Les principaux types de marqueurs moléculaires et leur application

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Diversité génétique du niébé

La diversité génétique est la différence qui existe entre les individus d’une même espèce ou d’une population. Sa connaissance permet de mieux comprendre les processus évolutifs de l’espèce et renseigne sur son histoire démographique et génétique. Cette diversité génétique est évaluée de façon fiable par les outils de la biologie moléculaire. Ainsi, avec l’avènement des marqueurs moléculaires, la compréhension de la structuration génétique du niébé et de l’organisation de sa diversité ont été améliorées. Les variétés traditionnelles constituent avec les formes sauvages le réservoir de la variabilité génétique (Kouakou et al., 2007). Dans ce sens, Tosti et Negri (2005) ont analysé la variation génétique entre trois variétés locales de niébé cultivées en Italie et montré une faible diversité génétique au sein des variétés locales. Des résultats similaires ont été obtenus en Malawi en étudiant les variétés locales de niébé avec la technique RAPD (Nkongolo, 2003). Récemment, Fang et al. (2007) , en utilisant des marqueurs AFLP sur six programmes de sélection de niébé de l’Afrique de l’Ouest et des États-Unis, et 27 variétés locales en provenance d’Afrique, d’Asie et d’Amérique du Sud, ont déclaré que ces variétés sont génétiquement identiques à plus de 86 %.
Au Sénégal, peu d’études portant sur l’analyse de la diversité génétique ont été réalisées. Diouf et Hilu (2005) et Badiane et al (2012), dans leurs études portant respectivement sur 11 variétés et 22 variétés y compris des accessions locales de niébé, ont mise en évidence une faible diversité génétique au sein de ces variétés cultivées dans le pays et que la plus part de ces variétés étaient représentées dans un même groupe.

Importance du niébé

Le niébé est une denrée de base, importante qui présente des avantages économiques, nutritionnelles, et agronomiques considérables (Agbicodo et al., 2009). Plusieurs parties de la plante à savoir les graines fraîches ou séchées, les feuilles, les gousses et les racines immatures sont utilisées pour l’alimentation humaine et animale. Ses graines représentent une source précieuse de protéines végétales (23 à 32%) riche en lysine et en tryptophane (Pungulani et al., 2013). Elles contiennent également une importante quantité de minéraux et de vitamines (acide folique et vitamine B) nécessaires pour la prévention des malformations congénitales (Hall et al., 2003 ; Diouf, 2011). Le Niébé est une plante fixatrice de l’azote atmosphérique grâce à son association symbiotique avec des bactéries du genre Rhizobium, réduisant ainsi la demande d’engrais azoté et les coûts de la production agricole (Dugje et al., 2008 ; Asiwe et al., 2009). Il est donc une culture à utilisation multiple qui joue un rôle important dans le développement de l’agriculture (Tan et al., 2013).

Amélioration de la tolérance du niébé à la sécheresse

Bien que, le niébé soit l’espèce la plus tolérante à la sécheresse parmi les espèces du genre Vigna, les sécheresses périodiques limitent encore sa production. Toutefois, des différences significatives existent dans les réponses au stress hydrique parmi les génotypes de niébé (Hall et al., 2003 ; Muchero et al., 2008 ; Fatokun et al., 2012). Le premier caractère qui a été ciblé par les programmes de sélection pour la tolérance à la sécheresse chez le niébé a été le raccourcissement du cycle permettant ainsi à la plante d’éviter un déficit hydrique en phase terminale (Cissé et al., 1996). Cette stratégie a permis de développer des variétés à cycle court de 55 à 75 jours (Cissé et al., 2005).
Au Sénégal, l’amélioration génétique du niébé a débuté dans les années 1960. Elle a permis l’identification de variétés locales très productives comme la 58-57 qui est une variété rampante possédant de petites graines (Sène, 1966). Le poids des graines de cette variété a été améliorée de 12 à 16 g pour 100 graines permettant ainsi d’obtenir la variété Ndiambour (Cissé et al., 1996). La recherche pour la sélection de variétés à cycle court s’est poursuivie et a abouti à la création des variétés Mougne puis Bambey 21. Cette dernière est la première variété extra-précoce (60 jours) et à port érigé développée au Sénégal (Cissé et al., 2005). Elle serait capable de produire des rendements de 1091 kg/ ha sous des conditions de faible pluviométrie (181 mm), de température et de demande évaporatoire élevées (6 mm/ jour) (Gueye, 2006).
D’autres variétés très précoces ont par la suite été développées mais elles se sont révélées sensibles à certains parasites et maladies du niébé (Hall et al., 2003). C’est ainsi que la sélection s’est orientée vers la recherche de variétés rustiques et moins précoces avec la création de Mouride. C’est une variété très productive, bien adaptée à la zone sahélienne, tolérante à la sécheresse intervenant à mi-cycle. Cette variété a constitué grâce à ses propriétés un bon géniteur de départ pour la création de nouvelles variétés de niébé au Sénégal.
Avec le développement des techniques de marquage moléculaire, les stratégies de sélection assistée par marqueurs ont été appliquées au niébé avec des résultats importants en termes d’identification de gènes et/ou de QTL impliqués dans la résistance/tolérance à plusieurs contraintes biotiques et abiotiques (Tableau 2).
Des études récentes ont porté sur la compréhension des bases moléculaires de la tolérance à la sécheresse. Barrera-figueroe et al., (2011) ont identifié 44 micro RNAs (miRNA) associés à la tolérance à la sécheresse grâce à un séquençage de petits ARN provenant de deux génotypes de niébé cultivés en condition d’irrigation et de stress hydrique. Ce résultat montre que les miRNAs peuvent jouer un rôle important dans le déterminisme de la résistance à la sécheresse chez le niébé.

Caractérisation moléculaire.

Généralité sur les marqueurs moléculaires

Les marqueurs moléculaires permettent de caractériser un génome de manière fiable, spécifique et rapide. Un bon marqueur doit être héritable, polymorphe, multi-allélique, co-dominant, non épistatique et neutre (Collard et al., 2005). Outre leur intérêt dans le domaine de la sélection, les marqueurs moléculaires constituent des outils puissants pour le clonage de gènes (Joshi et al., 2011). Les marqueurs moléculaires comprennent ceux qui révèlent le polymorphisme au niveau des protéines (marqueurs biochimiques) et ceux qui le révèlent au niveau de l’ADN (marqueurs de l’ADN).

Les marqueurs biochimiques

Les marqueurs biochimiques représentent les produits de l’expression des gènes. Ils peuvent être séparés par électrophorèse afin d’en identifier les allèles et donc, de façon indirecte, le polymorphisme des séquences des ADN à partir desquelles ces protéines sont traduites (Najimi et al., 2003). Les plus utilisés sont les isozymes. Ces derniers représentent les différentes formes d’une enzyme. Le polymorphisme enzymatique est dû à des modifications de la structure primaire de la protéine. Cependant, ces marqueurs peuvent être limités en nombre et sont souvent influencés par les facteurs environnementaux mais aussi le stade de développement de la plante (Winter et Kahl, 1995).

Les marqueurs de l’ADN

Ils offrent les possibilités d’étudier le polymorphisme directement au niveau du génome. Ils sont indépendants des facteurs environnementaux et le nombre de marqueurs observables est théoriquement illimité (Najimi et al., 2003; Joshi et al., 2011).
Ainsi plusieurs types de marqueurs de l’ADN ont été développés pendant les trois dernières décennies : les RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), les RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), les AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), les SSR (Simple Sequence Repeat), le SNP (Single Nucleotide Polymorphism) etc. Les marqueurs de type SNP et SSR sont de nos jours les plus utilisés pour les études de cartographie génétique en raison de leur abondance, de leur polymorphisme et de leur facilité de mise en œuvre (Joshi et al , 2011 ; Mammadov et al., 2012).

Les principaux types de marqueurs moléculaires et leur application

Les marqueurs qui ont été les plus largement utilisés chez les plantes sont les RFLP (Restriction Fragment Length Polyporphism), les microsatellites ou SSR (Simple Sequence Repeat); les AFLP, (Amplified Fragment Length Polymorphism), les RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) et les SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Dans cette étude, seuls les marqueurs SSR et SNP seront développés.
Les marqueurs microsatellites occupent une place de choix pour la caractérisation moléculaire des plantes. Ce sont des fragments d’ADN constitués d’unité de répétition (1 à 10 nucléotides) en tandem. Ces éléments existent en plusieurs exemplaires uniformément répartis sur l’ensemble du génome d’une espèce et présentent un pouvoir de discrimination élevé, ce qui fait d’eux de très bons marqueurs pour la cartographie et la détection de QTL (Quantitative Trait Loci) (Tan et al., 2012). Le polymorphisme des SSRs repose sur la variation du nombre d’unités de répétition constituant le microsatellite. L’intérêt des marqueurs microsatellites réside sur le fait qu’on peut préciser l’origine maternelle ou paternelle de chaque forme reçue par un sujet donné (Gupta et al., 2013). Ils sont principalement utilisés pour la cartographie et la détection de QTL et constituent une meilleure option pour le suivi des QTLs dans les programmes de sélection (Foncéka et al., 2012). Cependant, au cours de la dernière décennie, avec la découverte des SNP, les SSR sont de moins en moins utilisés (Mammadov et al., 2012).
D’abord, découvert dans le génome humain, les SNP se sont avérés être universels et constituent les formes de variation génétique les plus abondantes parmi les individus d’une même espèce (Kumar et al., 2012). C’est un type de polymorphisme de l’ADN dans lequel deux chromosomes diffèrent sur un segment donné par une seule paire de bases. Les SNP représentent la dernière technologie de marquage moléculaire mise au point. Les SNP sont en nombre plus important (Bertioli et al., 2014) et permettent une meilleure résolution des cartes de liaisons génétiques.

Etablissement des cartes de liaisons génétiques.

La cartographie génétique consiste à baliser le génome avec des marqueurs moléculaires pour savoir leur localisation et leur position. Elle permet de cartographier des gènes d’intérêt et suivre le devenir de ces gènes au cours de processus de sélection.

Principe d’établissement de carte génétique

Le principe de la cartographie génétique est basé sur les liaisons entre les marqueurs, les crossing-overs et donc les gamètes recombinants en sont les révélateurs.
L’établissement d’une carte génétique nécessite la création d’une population en ségrégation issue d’un croisement par reproduction sexuée entre deux parents fixes, ainsi que la caractérisation moléculaire des individus de la descendance. Les populations couramment utilisées sont les descendances F2, les populations issues de rétrocroisement (BC1), les haploïdes doublés (HD) et les populations de lignées recombinantes (RIL). L’utilisation d’outils d’analyse statistique et de méthodes de calculs mathématiques permet alors de trouver des groupes de liaison, d’ordonner les marqueurs liés à l’intérieur des groupes puis d’estimer les distances génétiques entre les marqueurs moléculaires d’un même groupe de liaison. Il existe deux formules pour calculer les distances génétiques à partir des taux de recombinaisons, celle d’Haldane (Haldane, 1919) et celle de Kosambi (Kosambi, 1944); ce dernier prend en compte les phénomènes de crossing-over multiples. Généralement, la construction de la carte génétique prend fin, lorsque l’ordre des marqueurs est déterminé dans chaque groupe de liaison. La carte est saturée, lorsque le nombre de groupes de liaison formés est égal au nombre de paires de chromosomes et que, tout point du génome est génétiquement lié au moins à un marqueur.

Populations de cartographie génétique

Parmi les différents types de populations disponibles, les F2 et les backcross (BC1) bien qu’adaptées pour la construction de carte génétique présentent un faible intérêt pour l’identification de QTLs (Collard et al. 2005) car elles ne sont pas fixées. A l’opposé, la nature homozygote des populations RILs permet la localisation et la détermination précise des caractères transmis des parents en raison de leur patrimoine génétique relativement très stable, ce qui améliore de la détection de QTL (Varshney et al., 2009). Un nouveau type de population appelée MAGIC (multi-parent advanced generation inter-cross) a été mise au point et appliquée chez les plantes (Mackay et Powell, 2007). Ce schéma de production de population permet d’exploiter une large variation génétique existante parmi plusieurs parents géniteurs (Cavanagh et al., 2008). Tout comme les populations RILs, les lignées MAGIC représentent une précieuse ressource de cartographie génétique utilisable pour les analyses de ségrégation et d’association entre loci et QTLs (Xu et al., 2012). Le développement d’une population issue de huit (8) géniteurs (MAGIC avec 8 parents) est en cours chez le niébé (Ribaut et al., 2012; https://sites.google.com/site/ijmackay/work/magic).

