Les protéines Hfq eubactériennes : domaines C- et N-terminaux

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Le rôle de Hfq in vivo

Hfq est un acteur important dans l’expression génétique des bactéries. Un mutant délété du gène hfq chez E. coli (mutant Δhfq) montre de nombreux phénotypes (effet pléiotropie d’une mutation) tels qu’une sensibilité accrue aux stress (entre autres sensibilité accrue à la pression osmotique, aux rayonnements UV et aux changements d’environnement en général) mais aussi une virulence affaiblie (diminution de la capacité de coloniser et survivre dans l’hôte infecté) [22]. On parle ici d’un rôle pléïotropique.
Les cellules Δhfq présentent aussi une différence au niveau de leur morphologie, avec un allongement des cellules [23], montrant un rôle dans le contrôle de la division cellulaire (régulation des gènes ftsZ et mreB) [24] [25].
Le gène hfq codant pour la protéine Hfq comporte plusieurs promoteurs (séquence d’ADN située en amont de la séquence codant la protéine) permettant la transcription de l’ARN messager (ARNm) hfq. Mais la synthèse de Hfq est autorégulée également au niveau traductionnel. La protéine limite sa traduction en se liant à son propre ARNm et en bloquant le site de fixation du ribosome (RBS) [26]. Hfq est abondante dans la cellule, on compte de 6 000 à 10 000 hexamères par bactérie (environ 60 000 monomères), avec une concentration maximum mesurée à 15μM (ce qui est comparable à la concentration de ribosomes). Mais les mesures sont différentes selon les souches, la phase de croissance et les conditions de culture [27]. La protéine est par exemple plus abondante en phase stationnaire.

Modes d’action de Hfq

Effets de l’hybridation des ARN avec Hfq

Hfq fait partie de la famille des protéines dites chaperon à ARN, permettant l’appariement entre deux séquences d’ARN [28]. Dans le cas de Hfq, ce rôle est important pour permettre l’hybridation d’un ARN régulateur non codant (ARNnc) avec un ARN messager (ARNm). Il faut noter que, chez les bactéries, ces ARNnc sont en général de petite taille et sont appelés sRNA pour « small RNA ». Le terme ARNnc est plutôt réservé aux eucaryotes.
Cette hybridation se fait en trois étapes. La première est l’interaction des ARN avec Hfq entraînant l’ouverture et le dépliement de la structure secondaire de l’ARN (surtout au niveau de l’ARNnc qui est en général très structuré). Cela permet dans un second temps un appariement sARN:ARNm:Hfq. Hfq permet aussi la formation d’un duplex en rapprochant les deux ARN. Ce processus est suivi par l’appariement ARNm:sARN. Enfin Hfq libère le duplex. Ce mécanisme est rapide, permettant à la bactérie une riborégulation efficace [29] [30] [31] [32]. La formation du complexe sARN-Hfq-ARNm a plusieurs conséquences (Figure 4) : (A) L’inhibition de la traduction de l’ARNm : la fixation d’un sARN par l’intermédiaire de Hfq sur ARNm cache le site de fixation du ribosome (RBS), empêchant la traduction. On peut retrouver cette inhibition par exemple pour les couples sARN/ARNm suivants : SgrS/ptsG, permettant la régulation et le transport du glucose-phosphate [33], RprA/csgD permettant la formation de biofilm pendant la phase stationnaire et répondant au stress [34], MicA/ompA permettant la synthèse de protéine de membrane externe [35] et RyhB/sodB permettant la régulation et la disponibilité en fer chez E. coli [36].
(B) Hfq permet d’accélérer la dégradation des ARNm qui ne sont plus traduits, étant devenus inutiles. L’arrêt de la traduction (voir (A)) entraîne la dégradation de l’ARNm sous l’action d’une RNase, principalement la RNAse E, endonucléase majeure chez E. coli [37]. En fait, cette dégradation peut avoir lieu de manière passive résultant uniquement de l’arrêt de la traduction, mais aussi de manière active, Hfq interagissant avec la RNAse E et attirant avec elle la machinerie de dégradation des ARN [38].
(C) Moins fréquent, Hfq peut au contraire libérer un RBS permettant la traduction de l’ARN. Cette libération est retrouvée pour les couples sARN/ARNm concernant le stress par choc thermique ou osmotique par la traduction du facteur sigma de la phase stationnaire, sigmaS. La traduction du gène rpoS (codant pour sigmaS) est stimulé par au moins deux sARN, DsrA pour le choc thermique « basse température » [39] et RprA pour un choc osmotique [40].
(D) Enfin Hfq permet également de protéger la dégradation par des ribonucléases des sARN [41]. Les effets décrits ci-dessus ont donc un rôle dans la régulation de la traduction et de la dégradation des ARN et sont dits post-transcriptionnels. Mais Hfq peut aussi avoir un effet de régulation sur la transcription, bien que celui-ci soit encore méconnu [42] [43].
Figure 4 – Différentes actions de régulation effectuées par Hfq. (A) Inhibition de la traduction de l’ARNm par le blocage du RBS par un sARN grâce à Hfq. (B) Dégradation de sARN et ARNm par la RNase E. (C) Activation de la traduction par la libération du RBS à l’aide d’un sARN.
Il a pu être montré que Hfq est capable d’interagir avec plus de 500 ARNm et plus de 100 sARN différents. Les affinités des liaisons ARN-Hfq sont très variables, et peuvent descendre jusqu’à quelques pM [44]. Ce nombre important de partenaires rend difficile la compréhension de discrimination et donc de régulation par Hfq car, bien que la protéine soit abondante, il pourrait y avoir compétition entre les ARN. Des études récentes cherchent à montrer de nouveaux mécanismes de régulation avec des protéines tierces permettant, par exemple, la liaison des ARN dont l’affinité pour Hfq est faible [45] [46].

