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Agrobacterium tumefaciens C58
La séquence du génome de la souche A. tumefaciens C58 a été intégralement déterminée en 2001 (Goodner et al. 2001; Wood et al. 2001) et est composée de quatre éléments génétiques : un chromosome circulaire d’environ 2,8 Mb, un chromosome linéaire de 2 Mb, un plasmide At de 543 kb et un plasmide de virulence Tumor inducing (pTi) de 214 kb (Figure 3).
Le chromosome circulaire contient 2865 gènes. Il possède une origine de réplication semblable à celles des chromosomes bactériens. Le chromosome linéaire contient 1924 gènes et possède en revanche une origine de réplication semblable à celles retrouvées sur les plasmides. L’hypothèse avancée pour expliquer cette différence est que le chromosome linéaire a une origine plasmidique et que certains éléments du chromosome circulaire s’y sont dupliqués ou transférés (Goodner et al. 2001; Wood et al. 2001).
Le plasmide At (pour Agrobacterium tumefaciens) regroupe 617 gènes, dont aucun n’est indispensable à la survie de la bactérie. Cependant, un grand nombre d’entre eux codent pour des systèmes de transport et d’utilisation de molécules nutritives spécifiques, ce qui confère un avantage adaptatif à la souche C58 dans des niches écologiques particulières. Certains d’entre eux faciliteraient aussi l’assimilation de nutriments lorsque la bactérie est dans le sol. Le plasmide pAt possède également tous les gènes nécessaires à sa conjugaison (Chen et al. 2002). Il n’est pas nécessaire au caractère pathogène de la bactérie, entièrement conféré par le plasmide Ti, mais il jouerait un rôle dans l’attachement de la bactérie aux cellules de plantes, ainsi que dans la taille des tumeurs induites. Cependant, les mécanismes de ces effets n’ont pas encore été caractérisés (Nair, Liu and Binns 2003; Matthysse, Jaeckel and Jeter 2008; Morton et al. 2013; Platt et al. 2014). Ce plasmide est retrouvé dans la majorité des souches d’A. tumefaciens isolées, qu’elles soient virulentes ou non (Lassalle et al. 2011).
Figure 3 : Structure du génome d’A. tumefaciens C58. Représentation schématique du génome des quatre réplicons (5,67 Mb) : chromosome circulaire (2865 gènes sur 2,8 Mb), chromosome linéaire (1924 gènes sur 2 Mb), plasmide At (617 gènes sur 543kb) et plasmide Ti (233 gènes sur 214 kb). Les plasmides AtC58 et TiC58 sont représentés à échelle proportionnelle (x5 et x10 respectivement). Figure de Wood et al., 2001.
Le plasmide Ti comporte 233 gènes, et n’est pas, lui non plus, indispensable à la survie de la bactérie. Il est en revanche responsable de son caractère pathogène, notamment à cause de la présence du fragment plasmidique appelé ADN-T (ADN transféré) transféré dans le génome de la cellule végétale lors de l’infection. Le pTi comprend également les gènes vir, codant pour les protéines Vir, permettant, entre autres, le transfert de cet ADN-T. Ce phénomène de transfert entre domaines du vivant est unique aux agrobactéries (Goodner et al. 2001; Wood et al. 2001). Le pTi possède aussi les gènes du métabolisme de composés nutritifs spécifiques, appelés opines, qui sont produits par les cellules végétales ayant intégré l’ADN-T, puis transportés et utilisés par la bactérie. Enfin, le pTi possède les systèmes nécessaires à la communication bactérienne médiée par les signaux quorum sensing, les gènes traI et traR, ainsi que les régulons tra et trb permettant sa conjugaison.
Agrobacterium tumefaciens B6
La séquence du génome de la souche A. tumefaciens B6 a été déterminée en 2014, et est composée de quatre éléments génétiques comparables à ceux de C58 : un chromosome circulaire d’environ 2,9 Mb, un chromosome linéaire de près de 2,1 Mb, un pAt de 665 kB et un pTi de 194 kb.