Utilisation des cartes de liaisons génétiques et identification de QTLs

La carte génétique est utilisée d’une part, pour la détection et la localisation des facteurs génétiques contrôlant les caractères d’intérêt agronomique. Il est alors possible de positionner les gènes d’intérêt par simple analyse de la co-ségrégation entre les allèles aux marqueurs et des performances des plantes. Et d’autre part comme outil permettant d’approfondir les connaissances sur le génome des plantes. Par conséquent, la construction d’une carte génétique de densité élevée est d’une grande importance (Muchero et al., 2009b).
La localisation d’un locus à effet quantitatif repose sur la recherche d’un déséquilibre de liaison entre ce locus et un marqueur de la carte génétique. L’existence de liaison entre un marqueur et un caractère agronomique important permet de conclure que ce marqueur est associé à un ou plusieurs QTL intervenant dans la variation du caractère et d’estimer l’effet des allèles apportés par chacune des lignées parentales sur le caractère d’intérêt. Il existe des méthodes pour effectuer cette recherche. Il s’agit soit d’une analyse marqueur par marqueur, soit d’une analyse prenant en compte deux voire plusieurs marqueurs simultanément, ou des méthodes appelées cartographie d’intervalle permettant d’estimer la position la plus probable des QTL dans les intervalles entre les marqueurs.
Cependant, les QTLs une fois introgressés peuvent ne pas reproduire le phénotype attendu en raison des nouvelles interactions génétiques qui sont mis en place avec le nouveau fond génétique (Grandillo et Tanksley, 2005). C’est pourquoi de nouveaux schémas de sélection sont mis au point pour pallier ce phénomène. C’est le cas des MABC (Marker-assisted back crossing) qui est la méthode la plus simple pour introgresser des QTLs à effets forts et durables sur le phénotype (Varshney et al., 2012; Xu et al., 2012). Pour le transfert de plusieurs QTLs à faible effets, la sélection récurrente assistée par marqueurs (MARS) est la mieux adaptée (Ribaut et al., 2010). Ainsi, chez le niébé des programmes MARS sont récemment développés, impliquant plusieurs populations, chacune dérivée de deux parents de lignées élites (Huynh et al. 2014).

Cartes génétiques et détection de QTL chez le niébé

Plusieurs types de marqueurs moléculaires ont été utilisés, soit seul soit en combinaison, pour la réalisation de cartes génétiques et de cartes consensus sur le niébé (Gupta and Gopalakrishna, 2013).
Ainsi la première carte de liaison génétique sur le niébé a été construite principalement à partir des marqueurs RFLP sur une population de lignées F2 issue d’un croisement entre un cultivar amélioré et une accession sauvage (V. unguiculata subsp. Unguiculata var dekindtiana) (Menancio-Hautea et al., 1993). La carte était composée de 92 marqueurs cartographiés sur dix groupes de liaison (GL) couvrant ainsi une distance génétique totale de 684 cM. Menendez et al., (1997) ont établi une carte de liaison génétique en utilisant une population RIL et une combinaison de 133 marqueurs RAPD, 19 marqueurs RFLP, 25 AFLP, trois marqueurs morphologiques et un marqueur biochimique. L’ensemble de ces marqueurs ont été cartographiés dans 12 GL couvrant une distance génétique de 972 cM avec une distance moyenne entre les marqueurs de 6,4 cM. Sur la base de ces deux cartes précédentes, Ouedraogo et al., (2002) ont construit une carte génétique améliorée. Cette nouvelle carte génétique du niébé était composée de 11 GL couvrant une distance totale de 2670 cM, avec une distance moyenne entre marqueurs de 6,43 cM. Des versions plus récentes de cartes génétiques chez le niébé ont été publiée par Muchero et al., (2009a) avec uniquement les marqueurs AFLP (303 marqueurs) et couvrant une distance de 643 cM. Andargie et al., (2011) ont construit une carte de liaison génétique utilisant des marqueurs SSR sur une population recombinante (RIL) de 159 individus. Ainsi 202 marqueurs SSR polymorphes ont été utilisés pour la construction de cette carte constituée de 11 groupes de liaison et recouvrant une distance génétique totale de 677 cM avec une distance moyenne entre marqueur de 3 cM. Chez le haricot-asperge, une sous-espèce distincte du niébé, Xu et al, (2011a) ont développé une carte de liaison génétique en utilisant 375 locus marqueurs (SNP et SSR) répartis dans 11 groupes de liaison. La carte recouvre une distance totale de 745 cM avec une distance moyenne entre marqueur de 1,98 cM.
Dans le but d’augmenter la résolution des cartes génétiques pour une large gamme d’applications génétiques, l’établissement d’une carte génétique consensus est nécessaire. C’est ainsi que Muchero et al., (2009b) ont développé 1536 marqueurs SNP dérivés d’EST et ont construit une carte génétique consensus à l’aide de 741 lignées recombinantes issues de six populations de cartographie. Parmi ces SNP, 928 ont été positionnés sur la carte génétique consensus couvrant ainsi 680 cM, avec 11 GL et une distance moyenne de 0,73 cM entre marqueurs adjacents. Tout récemment, cette carte a été améliorée par Lucas et al., en 2011 en utilisant 1293 individus représentant 13 populations de cartographie. Au total, 1107 marqueurs SNP dérivés des EST ont été cartographiés sur 11 GL avec une distance de 680 cM et une densité moyenne d’un marqueur tous les 0,61 cM. Le tableau 1 montre les détails des principales cartes génétiques construites chez le niébé.

Collecte du matériel végétal

De jeunes feuilles ont été prélevées 21 jours après semis, emballées dans du papier aluminium et déposées dans un back contenant de la glace. L’ensemble a été transporté au laboratoire pour l’extraction de l’ADN sur feuilles fraiches.

Extraction d’ADN génomique

L’extraction d’ADN génomique a été réalisée à partir de jeunes feuilles fraiches suivant la méthode d’extraction au MATAB (Mixed Alkyl Trimethyl Ammonium Bromide) Risterucci et al. (2000) modifiée.
Pour chaque échantillon environ 120 mg de feuilles fraîches ont été introduites dans un mortier placé sur de la glace. Avec une pipette, un volume de 800 µl de tampon MATAB préalablement préchauffé à 65°C au bain-marie a été ajouté. A l’aide d’un pilon, les feuilles ont été broyées jusqu’à l’obtention d’un liquide pâteux. Le mélange obtenu a été introduit dans des tubes Eppendorf de 2 ml, homogénéisé au vortex puis incubés au bain-marie à 65°C pendant 20 min avec agitation toutes les 5 min. Cette étape permet la lyse de la membrane nucléaire et la libération de l’ADN dans le tampon. Les échantillons ont été ensuite refroidis à température ambiante pendant 5 min. Un volume de 800 µl de Chloroforme Isoamyl Alcool (CIAA, 24:1) a été rajouté au mélange, homogénéisé par retournement 50 fois et centrifugé pendant 20 min à 13 000 rpm. Le surnageant (600 µl) a été transféré dans un nouveau tube 1,5 ml et un volume égal d’Isopropanol y a été ajouté. Le mélange a été agité doucement jusqu’à l’apparition de la pelote d’ADN et le tube a été placé à -20°C pendant 2 h. Une fois sortis du congélateur, les tubes ont été centrifugés à 13 000 rpm à 4°C pendant 20 min. Le surnageant a été éliminé et la paroi du tube séchée avec du papier absorbant. L’ADN a été lavé avec 500 µl d’éthanol (70%) puis centrifugé à 13 000 rpm à 4°C pendant 20 min. Ensuite, le surnageant a été éliminé et le culot a été séché pendant environ 1 h à l’étuve (40°C). L’ADN a été repris en ajoutant 300 µl de TE 1X (tampon Tris Acétate EDTA) pendant une nuit à température ambiante.