Interaction des différentes régions structurales de Hfq avec les acides nucléiques

Comme nous l’avons vu précédemment, on peut distinguer deux régions : le domaine N-terminal et le domaine C-terminal. Le domaine N-terminal est le domaine possédant un repliement de type Sm permettant de former un tore. On distingue donc trois régions dans Hfq : la face proximale (où se trouvent les hélices α), la face distale (face opposée du tore) et le domaine C-terminal périphérique [47].
La face proximale a tendance à interagir avec les régions d’ARN riches en uraciles avec une stoechiométrie d’un nucléotide par monomère. Les sARN possèdent en général une séquence riche en uracile qui sera donc liée par cette face [28]. La face distale interagit quant à elle plutôt avec des régions riches en adénine, et en particulier avec le motif Adénine (A), Purine (R) et un nucléotide quelconque (N) (noté « ARN » sur la figure 5). Du fait de la présence de séquence riches en A dans la région 5’UTR des ARNm, cette face liera plutôt les ARNm [48][49].
Deux classes d’interaction ont été déterminées entre Hfq et sARN. Concernant la première classe (classe I), le sARN se fixe sur la face proximale, tandis que l’ARNm se fixe sur la face distale. L’appariement sARN/ARNm se fait avec le détachement de Hfq. La seconde classe (classe II) regroupe les sARN se fixant sur les faces proximales et distales, tandis que l’ARNm s’enroule autour de l’anneau. Néanmoins, certaines interactions ne peuvent être classifiées dans aucune de ces deux catégories [50].
Figure 5 – Schématisation des classes d’interaction d’ARN avec Hfq. Les séquences des sARN et ARNm présentent différents éléments : en rouge, la séquence qui se lie à la face proximale riche en uracile ; en violet, la séquence « UA » riche en uridine et adénine qui se lient au bord/anneau latéral contenant trois arginines consécutives (hélice α). Les éléments en bleu représentent des motifs de liaison ARN à la face distale riche en adénine. La classe I : sARN avec son extrémité 3’ riche en uracile se lie à la face distale tandis que l’ARNm se lie avec le motif « ARN » riche en nucléotides adénine et purine. La classe II : sARN se lie à la fois aux faces proximale et distale, et ARNm se lie au bord (modifiée de [50]).