Selon l’annotation automatique, il y aurait près de 2966 gènes sur le chromosome circulaire, environ 1960 sur le chromosome linéaire, 783 sur le pAt et 192 sur le pTi.
Les plasmides At et Ti de B6 ont une structure génique différente de celle de C58. Plusieurs gènes présents sur les uns sont absents sur les autres et certains opérons sont organisés de manière différente. Le pTiB6 a deux fragments d’ADN-T au lieu d’un, appelés ADN-TL pour « left », contenant les gènes codant la synthèse des hormones de plantes et celle de l’opine octopine, et ADN-TR pour « right » contenant les gènes codant la synthèse des mannityl-opines (Dessaux et al. 1998).
Quorum sensing
Le quorum sensing est un type de communication intercellulaire qui permet aux bactéries d’une même population de synchroniser l’expression de certains de leurs gènes en fonction de leur densité. Il s’agit pour les bactéries d’un comportement coordonné parfois essentiel pour leur survie, et souvent pour leur adaptation à certaines conditions environnementales ou leur virulence. Le système est basé sur la production et la perception d’une ou plusieurs molécules signal appelées auto-inducteur. Lorsque la densité de population est faible, cette molécule n’est pas produite en quantité suffisante dans le milieu pour être perceptible par les membres de la population bactérienne. En revanche, la multiplication cellulaire dans des conditions environnementales favorables entraine une augmentation de la concentration de l’auto-inducteur, qui devient alors suffisante dans le milieu pour dépasser un seuil critique de détection via une liaison à des facteurs de transcription protéiques spécifiques.
Ce mécanisme de régulation génique est largement répandu chez les bactéries, y compris chez Agrobacterium, et s’effectue toujours selon le même modèle avec des variations propres à chaque espèce.
LA GALLE DU COLLET
Description générale
Figure 4 : Exemples de tumeurs provoquées par le genre Agrobacterium. A : Deux tumeurs sur un plant d’euonymus (Nester 2008). B : Galle sur un plant de tomate, photo de la Florida Division of Plant Industry. C : Chevelu racinaire chez le tabac, image issue du site internet https://www.cals.ncsu.edu. D : Tumeur de grande taille sur un frêne, image issue de http://www.genomenewsnetwork.org.
La galle du collet est une maladie, connue depuis l’antiquité (Tempé 1987), infectant une large gamme de plante. Elle est répandue partout dans le monde, bien que rare en zones tropicales et subtropicales. Elle se caractérise par la formation d’excroissances tissulaires, appelées galles ou tumeurs végétales, au niveau du collet (entre le système racinaire et la tige, Figure 4). Ces galles peuvent aussi apparaître sur les racines et, plus rarement, sur les parties aériennes de la plante (tige, feuilles). La taille et la couleur des tumeurs varient en fonction de l’espèce infectée, de la partie de la plante infectée et au cours du temps. En vieillissant, les galles grossissent, brunissent, se lignifient et finissent par craqueler, permettant à d’autres microorganismes pathogènes ou opportunistes d’infecter la plante, ce qui peut engendrer son dépérissement.
La galle du collet a été observée sur 160 espèces différentes et a le potentiel d’affecter plus de 640 espèces réparties dans 93 familles (De Cleene and De Ley 1976). Un grand nombre d’entre elles présentent un intérêt agronomique ou horticultural, comme les plantes de la famille des Rosaceae, dont font partie le pommier, l’amandier ou encore le framboisier. Par conséquent, d’importantes pertes économiques sont associées à cette maladie, de l’ordre de 10 à 30% des plants pouvant être invendables notamment dans les pépinières. En effet, lorsqu’une plante est touchée par la galle du collet, elle s’en trouve fragilisée et son développement et son rendement diminuent significativement. Les plantes touchées appartiennent en grande majorité à la famille des dicotylédones mais les plantes monocotylédones peuvent aussi être infectées (Hiei, Ishida and Komari 2014).
L’apparition de cette maladie est favorisée par la présence de blessures causées par des chocs mécaniques ou climatiques (coup de bêche, gel, grêle). Ces blessures servent de point d’entrée pour A. tumefaciens et c’est à partir d’elles que les galles se développent.
Cycle d’infection d’Agrobacterium tumefaciens
Le mécanisme infectieux par lequel les souches pathogènes d’A. tumefaciens, c’est-à-dire celles qui possèdent un plasmide pTi, induisent l’apparition d’une tumeur met en jeu un processus de transgénèse. Ce mécanisme est également à l’origine de la formation du chevelu racinaire et des broussins de vigne induits par Rhizobium rhizogenes et A. vitis. A ce jour, ce sont les seuls exemples de transfert naturel d’information génétique entre bactéries et eucaryotes. Il a rapidement été utilisé en ingénierie génétique, notamment pour la mise au point de plantes transgéniques.
Le cycle infectieux d’A. tumefaciens se décompose en trois phases : (1) reconnaissance et attachement de la bactérie aux cellules de la plante hôte, (2) transfert et intégration du fragment ADN-T du plasmide de virulence dans le génome des cellules végétales infectées et (3) expression des gènes portés par l’ADN-T (Figure 5). Ce processus aboutit d’une part à la formation « physique » des tumeurs et d’autre part à la production par la plante des nutriments spécifiques pour les bactéries vivant dans les tumeurs en détournant les voies métaboliques des cellules infectées. Les tumeurs servent donc de niche écologique pour la bactérie.
Figure 5 : Chronologie de l’infection de la cellule par A. tumefaciens et transfert de l’information génétique portée par l’ADN-T. Adapté de Michel Chalot, Université de Franche-Comté.
Reconnaissance et attachement à la plante
L’établissement du cycle infectieux par lequel A. tumefaciens induit la formation de tumeurs chez son hôte trouve son origine au niveau des blessures de la plante. Cette dernière libère dans la rhizosphère diverses substances, notamment des monosaccharides et des composés phénoliques, à caractère normalement bactériostatiques, voire antibiotiques. Ces composés sont cependant des chimio-attractants pour A. tumefaciens vers lesquels cette bactérie se déplace, à l’aide de ses flagelles, en suivant un gradient de concentration croissant (Brencic and Winans 2005).
Une fois la bactérie recrutée au niveau de la blessure, un contact physique avec son hôte est nécessaire pour assurer le transfert de l’ADN-T. Ce contact fait intervenir plusieurs protéines codées par des gènes chromosomiques telles que ChvA, ChvB et ExoC (Cangelosi et al. 1987), responsables de la synthèse et de l’excrétion de polysaccharides de type β-1-2-glucane. Ces polysaccharides interagissent avec des molécules de la paroi végétale, telle que la vitronectine connue pour être impliquée dans le maintien de la structure et dans la cohésion des cellules de la paroi, ce qui permet l’attachement de la bactérie aux cellules de la plante.
Transfection et intégration de l’ADN-T dans le génome de la plante
Figure 6 : La régulation des gènes de virulence par le système VirA/VirG et ChvE. VirA est une histidine kinase transmembranaire qui détecte les composés phénoliques, les sucres et l’acidité produits par la plante. ChvE est une protéine périplasmique fixant des sucres qui établit un contact avec la partie périplasmique de VirA, ce qui accroit son activité. VirA phosphoryle le régulateur VirG, qui active alors la transcription des gènes vir. Extrait de Brencic and Winans, 2005.