5. Quantification de l’ADN

L’ADN extrait a été quantifié sur gel d’agarose à 1% (0,8 g d’agarose dans 80 ml de TBE 0,5X) contenant 2,5 µl de Bromure d’Ethidium (BET 0,5 mg/µl) par une estimation visuelle de la concentration en comparaison aux bandes d’un marqueur de taille (Smart Ladder) de concentrations connues. L’électrophorèse a été réalisée dans une cuve contenant du tampon Tris Borate EDTA (TBE) 0,5X. Les échantillons à déposer sur le gel ont été préparés par mélange de 2 µL d’ADN, 2 µl de Bleu de Bromophénol (bleu de charge 6X) et 6 µl d’eau pure. Cinq (5) µl de chaque échantillon ont été déposés dans chaque puits du gel de même que le Ladder. La migration a été réalisée à 130 volts à température ambiante durant 30 min à l’aide d’un générateur EPS 300 (Pharmacia Biotech). L’ADN a été visualisé sous lumière U.V. et photographié à l’aide d’un appareil photographique.
Le marqueur de taille standard Smart Ladder utilisé disposait de 14 bandes d’intensités différentes correspondant à une quantité connue en ng d’ADN. La concentration en ADN des différents échantillons a été déterminée en comparant l’intensité des bandes obtenues à celle du marqueur de taille.

Amplification en chaine par polymérase (PCR)

La PCR a été réalisée pour chaque individu dans un volume réactionnel de 10 µl soit 5 µl d’ADN (5 ng/µl) et 5 µl d’une solution PCR contenant du tampon 1 X, de 200 µM de dNTPs, de 0,5 mM de MgCl2, de 0,1 µM de chaque amorce, de 0,1 µM de l’IRdye, d’une unité (1 U) de Taq polymérase et de l’eau ultra-pure. La PCR a été réalisée dans un thermocycleur (MWG AG Biotech) selon les conditions générales suivantes : une étape de dénaturation initiale de 4 min à 94°C, 35 cycles comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 60 s, une étape d’hybridation des amorces à une température spécifique 50-55°C pendant 1 min, une étape d’élongation à 72°C pendant 1 min 15 s et une extension finale à 72°C pendant 7 min. Après la réaction de PCR, la plaque est mise à l’abri de la lumière à l’aide d’une feuille aluminium pour éviter la dégradation du fluorochrome puis placée dans un réfrigérateur à -20°C.

Table des matières

1. Généralité sur le niébé
1.1. Position systématique
1.2. Origine et diffusion
1.3. Diversité génétique du niébé
1.4. Importance du niébé
2. Caractérisation moléculaire.
2.1. Généralité sur les marqueurs moléculaires
2.1.1. Les marqueurs biochimiques
2.1.2. Les marqueurs de l’ADN
2.2. Les principaux types de marqueurs moléculaires et leur application
2.3. Etablissement des cartes de liaisons génétiques.
2.3.1. Principe d’établissement de carte génétique
2.3.2. Populations de cartographie génétique
2.3.3. Utilisation des cartes de liaisons génétiques et identification de QTLs
2.3.4. Cartes génétiques et détection de QTL chez le niébé
MATERIEL ET METHODES
1. Matériel végétal
2. Culture des plantes
3. Collecte du matériel végétal
4. Extraction d’ADN génomique
5. Quantification de l’ADN
6. Amplification en chaine par polymérase (PCR)
7. Multiplexage
8. Séparation et visualisation sur Séquenceur LICOR 4300 DNA Analyzer
9. Confection de la matrice
10. Construction des cartes génétiques
RESULTATS
1. Polymorphisme des marqueurs microsatellites entre les parents des RILS
2. Génotypage des RILs avec marqueurs SSRs polymorphes
3. Etablissement de la carte génétique SSRs
4. Ségrégation des marqueurs SNPs et construction de la carte génétique SNPs
5. Construction de la carte génétique associant les marqueurs SNP et SSR
DISCUSSION
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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