce travail
I.4-1 Spectre du Fe(III) spin fort du site actif des catalases et des KatGs
I.4-2 Spectre du composé I [Fe(IV)=O Por•+]: L’interaction d’échange
I.4-2 a) Généralités
I.4-2 b) Cas du composé I.
I.4-2 c) Les radicaux protéiques tyrosyle et tryptophanyle
II. LA SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION ELECTRONIQUE UV-VISIBLE.
II.1- Principes de la spectroscopie d’absorption électronique
II.1-1 Généralités
II.1-2 Introduction théorique.
II.1-2 a) Transitions électroniques
II.1-2 b) Absorption lumineuse et spectre associé
II.1-2 c) Types particuliers de transitions
II.2- Spectres d’absorption electroniques des espèces étudiées dans ce travail
II.2-1 La porphyrine
II.2-1 a) Généralités sur les porphyrines.
II.2-1 b) Caractéristiques spectrales.
II.2-2 Les espèces protéiques
II.2-2 a) L’enzyme natif : Fe(III) spin fort.
II.2-2 b) Les composés oxoferryles: [Fe(IV)=O Por•+] et [Fe(IV)=O], [Fe(IV)=O Tyr•], [Fe(IV)=O Trp•].
III. APPROCHE GENERALE.
CONCLUSIONS
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
LES CATALASES : NOUVELLES PERSPECTIVES MECANISTIQUES
INTRODUCTION
A. LES CATALASES A HEME : PROPRIETES STRUCTURALES ET FONCTION
I. LES CATALASES : STRUCTURES.
I.1-Description de la structure globale.
I.2-Le site actif et les canaux d’accès
I.3-Le site de fixation du NADP(H).
II. LES CATALASES : ASPECTS FONCTIONNELS
II.1- Réaction catalytique.
II.2- Structures des intermédiaires catalytiques
III. PROBLEMATIQUE
B. ETUDE COMPARATIVE DES CATALASES PAR SPECTROSCOPIE DE RESONANCE PARAMAGNETIQUE ELECTRONIQUE ET PAR SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION UVVISIBLE.
I. CARACTERISTIQUES DU SPECTRE RPE ET DU SPECTRE D’ABSORPTION UV-VISIBLE DES CATALASES A L’ETAT FERRIQUE.
II. CARACTERISATION SPECTROSCOPIQUE DES INTERMEDIAIRES RADICALAIRES FORMES AU COURS DU CYCLE CATALYTIQUE DES CATALASES.
II.1- Formation d’un composé [Fe(IV)=O Por•+] stable : catalases de B. pertussis et de B. fragilis.
II.1-1 Résultats pour la catalase de B. pertussis
II.1-2 Résultats pour la catalase de B. fragilis.
II.2- Formation d’un intermédiaire alternatf [Fe(IV)=O Tyr•].
II.2-1 Influence du pH.
II.2-2 Influence de l’excès d’acide peracétique.
II.2-3 Influence du temps de réaction.
II.2-4 Influence de la concentration
II.2-5 Puissance de saturation du radical tyrosyle
II.3- Aucun intermédiaire radicalaire détecté.
II.3-1 Cas de la catalase d’E.coli.
II.3-2 Cas de la catalase de P. syringae
II.3-3 Cas de la catalase de S. marcescens
II.4- Discussion.
II.4-1 Analyses de séquence des catalases et proposition de candidats pour le site de formation du radical tyrosyle.
II.4-2 Analyse des structures cristallographiques.
III. CORRELATION ENTRE LA STABILITE DES INTERMEDIAIRES FORMES ET L’ACTIVITE CATALYTIQUE
IV. VERS UNE ACTIVITE PEROXYDASIQUE DES CATALASES ?
CONCLUSIONS
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CATALASE-PEROXYDASES : VERS LA COMPREHENSION DU ROLE DES RADICAUX PROTEIQUES DANS LE CYCLE CATALYTIQUE CHEZ LES ANCETRES DES PEROXYDASES.
INTRODUCTION
A. LES CATALASE-PEROXYDASES
I. BPKATG: STRUCTURE CRISTALLOGRAPHIQUE ET PARTICULARITES
I.1-Structure globale
I.2-Présence de trois larges boucles et d’un ‘short strech’ dans la région catalytique.
I.3-Le canal d’accès des substrats
I.4-L’adduit Trp(111)-Tyr(238)-Met(264) et la conformation de l’Arg426
I.5-Modification du Trp111 de BpKatG.
II. RELATIONS ENTRE LES DIFFERENTES ACTIVITES DE BPKATG
III. LES CATALASE-PEROXYDASES: LES INTERMEDIAIRES RADICALAIRES.
IV. OBJECTIFS
B. CARACTERISATION DES RADICAUX FORMES CHEZ LES KATGS PAR RPE MULTIFREQUENCE ET MUTAGENESE DIRIGEE.
I. CARACTERISATION PAR RPE DES INTERMEDIAIRES RADICALAIRES DE BPKATG
I.1-Etude de la réaction de BpKatG avec l’acide peracétique..
I.2-Le cycle catalytique de BpKatG en absence de substrat
I.3-Effet de l’acétate de sodium
I.4-Reaction de BpKatG avec d’autres oxydants
I.5-Réactivité des intermediaires radicalaires vis-à-vis des substrats dans la réaction de type peroxydase
I.5-1 Réaction entre BpKatG et l’ABTS
I.5-2 Réaction entre BpKatG et l’isoniazide
II. CARACTERISATION ET COMPARAISON DES INTERMEDIAIRES RADICALAIRES FORMES PAR LES KATGS
II.1-Dépendance du signal RPE à 9 GHz des KatGs natives avec le pH.
II.2-Intermédiaires radicalaires formés par les KatGs.
II.3-Influence de la température de mélange sur la formation des intermédiaires radicalaires des KatGs
II.4-Détermination du rôle des intermédiaires radicalaires : tests avec les substrats.
II.4-1 Réaction avec l’ABTS.
II.4-2 Réaction avec l’INH.
CONCLUSIONS
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
VERS LA COMPREHENSION DES PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DETERMINANT LA STABILISATION DES INTERMEDIAIRES TRYPTOPHANYLES ET TYROSYLES
INTRODUCTION
A. LA PEROXYDASE DE RAIFORT
I. GENERALITES ET STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE
II. MECANISME CATALYTIQUE
III. CARACTERISATION PAR SPECTROSCOPIES D’ABSORPTION UV-VISIBLE ET DE RESONANCE PARAMAGNETIQUE ELECTRONIQUE.
B. LA PEROXYDASE DE RAIFORT MODIFIEE
I. RECONSTITUTION DE LA PEROXYDASE DE RAIFORT
II. CARACTERISATION DE LA PEROXYDASE DE RAIFORT MODIFIEE
CONCLUSIONS
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES
ANNEXES
I. Spécifications et préparations.
I.1-Instrumentation
I.2-Les Enzymes
I.3-Purification de la catalase de foie de bœuf
1.4-Mise au point des conditions expérimentales pour les expériences RPE
II. Procédures expérimentales de chimie organique
II.1-Synthèse de l’isoniazide marqué à l’azote 15
II.2- Synthèse du composé Protohémine-6-(7)-L-méthyl-ester de la tyrosine
II.3- Déprotection de la tyrosine
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES