Les protéines à structure Kunitz dans les toxines animales

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Toxines et récepteurs couplés aux protéines G

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont une catégorie de récepteurs physiologiques largement distribués dans l’organisme et impliqués dans la quasi-totalité des processus biologiques (les RCPG seront précisément décrits dans le chapitre II de cette Introduction). Ils sont une cible thérapeutique de premier choix et 40 % des médicaments actuellement sur le marché sont dirigés sur un RCPG. Les premières toxines actives sur les RCPG sont en réalité des analogues mimant des peptides agonistes des récepteurs (« agonist mimicking toxins ») et leur identification date des années 1980 avec les conopressines actives sur les récepteurs à la vasopressine et à l’ocytocine et les sarafotoxines, des vasoconstricteurs homologues de l’endothéline-1 (Cruz et al. 1987; Kloog et al. 1988). Par la suite, des analogues des prokinéticines ont été mis en évidence comme MIT1 chez le mamba noir ou bv8 chez la grenouille (Schweitz et al. 1999; Li et al. 2001). Les premières « vraies » toxines actives sur des RCPG, c’est-à-dire de structure et composition totalement différentes de l’agoniste naturel du récepteur, ont été découvertes dans le venin des différents mambas avec les toxines muscariniques et les toxines adrénergiques, comme le groupe des toxines MT1 à 7 ou les -Da1a et b, qui sont des toxines à repliement trois doigts (Jolkkonen et al. 1995; Maïga et al. 2013; Rouget et al. 2010). Deux toxines de cônes ont été identifiées dans les années 2000 : l’antagoniste adrénergique -TIA et l’antagoniste du récepteur à la somatostatine -CnVA (Petrel et al. 2013; Sharpe et al. 2003).
En somme, très peu de toxines ciblant des RCPG sont connues pour le moment et l’équipe du Docteur Denis Servent (Service d’Ingénierie Moléculaire des Protéines – SIMOPRO, CEA Saclay, Gif-sur-Yvette), dans laquelle j’ai réalisé ma thèse, est l’une des seules au monde à travailler sur cette catégorie de toxines. Elle s’est spécialisée dans le criblage de venins dirigé sur des RCPG à intérêt thérapeutique. C’est ainsi qu’a été découverte, en 2008, la mambaquarétine-1, qui est à la fois la première toxine active sur un récepteur à la vasopressine et la première toxine de type Kunitz active sur un RCPG. Les toxines Kunitz
Les molécules dites de type Kunitz correspondent à une famille de peptides associée à deux activités majoritaires : l’inhibition de protéases à sérine circulantes et le blocage de canaux potassiques. Elles sont réparties de façon ubiquitaire entre les plantes, les animaux et les microorganismes et sont exprimées dans divers tissus de leurs hôtes. La suite de ce chapitre sera consacrée aux peptides Kunitz animaux présents dans les venins.

Phylogénie des toxines Kunitz

Les toxines Kunitz sont présentes dans pratiquement toutes les espèces venimeuses, ainsi que dans les sécrétions de tiques ou d’insectes, qui peuvent s’apparenter aux venins.
Parmi ces dernières espèces, qui ne seront plus abordées par la suite, il existe de nombreuses variations structurales et l’activité antiprotéase dirigée contre les facteurs de la coagulation est la plus fréquente (Hargreaves et al. 2014; Fry 2015).
La façon dont les gènes de toxine évoluent est encore discutée. Deux théories s’opposent : la duplication-recrutement, la plus souvent évoquée, et la duplication-restriction, plus récente. La duplication-recrutement serait liée à la perte d’adressage de certaines protéines pour ses tissus d’origine par mutation lors de la duplication et l’apparition d’une séquence régulatrice permettant son expression au niveau de la glande à venin. La théorie de la duplication-restriction serait uniquement liée à la perte de l’expression de certaines toxines dans les tissus non venimeux lors de la duplication des gènes mais avec le maintien de la séquence d’adressage aux organes sécrétoires (Figure 4). Cependant, ces deux théories ne sont pas incompatibles et il est possible que selon les espèces, l’un de ces deux modes d’évolution soit privilégié par rapport à l’autre mais pas unique.
Figure 4 – Restriction et recrutement des gènes. Les gènes dupliqués peuvent être soit restreints soit recrutés à la glande à venin en fonction des combinaisons des facteurs de transcription de la région régulatrice. La croix indique la mutation ou la perte d’une région régulatrice. (Hargreaves et al. 2014)
L’évolution des Kunitz est grandement compatible avec la théorie de duplication-restriction puisqu’elles dérivent de protéines issues d’une grande variété de tissus dont le cerveau, les poumons, les ovaires ou l’utérus mais sans qu’elles puissent être rapprochées d’un groupe de protéines humaines en particulier (Fry 2005). Aucune protéine ancestrale n’a pu être identifiée mais celle-ci serait très probablement commune avec les waprines, des toxines de serpent dont l’activité est encore mal caractérisée. En effet, ces deux groupes de peptides partagent une très importante homologie de séquence pour leur peptide signal et leur site de clivage (Zupunski et al. 2003; St. Pierre et al. 2008). Il est intéressant d’observer que les Kunitz ont évolué dans plusieurs espèces venimeuses distinctes de façon conjointe pour aboutir à la même activité spécifique (Fry 2015). C’est le cas des Kunitz bloqueurs de canaux potassiques qui existent aussi bien chez différentes espèces d’anémones de mer que chez les serpents (Fry 2005). Par ailleurs, plusieurs toxines Kunitz d’anémones de mer ont la particularité d’être actives aussi bien sur les protéases que sur les canaux potassiques. C’est le cas par exemple de ShPI-1 (Stichodactyla helianthus) ou de APEKTx1 (Anthopleura elegantissima) (García-Fernández et al. 2016; Peigneur et al. 2011).
Dans le sous-ordre des serpents, les Kunitz sont majoritairement représentés dans les familles des Élapidés et des Vipéridés qui partagent une protéine Kunitz ancestrale commune (Zupunski et al. 2003; Fry & Wüster 2004).

Structure canonique des peptides Kunitz

Le premier peptide Kunitz, identifié en 1936 chez le boeuf, est un inhibiteur pancréatique de la trypsine (BPTI), aussi appelé aprotinine (Kunitz & Northrop 1936). Sa structure a été obtenue par cristallographie en 1970 (Huber et al. 1970), puis en solution par résonnance magnétique nucléaire (RMN) en 1989 (Wüthrich 1989). La numérotation des résidus utilisée dans ce paragraphe pour décrire une structure Kunitz se basera sur celle du BPTI et pourra être légèrement décalée pour d’autres peptides.
Les peptides Kunitz animaux (Kunitz-A) adoptent une structure de type  particulièrement conservée. Ils possèdent une courte hélice  dans la partie N-terminale, puis une boucle 1 se dessine jusqu’au premier segment d’un feuillet  à deux brins antiparallèles. Les deux brins du feuillet  sont séparés par un coude  formé par les résidus 25 à 29. La boucle 2 se prolonge jusqu’à l’hélice  dans la partie C-terminale, des positions 48 à 56. Trois ponts disulfure hautement conservés maintiennent à la fois la conformation et stabilisent les sites de liaison : Cys5-Cys55, Cys30-Cys51 et Cys14-Cys38 (Figure 5-a) (Ranasinghe & McManus 2013). Quelques rares exemples montrent des variations de ce schéma. La conkunitzine-S1, identifiée dans le venin du cône Conus striatus, est la première protéine Kunitz-A identifiée ne possédant que deux ponts disulfure sans que la structure et l’activité ne soient altérées (Bayrhuber et al. 2005). De même, la toxine du scorpion Lychas mucronatus SdPI, un puissant inhibiteur de trypsine, ne possède pas le second pont disulfure. En revanche, sa séquence contient deux cystéines supplémentaires dans la partie C-terminale, susceptibles de former un troisième pont disulfure (Zhao et al. 2011). Cinq résidus ont été démontrés comme indispensables au maintien de la structure grâce aux interactions hydrophobes qu’ils établissent entre eux : Tyr23, Phe33, Tyr35, Asn43 et Asn44 (Figure 5-b). Ainsi, une seule mutation de l’un d’entre eux peut suffire à entrainer une réorganisation intramoléculaire et déstabiliser la conformation du site de liaison (Hanson et al. 2003).
Figure 5 – Structure du BPTI. a) Principaux éléments de structure du BPTI, avec ces ponts disulfure et la position P1 (Lys15) mis en évidence (Paesen et al. 2009). b) Structure du BPTI (gris) lié à la trypsine (bleu). Les 5 résidus structuraux hautement conservés sont mis en évidence (Hanson et al. 2003).

Principales activités des peptides Kunitz

Le repliement Kunitz est classiquement associé à deux activités biologiques : l’inhibition de protéases à sérine et le blocage de canaux potassiques voltage-dépendants de type 1 (Kv1). Depuis quelques années, plusieurs activités nouvelles ont été mises en évidence dans les venins.
a) Les inhibiteurs de protéases
La base de données MEROPS répertorie et classe tous les inhibiteurs de protéases. Les Kunitz animaux appartiennent à la famille I2 qui compte 9016 séquences dont 78 peptides caractérisés pharmacologiquement et 21 structures résolues (Rawlings et al. 2016). D’après les séquences de protéines Kunitz connues, 80 % seraient des inhibiteurs de protéases.
Les études de structure-activité ont mis en évidence une série de six résidus critiques très exposés et localisés sur la boucle 1, aussi appelée boucle de liaison aux protéases (Ranasinghe & McManus 2013). Il s’agit des positions 13 à 18 chez le BPTI, respectivement nommées P3-P2-P1-P′1-P′2-P′3 selon la nomenclature des sites catalytiques peptidiques (Schechter & Berger 1967). Le BPTI forme un complexe irréversible avec les protéases, inhibant ainsi leur activité. La position P1 est cruciale : la mutation Lys15Gly ou Lys15Ala suffit à faire perdre un facteur 1000 en affinité pour la trypsine (Czapinska et al. 2000). La nature du résidu qui occupe cette place oriente la sélectivité du peptide. Une charge positive (lysine ou arginine) est associée à une activité antitrypsine alors qu’un acide aminé hydrophobe (souvent leucine ou méthionine) est plutôt associé à une activité antichymotrypsine. La position P′1 est principalement occupée par une alanine ou une glycine (Ranasinghe & McManus 2013) (Tableau 1).
Tableau 1 – Nature des acides aminés aux positions P1 et P′1 de différentes toxines Kunitz et activité associée.
(Modifié d’après Ranasinghe and McManus, 2013)
La grande majorité des Kunitz inhibiteurs de protéases ont pour cible une protéase à sérine. Quelques Kunitz sont connus pour leur activité sur des cystéine-protéases ou des aspartylprotéases ou encore pour leur activité à large spectre sur plusieurs types de protéases, comme c’est le cas de la toxine ShPI-1, extraite du venin de l’anémone S. helianthus (Rawlings et al. 2016; Smith et al. 2016; Delfin et al. 1996).

