Les protéines : structure et propriétés

Les protéines : structure et propriétés

Les protéines sont des macromolécules biologiques constituées d’une séquence d’acides aminés. Elles sont présentes dans toutes les cellules vivantes et peuvent assurer une multitude de fonctions, comme par exemple la catalyse de réactions chimiques (enzymes), la transmission de signaux cellulaires (protéines membranaires) ou le maintien des structures cellulaires (protéines structurales) (Whitford, 2013). Il est d’usage de distinguer les peptides, qui possèdent en général moins de 100 acides aminés, et les protéines constituées d’une centaine d’acides aminés ou plus.

Structure des protéines 

Les acides aminés

Les acides aminés, ou α-aminoacides, sont des composés organiques comprenant à la fois un groupe fonctionnel carboxyle (–COOH) et amine (–NH2). Ce sont donc des espèces ampholytes possédant à la fois des propriétés acides et basiques. Il en existe 20 à entrer dans la composition des protéines . Ils possèdent une formule générale de la forme R–CH(NH2)–COOH et diffèrent par la forme du radical R, que l’on appelle la chaîne latérale. Les acides aminés sont par ailleurs souvent classés en quatre groupes selon les propriétés de la chaîne latérale : acide, basique, polaire ou apolaire (Barrett, 2012). Par convention, le carbone auquel sont rattachés les groupements amine et carboxyle est appelé carbone-α, ou carbone asymétrique, ce qui induit une chiralité de la molécule (à l’exception de la glycine). Les acides aminés ont donc des propriétés optiques de forme L (levogyre), qui est la forme standard dans les protéines (Barrett, 2012).

Les quatre niveaux de structuration des protéines

Structure primaire
Il s’agit de la séquence en acide aminés, ou enchaînement linéaire : on parle également de chaîne polypeptidique, ou encore de squelette de la protéine. Cette structure est essentielle, un seul changement pouvant modifier les propriétés de la protéine (Whitford, 2013).

Structure secondaire
La structure secondaire représente les repliements locaux des acides aminés dans une protéine. Ces repliements permettent de stabiliser la structure de la protéine à travers des liaisons hydrogènes (H) intramoléculaires. Il existe différentes catégories de structure secondaire, les plus connues étant :
– Les hélices α : la chaîne polypeptidique s’enroule autour d’un axe, formant une structure hélicoïdale. Les hélices α peuvent être représentées schématiquement par une hélice ou un cylindre.
– Les brins β (feuillets) : le brin β possède une conformation très étendue (linéaire). Il n’est pas stable seul car il ne possède aucune liaison H : il n’est stable que dans les feuillets β (des liaisons H s’établissent entre 2 brins β différents, parallèles ou antiparallèles). Les feuillets sont représentés conventionnellement par des flèches. Deux brins d’un feuillet sont reliés par des coudes, impliquant 3 à 4 résidus (Petsko et al., 2008).
– Les boucles : elles relient les différentes structures secondaires entre elles (hélice/hélice, hélice/brin ou encore deux brins n’appartenant pas au même feuillet).

Souvent situées à la surface de la protéine, elles sont à l’origine des changements de direction de la chaîne principale. Elles représentent environ un tiers des acides aminés (Petsko et al., 2008).

Structure tertiaire
La structure tertiaire décrit l’agencement spatial des éléments de structure secondaire en une conformation particulière. Elle est stabilisée par de multiples liaisons dont, par ordre de stabilité décroissante : les liaisons covalentes (ponts disulfures), électrostatiques (pont salin), hydrogènes, hydrophobes et par les interactions de Van der Waals. Les protéines possèdent un ou plusieurs domaines qui correspondent à des arrangements de structures tertiaires déterminés d’une partie de la chaîne polypeptidique. Un même domaine peut être retrouvé dans plusieurs protéines différentes (Petsko et al., 2008).

Structure quaternaire
Pour les protéines possédant plusieurs chaînes polypeptidiques, il est possible de distinguer un quatrième niveau de structure. Ainsi, la structure quaternaire décrit l’agencement dans l’espace de plusieurs chaînes polypeptidiques (sous-unités) ainsi que les interactions qui les lient.

Propriétés physico-chimiques

Masse moléculaire

La masse moléculaire d’une protéine se mesure en Dalton (Da), qui est une unité de masse atomique correspondant à la masse d’un atome d’hydrogène (1 Da = 1 g/mol). Elle peut aller de 2 kDa à 3.000 kDa – comme par exemple la titine, qui est la plus grande protéine connue chez l’être humain (Fulton et Isaacs, 1991). La masse moléculaire est un paramètre très important à prendre en compte en chromatographie car elle influe notamment sur la diffusion des molécules au sein des échangeurs (Hunter et Carta, 2002; Langford et al., 2006). Par exemple, lorsqu’une protéine atteint une certaine taille, il peut y avoir un phénomène d’exclusion de taille qui s’ajoute aux phénomènes déjà présents (comme l’échange d’ions ou l’hydrophobicité).

Charge nette et distribution des charges

La charge nette, ou charge globale, d’une protéine représente la charge moyenne de tous les résidus la composant. En effet, les acides aminés possèdent différents pKa et peuvent se retrouver protonés ou déprotonés selon le pH environnant. Ayant à la fois des propriétés basiques et acides, leur charge varie selon le milieu : lorsque pH < pKa, le groupement NH2 est ionisé (NH⁺₃ ) alors que lorsque pH > pKa, le groupement COOH est ionisé (COO−). Même s’il existe des valeurs de pKa connues pour chaque acide aminé (voir Tableau II.1), le pKa réel de chaque résidu peut légèrement varier en fonction de plusieurs paramètres comme la force ionique, les résidus à proximité spatiale ou encore la température. Cependant, la charge globale de la protéine va surtout dépendre de l’état de protonation des groupements sur les chaînes latérales, les groupements amines et carboxyles ne pouvant être ionisés qu’aux extrémités C- et N-terminales. Seuls certains résidus possèdent un radical -R pouvant être ionisé : ce sont les résidus titrables i.e. Arginine (Arg), Lysine (Lys), Histidine (His), Acide Aspartique (Asp), Acide Glutamique (Glu), Cystéine (Cys) et Tyrosine (Tyr).

Il existe un certain pH pour lequel la balance des charges négatives et positives de la protéine s’équilibre : on parle alors de point isoélectrique, ou pI, de la protéine. Ainsi dans ces conditions, la charge nette est nulle . Dans la plupart des cas, la charge globale de la protéine n’est pas une information suffisante pour déterminer le potentiel de rétention électrostatique d’une protéine. En effet, les charges de chaque résidu titrable peuvent ne pas être réparties équitablement ou uniformément sur la surface de la protéine. Le fait d’obtenir une charge nette nulle signifie uniquement que les charges se compensent. Ainsi, une protéine dans une solution dont le pH est proche du pI peut potentiellement interagir avec un support si la distribution des charge à sa surface est asymétrique (DePhillips et Lenhoff, 2001; Whitley et al., 1989). En revanche, une protéine dans un milieu proche du pI peut présenter des problèmes de stabilité car c’est à ce pH que sa solubilité est minimale (Tanford, 1961). Il peut également arriver que certaines charges ne soient tout simplement pas accessibles de par la taille ou la conformation d’une protéine, notamment dans les cas où les charges ne se situent pas à sa surface.

Dans certains cas très particuliers, il est également possible qu’une protéine ne possède pas de point isoélectrique, mais plutôt une « région » isoélectrique. C’est notamment le cas de CalB, qui est la lipase de Candida antarctica B, et dont il a été montré que sa purification par échange d’ions est difficile (Trodler et al., 2008). Dans des pH allant de 5 à 8 environ (voir Figure II.5), cette enzyme présente une charge nette nulle car elle ne possède aucun résidu titrable dont le pKa est compris entre ces valeurs, à l’exception d’une seule histidine. De ce fait, un changement de pH dans cette gamme ne changera pas la charge globale de l’enzyme. Ainsi, il peut s’avérer essentiel de bien connaître la répartition de charge sur une protéine à un pH donné lorsque le mode de rétention principal repose sur les forces électrostatiques.

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Table des matières

I Introduction générale
II Étude bibliographique
II.1 Les protéines : structure et propriétés
II.1.1 Structure des protéines
II.1.1.1 Les acides aminés
II.1.1.2 Les quatre niveaux de structuration des protéines .
II.1.2 Propriétés physico-chimiques
II.1.2.1 Masse moléculaire
II.1.2.2 Charge nette et distribution des charges
II.2 Les procédés chromatographiques pour la séparation de protéines
II.2.1 Les différents types de procédés chromatographiques
II.2.2 Fonctionnement du procédé
II.3 La chromatographie d’échange d’ions
II.3.1 Principaux mécanismes et phénomènes
II.3.2 Les résines échangeuses d’ions
II.3.2.1 Les matrices
II.3.2.2 Les groupements fonctionnels
II.3.2.3 Propriétés des résines
II.3.3 L’équilibre d’échange d’ions
II.3.3.1 Les isothermes d’adsorption
II.3.3.2 L’isotherme de Langmuir
II.3.3.3 La loi d’action de masse
II.4 La simulation moléculaire appliquée à l’échange d’ions des protéines
II.4.1 Modélisation moléculaire
II.4.1.1 Construction des modèles 3D
II.4.1.2 Modèles de représentation
II.4.1.3 La mécanique moléculaire
II.4.1.4 Échantillonnage de l’espace conformationnel
II.4.1.5 Effets de solvatation
II.4.1.6 Énergies libres de liaison
II.4.2 Modélisation protéine-support
II.4.2.1 Représentation des surfaces
II.4.2.2 Simulations moléculaires protéine-support
Conclusion
III Étude expérimentale
Introduction
III.1 Matériels
III.1.1 Support chromatographique
III.1.2 Protéines
III.1.2.1 α-chymotrypsine
III.1.2.2 Lysozyme
III.1.3 Solutions tampons
III.2 Méthodes analytiques pour la quantification de protéines
III.2.1 Analyse par spectrophotométrie UV-visible
III.2.2 Analyse par HPLC-SEC
III.2.3 Activité enzymatique
III.3 Détermination des isothermes
III.3.1 Expériences en batch
III.3.1.1 Protocole expérimental
III.3.1.2 Isothermes de l’α-chymotrypsine obtenues en batch à pH 5
III.3.2 Expériences en colonne
III.3.2.1 Protocole expérimental
III.3.2.2 Distribution de temps de séjour (DTS) de la colonne
III.3.2.3 Isothermes de l’α-chymotrypsine à pH 5
III.3.2.4 Isothermes de l’α-chymotrypsine à pH 7
III.3.3 Equilibre d’échange d’ions en système multi-protéines
Conclusion
IV Simulations moléculaires
Introduction
IV.1 Méthodologie
IV.1.1 Construction du système
IV.1.1.1 Protéines
IV.1.1.2 Support chromatographique
IV.1.1.3 Boîte de simulation
IV.1.2 Préparation des simulations
IV.1.2.1 Échantillonnage du système
IV.1.2.2 Mode opératoire
IV.1.2.3 Outils d’analyse
IV.1.3 Méthodes de calcul des paramètres SMA
IV.1.3.1 Charge caractéristique
IV.1.3.2 Facteur stérique
IV.2 Étude d’un système mono-protéine
IV.2.1 Stabilité de l’adsorption
IV.2.1.1 Critères de stabilité
IV.2.1.2 Analyse de l’adsorption et comportement de la protéine
IV.2.2 Étude de l’interaction protéine-ligands
IV.2.2.1 Identification des patches d’adsorption
IV.2.2.2 Énergies libres de liaison
IV.2.3 Comparaison des résultats expérimentaux et des simulations
IV.2.3.1 Charge caractéristique et facteur stérique
IV.2.3.2 Constante d’équilibre
IV.2.4 Conclusion
IV.3 Influence de l’environnement
IV.3.1 Effet de la force ionique
IV.3.2 Effet du pH
IV.3.2.1 Configuration du système
IV.3.2.2 Résultats
IV.3.3 Conclusion
IV.4 Étude d’un système bi-protéines
IV.4.1 Simulations avec deux protéines
IV.4.1.1 Configuration du système
IV.4.1.2 Résultats
IV.4.2 Simulations avec quatre protéines
IV.4.2.1 Configuration du système
IV.4.2.2 Résultats
IV.4.3 Conclusion
V Conclusion générale

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