Autres interactions : protéines et ADN

Comme nous l’avons vu, Hfq est acteur dans plusieurs voies de régulation par son action liée à l’ARN. Cependant, des études ont démontré qu’elle peut également se lier à d’autres protéines. Des interactions entre Hfq et la RNAseE ainsi que l’ARN polymérase ont été démontrées [51][38]. Il a également été montré que Hfq interagit avec la poly(A) polymérase bactérienne, ce qui influencera l’efficacité de dégradation des ARNm [52].

Hfq, une protéine associée au nucléoïde (NAP)

Hfq interagit aussi avec l’ADN et pourrait donc remplir des fonctions de régulation liées à l’ADN. Hfq affecte en effet de manière significative la structure de l’ADN [53], ce qui pourrait avoir un impact sur des processus tels que la réplication ou la transcription [54]. Des études ont montré que Hfq fait partie de la famille des protéines associées au nucléoïde (NAP, de l’anglais Nucleoid Associated Protein) [55][56][57][58].
Les NAPs ont une fonction essentielle dans la compaction et l’organisation de l’ADN chez la bactérie. En effet, l’ADN chromosomique, contrairement aux cellules eucaryotes, n’est pas contraint par une membrane. Cependant, il forme une structure compacte, due à l’implication d’une dizaine de protéines : le nucléoïde. Ces protéines permettent de replier et compacter cette macromolécule mille fois plus grande que la cellule bactérienne la contenant. Au moins une dizaine de protéines NAPs ont été identifiées, parmi lesquelles on pourra citer les protéines CbpA ( « curved DNA-binding protein A »), CbpB (« curved DNA-binding protein B »), DnaA (« DNA-binding protein A »), Dps (« DNA-binding protein from starved cells »), Fis (« factor for inversion stimulation »), Hfq, H-NS (« histone-like nucleoid structuring protein »), HU (« Histone-like protein of U93 »), IciA (« inhibitor of chromosome initiation A »), IHF (« integration host factor »), Lrp (« leucine-responsive regulatory protein ») et StpA (« suppressor of td(-) phenotype A »). Les affinités de ces NAPs peuvent aller de 25 nM (pour HU) à 250 nM (pour Hfq). Les NAPs peuvent avoir des mécanismes variés. Elles ont pour propriété commune de se lier et de modifier la conformation de l’ADN et parfois son superenroulement. Elles peuvent agir comme agent pontant, comme agent pliant et/ou rigidifiant. Ainsi, l’on donne souvent comme exemple de protéine pontant l’ADN la protéine H-NS, alors que HU est le modèle le plus couramment cité comme protéine pliant et rigidifiant l’ADN. Exemple, la protéine HU : la protéine HU a été mise en évidence pour la première fois chez la souche E. coli U93 en 1975 et sa fonction était définie alors comme semblable à celle d’une histone, d’où son nom H pour Histone-like protein et U pour la souche U93. HU est un hétérodimère chez E. coli car elle est composée d’un monomère α et d’un monomère β d’environ 9 kDa chacun. Lorsque la protéine est libre, (non fixée) sa conformation est plutôt désordonnée. Mais lors d’une fixation, un feuillet β se forme et chaque monomère entoure l’hélice d’ADN, ce qui la courbe et forme un tore (rotation d’un volume circulaire autour d’un axe). HU est la protéine la plus abondante dans le nucléoïde. Lorsque de nombreux dimères se fixent dans une même zone, ils peuvent former des filaments rigides d’ADN. Cette compaction extrême de l’ADN permet à la bactérie de contraindre son génome, mais également de pouvoir répondre à divers stress. L’angle de rotation de l’ADN par HU varie selon la séquence fixée, contrairement aux autres protéines du nucléoïde, ce qui facilite et multiplie les interactions possibles [59].