La deuxième partie du processus infectieux est initiée par deux protéines Vir (VirA et VirG), dont les déterminants se situent sur la partie non transférée du pTi, et par le système ChvG-ChvI et la protéine périplasmique ChvE, codés par des gènes chromosomiques. L’acidité du milieu est détectée par le système ChvG-ChvI qui initie la transcription du régulateur transcriptionnel VirG. Dans le même temps, lorsque ChvE fixe des sucres de la plante, elle interagit avec le récepteur transmembranaire VirA, et augmente la sensibilité de ce dernier aux composés phénoliques (ex. acetosyringone et ferulate) de la plante et au bas pH (entre 5 et 5.5), ce qui permet son activation par autophosphorylation. Une fois activée, la partie cytoplasmique de VirA phosphoryle VirG qui se fixe alors sur les régions promotrices des gènes vir et permet leur transcription (Figure 6) (Brencic and Winans 2005).
Figure 7 : Modèle du complexe protéique SST4 permettant le transfert du brin-T du cytoplasme de la bactérie à celui de la cellule-hôte. Extrait de Backert and Meyer, 2006.
Une fois les gènes vir activés et un contact stable établi avec l’hôte, la bactérie transfère son ADN-T dans le noyau des cellules végétales, où ce dernier s’intègre dans leur génome. Ce processus est mené à bien par les protéines VirB, VirC, VirD, VirE et VirF, qui assurent chacune une fonction bien définie. Tout d’abord, les endonucléases spécifiques VirD1 et VirD2 excisent le fragment ADN-T du pTi de la manière suivante : VirD1 assure la séparation des deux brins de l’ADN-T grâce à son activité hélicase, tandis que VirD2 clive l’ADN-T au niveau des séquences répétées de 25 nucléotides, spécifiques des régions bordant ce fragment. Après l’excision, alors que le pTi est régénéré, VirD2 reste fixée de manière covalente à l’extrémité 5’ de l’ADN-T (Gelvin 2003). Le complexe VirD2-ADN-T formé, appelé aussi brin-T, peut ensuite être transféré dans la plante hôte grâce à une structure protéique particulière formant un canal entre la bactérie et la cellule végétale. Cette structure correspond à un système de sécrétion bactérien de type IV ou SST4 (Christie and Cascales 2005). Elle est formée de l’assemblage de 12 protéines : VirB1 à VirB11 et VirD4 (Figure 7).
Ce complexe protéique est organisé en trois sous-groupes. Le premier groupe est formé par les protéines à activité ATPasique VirB4, VirB11 et VirD4, qui permettent l’apport énergétique nécessaire à l’assemblage du complexe SST4 et au transfert du brin-T. Le second groupe est composé des protéines VirB6 à VirB10 et constitue le canal de translocation traversant les membranes bactériennes. Le troisième groupe est constitué d’oligomères de la piline VirB2, composante principale du pilus extracellulaire, et des protéines VirB5 et VirB7, probablement impliquées dans le contact entre la bactérie et la cellule végétale (Backert and Meyer 2006)(Figure 7). Ce système permet le passage du brin-T au travers des membranes bactériennes, de la paroi végétale et de la membrane de la cellule végétale pour arriver dans le cytoplasme de la cellule hôte. Il permet également le transport de quatre autres protéines effectrices, les protéines VirE2, VirE3, VirF et VirD5, en lien avec l’existence d’une séquence consensus dans leur partie C-terminale requise pour leur translocation (Vergunst et al. 2005).
Les protéines VirE2 recouvrent l’ADN-T pour le protéger de la dégradation par des nucléases endogènes (Gelvin 1998), formant ainsi un complexe brin-T-VirE2 appelé le complexe-T. Cependant, aucune donnée expérimentale ne certifie que ce complexe est formé dans le cytoplasme de la cellule végétale et la possibilité qu’il soit formé avant ou pendant la translocation n’est pas à exclure.
Le complexe-T est ensuite dirigé vers le noyau de la cellule hôte grâce aux séquences NLS (Nuclear Localisation Signal) des protéines VirD2 et VirE2. Plus précisément, VirD2 interagit avec des importines α et des cyclophilines endogènes (Howard et al. 1992; Ballas and Citovsky 1997) qui facilitent son entrée dans le noyau, et par conséquent celle du complexe-T. VirE2 quant à elle, interagit, entre autres, avec l’effecteur protéique VIP1 (VirE2-Interacting Protein) qui, une fois activé par phosphorylation, est recruté dans le noyau où il transporte le complexe VirE2-ADN-T (Djamei et al. 2007) (Figure 8).
Figure 8 : Mécanisme d’intégration de l’ADN-T dans le génome de la cellule végétale et les protéines impliquées dans ce processus. Une fois le complexe-T dans le cytosol de la cellule végétale, VirE2 interagit avec le facteur endogène VIP1, et avec VirE3, une protéine mimant VIP1. Grâce aux séquences NLS de VirD2, VirE3 et VIP1, le complexe peut être transporté dans le noyau, où VIP1 permet son interaction avec la chromatine. De son côté, VirF détourne le complexe ubiquitine ligase SCF afin de permettre l’ubiquitinylation de VirE2 et VIP1 pour les adresser au protéasome. L’ADN-T libéré est ensuite intégré dans le génome de la plante. Adapté de Bierne & Cossart 2012.
Une fois dans le noyau, l’ADN-T s’insère de manière aléatoire dans le génome de l’hôte, avec cependant une préférence pour les régions transcrites actives de la chromatine (Brunaud et al. 2002; Szabados et al. 2002; Li et al. 2006). Le mécanisme d’insertion reste peu clair, mais deux modèles d’intégration possibles, non exclusifs l’un de l’autre, ont été proposés. Le premier repose sur une recombinaison entre l’ADN-T simple brin et les régions du génome de la plante pour lesquelles il présente une micro-homologie (Tinland and Hohn 1995). Dans le deuxième modèle, l’ADN-T simple brin est d’abord répliqué pour former un double brin qui s’intègre dans le génome par recombinaison non homologue (non homologous end joining) (Chilton and Que 2003). Avant ou pendant le processus d’intégration, l’ADN-T se libère des protéines VirD2 et VirE2, en utilisant la voie de dégradation protéasomale. Pour cela, la protéine d’origine bactérienne VirF interagit avec le complexe de protéines endogènes Skp1-Cullin1-F-Box (SCF) qui permet l’ubiquitinylation. VirF mime la sous-unité de reconnaissance au substrat F-Box de SCF et cible VirD2 et VirE2 afin de permettre leur ubiquitinylation et leur adressage au protéasome (Schrammeijer et al. 2001; Bierne and Cossart 2012).
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Table des matières
CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1 AGROBACTERIUM TUMEFACIENS : AGENT ETIOLOGIQUE DE LA GALLE DU COLLET
1.1.1 Le genre Agrobacterium
1.1.1.1 Caractéristiques
1.1.1.2 Taxonomie
1.1.1.3 Génomes des souches C58 et B6
1.1.1.3.1 Agrobacterium tumefaciens C58
1.1.1.3.2 Agrobacterium tumefaciens B6
1.1.1.4 Quorum sensing
1.1.2 La galle du collet
1.1.2.1 Description générale
1.1.2.2 Cycle d’infection d’Agrobacterium tumefaciens
1.1.2.2.1 Reconnaissance et attachement à la plante
1.1.2.2.2 Transfection et intégration de l’ADN-T dans le génome de la plante