Les bloqueurs de canaux potassiques

Dans les années 1980, des homologues structuraux des inhibiteurs de protéases ont été mis en évidence dans le venin de certains élapidés. Ces toxines, peu ou pas actives sur les protéases, sont des neurotoxines actives sur les récepteurs potassiques (Harvey & Karlsson 1980). Par blocage de ces canaux, principalement de type Kv1, elles facilitent le relargage d’acétylcholine au niveau de la jonction neuromusculaire. Le premier représentant de ce groupe de peptides Kunitz est l’-dendrotoxine, extraite du venin du mamba vert (Dendroaspis angusticeps) et qui a donné son nom à l’ensemble des toxines homologues, les dendrotoxines (Harvey & Karlsson 1980). Les dendrotoxines peuvent être à nouveau subdivisées en fonction de leur sélectivité et de leur structure primaire. On distingue le groupe de la -dendrotoxine et de la dendrotoxine-K, sélectif du canal Kv1.1, et le groupe de l’-dendrotoxine et de la dendrotoxine-I, sélectif des canaux Kv1.1/2 et 6 et qui possèdent deux résidus supplémentaires en N-terminale. D’autres bloqueurs de canaux potassiques ont été caractérisés chez d’autres espèces, comme c’est le cas chez l’anémone de mer (Anemonia sulcata) avec le groupe des kalicludines (Schweitz et al. 1995).
Les bloqueurs de canaux potassiques n’utilisent pas la même stratégie de liaison que les inhibiteurs de protéases. L’activité est portée par la région N-terminale, et principalement les six résidus des positions 3 à 9, la Cys7 étant impliquée dans un pont disulfure. Le mécanisme d’action repose sur la présence d’une charge positive en position 5 ou 3 (selon le sous-groupe de dendrotoxines), généralement une lysine, qui mime la charge positive de l’ion K+ (Figure 6) (Gasparini et al. 1998).
Figure 6 – Structure cristallographique de l’-dendrotoxine. Structure obtenue par diffraction aux rayons X (PDB : 1DTX). La couleur des résidus correspond à l’importance de la perte d’affinité lorsqu’ils sont mutés d’après Gasparini et al. 1998. Vert : perte d’affinité d’un facteur 5 à 10 ; orange : perte d’affinité d’un facteur 10 à 100 ; rouge : perte d’affinité d’un facteur supérieur à 100. Jaune : ponts disulfure.

Autres activités Kunitz portées par des toxines

Depuis quelques années, des activités différentes de l’inhibition de protéases ou du blocage des canaux K+ ont été mises en évidence chez des toxines Kunitz. Ces activités originales ne sont généralement portées que par un ou deux représentants.
Les Pr-mulgines-1, -2 et -3 sont des peptides Kunitz extraits du venin de Pseudechis australis. Si les Pr-mulgines-2 et -3 ont une activité inhibitrice des protéases à sérine classique (antitrypsine, antichymotrypsine, antiplasmine), la Pr-mulgine-1 inhibe exclusivement la métalloprotéase matricielle 2 (Inagaki et al. 2012).
Deux toxines de l’anémone de mer Heteractis crispa exercent une activité antagoniste sur les récepteurs 1 vanilloïdes à potentiel transitoire qui sont des récepteurs calciques thermosensibles impliqués dans les phénomènes de nociception. APHC1 et 3 sont caractérisées par la présence d’une thréonine en position P1 au lieu d’une lysine, supposée responsable de leur activité (Andreev et al. 2008). Elles sont également faiblement inhibitrices de la trypsine (constante d’inhibition (Ki) > 500 nM) (Gladkikh et al. 2015).
Une activité anti-canal calcique a été mise en évidence chez deux toxines. D’abord la calcicludine, une toxine extraite du venin de Dendrosapis angusticeps (Schweitz et al. 1994; Gilquin et al. 1999). Celle-ci n’a aucune activité antitrypsine ou bloqueur de canaux K+ et ne possède dans sa séquence aucun des acide aminés associés à ces activités, excepté une lysine en P1. En revanche, elle inhibe les canaux calciques voltage-dépendants de type L (Schweitz et al. 1994). La taicatoxine a été mise en évidence dans le venin du taipan Oxyuranus scutellatus. Il s’agirait d’un complexe polymérique composé d’une -neurotoxine, d’une phospholypase A2 (PLA2) et d’un peptide Kunitz de stoechiométrie 1:1:4 (Possani et al. 1992; Doorty et al. 1997).
Une toxine hétéromérique extraite du venin du serpent Micrurus tener tener a montré une activité agoniste des récepteurs ioniques sensibles aux protons (Bohlen et al. 2011). Ces derniers jouent un rôle majeur dans la nociception. La toxine MitTx se compose d’une sous-unité Kunitz et d’une sous-unité PLA2.
L’association hétérodimérique d’un peptide Kunitz avec une PLA2 n’est pas une exception. La -bungarotoxine, extraite du venin de Bungarus multicinctus, est formée en réalité de deux sous-unités : la chaine A1, de conformation PLA2 et de la chaine B2, de conformation Kunitz. La chaine B2 possède une cystéine supplémentaire dans la partie C-terminale qui établit un pont disulfure avec une cystéine située dans la partie N-terminale de la chaine A1. Cette toxine bloque les canaux K+ et n’a aucune activité antitrypsine. La partie Kunitz ne possède dans sa séquence aucun des résidus conventionnels pour ce type d’activité (Pro5 et Lys9) (Kwong et al. 1995).