Exemple, la protéine H-NS : la protéine H-NS, pour Histone like Nucleoid Structuring, est une protéine également très abondante dans le nucléoïde de E. coli (environ 20 000 copies par cellule) [60]. Elle forme un homodimère de 2 x 15,6 kDa capable de se fixer sur des séquences d’ADN spécifiques riches en A/T (adénine et tyrosine) [61]. La structure complète de la protéine est encore méconnue. La structure de sa partie N-terminale a pu être obtenue par radiocristallographie tandis que celle de la partie C-terminale a été observée par RMN. La partie N-terminale permet la dimérisation de la protéine en utilisant un motif de type « leucine zipper » ou « coiled-coil » [61]. Suite à la liaison à l’ADN, d’autres dimères H-NS se fixent sur la séquence, formant des polymères de la protéine le long de la chaine d’acide nucléique. Ces interactions entre protéines peuvent avoir lieu sur de grandes distances, ce qui permet de compacter des régions d’ADN éloignées et ainsi de structurer complètement le nucléoïde par des phénomènes de pontage ou « bridging » [62]. H-NS inhibe alors la transcription dans les zones où elle se fixe et permet donc de réguler l’expression génétique de manière pléïotropique. On pense, mais ce point sera discuté dans le chapitre III, que Hfq aurait une fonction proche de celle de H-NS, mais en utilisant une région amyloïde pour ponter l’ADN alors que H-NS utilise une région de type leuzine zipper. De plus les deux protéines ont des spécificités de séquence assez proches [63] et pourraient interagir physiquement et fonctionnellement [64][65].
En plus de compacter le génome, toutes ces interactions ont un rôle de modulation des processus liés à l’ADN (transcription, réplication, réparation…) et à sa réorganisation dynamique. Elles peuvent ainsi par exemple influencer positivement ou négativement la transcription en ouvrant ou contraignant des boucles d’ADN. Il faut aussi savoir que les NAPs ne sont pas exprimées de manière constante lors du cycle cellulaire, et leur expression dépend de la phase de croissance et du changement environnemental. Les différentes NAPs ont une abondance propre, ainsi que des fonctions et des affinités différentes pour l’ADN. In vivo, les NAPs sont généralement des régulateurs pléïotropiques, ce qui rend difficile la compréhension de leur mission. Mais on peut déterminer plus facilement le type de contraintes exercées par les NAPs sur l’ADN par des analyses in vitro.
Il a été par différentes techniques montré que Hfq, de manière comparable à d’autres NAPs telles que HU et H-NS, condense fortement l’ADN [19]. En fait, à ce jour, Hfq est la protéine qui a le plus fort effet compactant in vitro, même si elle est moins abondante que HU et H-NS et avec une affinité moindre.