1.1.2.2.3 Expression des gènes portés sur l’ADN-T
1.2 PLASMIDES ET OPINES
1.2.1 Les différents types de plasmides
1.2.1.1 La classification des plasmides Ti
1.2.1.2 Les plasmides At
1.2.2 Les opines
1.2.2.1 Définition et origines
1.2.2.2 Les familles d’opines chez Agrobacterium
1.2.2.2.1 Les opines composées d’une partie acide aminé
1.2.2.2.2 Les composés d’Amadori
1.2.2.2.3 Les phosphodiesters de sucre : les agrocinopines
1.2.2.3 Métabolisme des opines
1.2.2.3.1 Synthèse des opines dans la plante
1.2.2.3.2 Transport et catabolisme des opines chez A. tumefaciens
1.2.2.4 Rôle des opines : le concept d’opine
1.2.2.5 Les mannityl-opines : une synthèse et une dégradation en plusieurs étapes
1.2.2.5.1 Synthèse à partir de trois protéines
1.2.2.5.2 La voie de transport et de catabolisme non spécifique
1.2.2.5.3 La voie de transport et de catabolisme spécifique pour l’acide mannopinique et l’acide agropinique
1.3 LES PROTEINES PERIPLASMIQUES DE LIAISON (PBP) : STRUCTURE ET MECANISME
1.3.1 Les transporteurs ABC
1.3.1.1 Généralités
1.3.1.2 Les domaines transmembranaires (TMD)
1.3.1.3 Les domaines de liaison à un nucléotide (NBD)
1.3.2 Les PBP : structure et mécanisme
1.3.2.1 Structure générale
1.3.2.2 Classification structurale
1.3.2.3 Liaison avec le ligand
1.3.2.4 Interaction avec les transporteurs
OBJECTIFS DE LA THESE
CHAPITRE 2 : ETUDES STRUCTURALES ET MESURES D’AFFINITE DES PBP MOTA CHEZ LA SOUCHE B6 ET SOCA ET ATTC CHEZ LA SOUCHE C58.
2.1 CONTEXTE SCIENTIFIQUE
2.2 PRESENTATION DES TRAVAUX
2.3 SOCA CAN BIND GLUTAMATE
2.4 CONCLUSION
CHAPITRE 3 : COMPARAISONS STRUCTURALE ET BIOPHYSIQUE DE DEUX PBP CAPABLES DE FIXER L’ACIDE MANNOPINIQUE CHEZ LA SOUCHE B6.
3.1 INTRODUCTION
3.2 RESULTS
3.2.1 Affinity of MotA and MoaA to Mannopinic acid
3.2.2 MotA Recognizes mannopinic acid
3.2.3 Trials to obtain MoaA structure
3.2.4 MoaA models
3.3 METHODS
3.4 CONCLUSION
CHAPITRE 4 : ASPECTS STRUCTURAUX ET BIOCHIMIQUES DES PBP PERMETTANT LE TRANSPORT DE L’ACIDE AGROPINIQUE CHEZ B6
4.1 INTRODUCTION
4.2 RESULTS
4.2.1 AgtB fold belongs to class D
4.2.2 AgtB recognizes agropinic acid only: the agropinic acid-binding signature
4.2.3 Affinity of AgtB and AgaA to agropine, agropinic acid and the other mannityl-opines
4.2.4 AgaA fold is a PBP from class C
4.2.5 AgaA specifically recognizes agropinic acid
4.2.6 Comparison between AgtB and AgaA structures
4.2.7 AgtB is branched with a few bacteria
4.2.8 The AgaA phylogenetical cluster is branched with peptide binding proteins
4.2.9 Agrobacterium tumefaciens R10 strain is able to import agropine
4.2.10 Construction of an agt-operon mutant
4.3 METHODS
4.4 CONCLUSION
CHAPITRE 5 : DISCUSSIONS ET PERSPECTIVES
5.1 TRANSPORT DU DFGA ET D’AUTRES COMPOSES D’AMADORI
5.2 LA REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES MOTABCD ET AGTABC
5.3 LA STRUCTURE DE MOAA
5.4 LE TRANSPORTEUR DE L’AGROPINE CHEZ B6
5.5 LE LIGAND D’ATTC
5.6 GENES PUTATIFS DE BURKHOLDERIA SP. PAMC 26561 RESPONSABLES DU CATABOLISME DE MANNITYL-OPINES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE 1 : STRUCTURES OBTENUES
ANNEXE 2 : ALIGNEMENTS DE SEQUENCES
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