Utilisation thérapeutique des peptides Kunitz

Si les toxines ont longuement été étudiées afin de mettre au point des antidotes contre les envenimations, elles sont depuis peu considérées tout autrement. En effet, leur haute sélectivité et affinité pour leur cible, comme leur résistance aux protéases grâce à leur repliement compact en font des outils de recherche de choix, tout comme de potentiels candidats thérapeutiques novateurs. Ainsi, plusieurs peptides Kunitz, d’origine venimeuse ou non, sont déjà utilisés en clinique ou sont en cours d’étude.
Le BPTI a été commercialisé à partir de 1993 sous le nom de Trasylol® (Bayer) pour son activité antifibrinolytique par inhibition de plusieurs protéases impliquées dans la cascade de coagulation. Il était indiqué dans la prévention des pertes de sang au cours des chirurgies cardiaques à haut risque (Koster et al. 2015). Cependant, plusieurs études ont montré une moindre efficacité comparée aux autres molécules dans la même indication ainsi qu’une augmentation des décès dans les 30 jours suivant les interventions sous Trasylol®, ce qui a conduit les autorités de santé à demander l’arrêt de sa commercialisation en 2008 (Fergusson et al. 2008).
La textilinine est actuellement à l’étude afin de remplacer le BPTI dans la même indication. Cette toxine du serpent Pseudonaja textilis, qui partage 45 % d’homologie de séquence avec le BPTI, a l’avantage d’être particulièrement sélective pour la plasmine (Willmott et al. 1995). De plus, elle se dissocie rapidement de sa cible et est rapidement éliminée de l’organisme (Millers et al. 2009).
Plus récemment, le criblage de variants de l’inhibiteur de la voie du facteur tissulaire par la technique de phage display a permis d’identifier un puissant et sélectif inhibiteur de la kallicréine plasmatique, une protéase à sérine impliquée dans la coagulation, la fibrinolyse, l’hypotension, la douleur et l’inflammation (Williams & Baird 2003). Ce peptide Kunitz appelé écallantide, et commercialisé sous le nom de Kalbitor® (Shire) aux États-Unis, est indiqué dans le traitement de la crise aigüe d’angioedème héréditaire.
Connue depuis les années 60, l’ulinastatine, également appelée bikunine, mingine ou encore inhibiteur urinaire de trypsine, est une protéine humaine à deux domaines Kunitz (Xu et al. 1998). Elle possède une activité antiprotéase à large spectre et est commercialisée sous le nom d’U-Tryp® (Bharat Serums & Vaccines Ltd.) en Chine, en Inde et en Corée du Sud et sous le nom de Miraclid® (Mochida Pharmaceutical) au Japon.