Table des matières

Introduction
État de l’art
1. La protéine Hfq
1.1. Structure de la protéine Hfq
1.1.1. Hfq, une protéine de type Sm procaryote
1.1.2. Les protéines Hfq eubactériennes : domaines C- et N-terminaux
1.1.3. La protéine Hfq de Escherichia coli
1.2. Le rôle de Hfq in vivo
1.3. Modes d’action de Hfq
1.3.1. Effets de l’hybridation des ARN avec Hfq
1.3.2. Interaction des différentes régions structurales de Hfq avec les acides nucléiques
1.3.3. Autres interactions : protéines et ADN
1.3.4. Hfq, une protéine associée au nucléoïde (NAP)
1.4. Localisation cellulaire et super-structure secondaire de Hfq
1.5. Le domaine C-terminal de Hfq
2. Les amyloïdes
2.1. Description et caractéristiques
2.1.1. L’amylose
2.1.2. Les amyloïdes : une voie d’agrégation des protéines
2.1.3. Les structures amyloïdes : feuillets β croisés (cross-β)
2.1.4. Dynamique et mécanisme de formation des amyloïdes
2.1.5. Caractéristiques physico-chimiques des fibres amyloïdes
2.1.6. Cas particulier : les prions
2.2. Concept d’amyloïdes fonctionnelles
2.2.1. Concernant la fonction des IDPs
2.2.2. Les amyloïdes fonctionnelles
2.2.3. Interaction amyloïde-membrane et amyloïde-ADN
2.2.4. Exemples d’amyloïdes bactériens
2.3. Inhibiteurs d’amyloïdes
2.3.1. Introduction : inhibiteurs d’amyloïdes
2.3.2. Les différents types d’inhibiteurs
Matériel et méthode : Panorama des techniques utilisées pour l’étude des amyloïdes
1. Introduction – Interaction lumière/matière
2. La spectroscopie infrarouge
2.1. Introduction à la spectroscopie infrarouge
2.1.1. L’absorption en infrarouge
2.1.2. La spectroscopie infrarouge à Transformée de Fourier
2.2. Mode de mesure et échantillonnage
2.3. Imagerie chimique et résolution spatiale
2.3.1. Spectromicroscopie infrarouge en champ lointain
2.3.2. Microscopes en champ proche
2.3.3. Microscope à force atomique
2.3.4. Spectromicroscope infrarouge en champ proche
2.3.4.1. Introduction
2.3.4.2. Techniques en champ proche thermique
2.3.4.3. L’AFM-IR : présentation et fonctionnement
2.3.4.4. Évolution et amélioration de AFM-IR
2.4. Étude de la structure secondaire des protéines par IRTF
2.4.1. Les bandes d’absorption polypeptidique
2.4.2. Détermination de la structure secondaire par la bande amide I
2.4.3. Analyses structurales avec les autres bandes amides
2.4.4. Détermination de la structure in vivo
2.5. Conclusion sur la spectroscopie infrarouge
3. Dichroïsme circulaire
3.1. Introduction
3.2. Le principe de la spectroscopie CD
3.3. Détermination des structures secondaires par dichroïsme circulaire
3.3.1. Échantillons de protéines ou de peptides
3.3.2. Échantillons d’acides nucléiques
3.4. Conclusion
4. Techniques complémentaires pour sonder les amyloïdes
4.1. La microscopie électronique en transmission
4.2. La diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS)
4.3. Spectroscopie de fluorescence : Thioflavine T colorant des amyloïdes
Études : résultats et discussion
Chapitre I : caractérisation de la structure amyloïde du domaine CTR de Hfq
1. Identification de l’amyloïde du domaine C-terminal d’Hfq
1.1. Identification par un ensemble de techniques physico-chimiques
1.2. Mesures cinétiques
1.2.1. Test en présence de Thioflavine T
1.2.2. Cinétiques en spectroscopie IRTF
1.2.3. Analyses in vivo
1.2.3.1. Souche BL21(DE3)
1.2.3.2. Souche MG1655
2. Discussion
Chapitre II : mise en place d’une technique corrélative pour l’étude de nano-objets : application sur les fibres amyloïdes
1. Présentation de l’article
2. Discussion
Chapitre III : rôle de la formation amyloïde d’Hfq sur la topologie de l’ADN
1. Présentation de l’article
2. Discussion
Chapitre IV : interaction entre le domaine C-terminal de la protéine Hfq et des inhibiteurs d’amyloïdes
1. Études de APOM et EGCG sur le peptide CTR38
2. Études de l’effet EGCG sur le peptide 11aa
3. Études de l’effet EGCG in vivo
Chapitre V : caractérisation structurale des fibres amyloïdes/ADN et analyse des propriétés rhéologiques du système.
1. Introduction
2. Analyse du complexe CTR38/ADN
3. Microrhéologie : la spectroscopie magnétique rotationnelle
4. Montage de l’expérience
5. Résultats et discussion
5.1. Double brin d’ADN (dAdT)60 seul
5.2. Peptide CTR38 seul
5.3. Complexe CTR38 + (dAdT)60
Conclusion
Bibliographie
Annexe A : Article 1 Techniques to analyze sRNA protein cofactor self-assembly in vitro
Annexe B : Article 2 Correlative infrared nanospectroscopy and transmission electron microscopy to investigate nanometric amyloid fibrils: Prospects and challenges
Annexe C : Article 3 Revised role for Hfq bacterial regulator on DNA topology
Annexe D : Article 4 Tailoring the Hydrophobicity of Mesoporous Organosilica for Protein Trapping and Supported Catalysis

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