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Table des matières

INTRODUCTION
I. Les protéines à structure Kunitz dans les toxines animales
1) Organisation structurale des toxines
2) Activité biologique des toxines
3) Toxines et récepteurs couplés aux protéines G
1) Phylogénie des toxines Kunitz
2) Structure canonique des peptides Kunitz
3) Principales activités des peptides Kunitz
4) Utilisation thérapeutique des peptides Kunitz
II. Les récepteurs couplés aux protéines G
1) Classification
2) Description moléculaire du fonctionnement des RCPG Rhodopsine
1) Cycle de désensibilisation et internalisation
2) Signalisation dépendante des protéines G
3) Signalisation indépendante des protéines G
1) La vasopressine
2) Localisation et fonctions de V2R
3) Signalisation différentielle induite par V2R
4) Organisation structurale de V2R
III. Les polykystoses rénales
1) Description générale
2) Le néphron, unité fonctionnelle du rein
3) Physiologie rénale
1) Régulation de l’osmolarité
2) Fonction ciliaire
1) Génétique
2) Épidémiologie
3) Dysfonctionnements cellulaires
4) Évolution clinique
1) Axes thérapeutiques envisagés
2) Stratégies thérapeutiques actuellement appliquées
IV. La mambaquarétine-1
Effet de MQ-1 sur un modèle murin de polykystose rénale
OBJECTIFS
RESULTATS ET DISCUSSION
I. Exploration pharmacodynamique de la mambaquarétine-1
1) Effet sur 24 heures
2) Effet au-delà de 24 heures
II. Découverte de nouvelles toxines aquarétiques
Arbre phylogénétique
Découvertes de nouvelles toxines inhibitrices de V2R
Caractérisation pharmacologique des toxines actives sur V2R
1) Synthèse chimique des toxines
2) Affinité pour V2R
3) Caractérisation fonctionnelle in vitro
4) Modélisation de la structure tertiaire des nouvelles toxines aquarétiques
5) Caractérisation fonctionnelle in vivo
III. Exploration du pharmacophore de la mambaquarétine-1
1) Description des séquences Kunitz naturelles
2) Choix des variants
3) Affinité des variants synthétiques de MQ-1 pour V2R et corrélation avec l’affinité des variants naturels
1) Modèles 1 et 2
2) Modèles 3 et 4
IV. Développement thérapeutique de la mambaquarétine-1
Point de vue industriel autour du développement thérapeutique de la mambaquarétine-1
Études complémentaires de la mambaquarétine-1 pour son développement thérapeutique
1) Immunogénicité de MQ-1
2) Voie d’administration
3) MQ-1, agoniste inverse de V2R
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
I. Effet et devenir in vivo de la mambaquarétine-1 chez le rat
II. Initiation du développement thérapeutique de la mambaquarétine-1
III. Découverte d’un groupe de toxines Kunitz antagonistes du récepteur de type 2 à la vasopressine
IV. Relations structure-activité de la mambaquarétine-1 sur le récepteur de type 2 à la vasopressine
V. Publications à venir
MATERIEL ET METHODES
I. Production des toxines et variants
Synthèse des peptides
Purification et repliement des peptides
1) Conditions HPLC et contrôles
2) Oxydation des cystéines
3) Dichroïsme circulaire
II. Tests pharmacologiques
1) Conditions de cultures cellulaires
2) Production de membranes
1) Notions théoriques sur la liaison ligand-récepteur
2) Mode opératoire général des tests de liaison
3) Optimisation du test de liaison
4) Tests de compétition
1) Théorie du transfert d’énergie
2) Principe du test de fonction AMPc Cisbio
3) Courbe dose-réponse de la vasopressine
4) Inhibition de la production d’AMPc
III. In vivo
Préparation et administration des toxines
1) Chez les rats
2) Chez les souris
1) Bien-être des animaux au cours des expériences
2) Évaluation de l’effet des toxines chez les rats
3) Prélèvements sanguins chez les souris
IV. Analyse statistique
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXE

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