Les polyamines

Les polyamines peuvent avoir un effet protecteur contre les stress abiotiques tels que la hausse de température (Sagor et al., 2012). Leur fonction biologique était initialement associée à la capacité de lier différentes macromolécules anioniques (ADN, ARN, chromatine et protéines), les considérant ainsi comme des substances ayant un rôle structural (Alcázar et al., 2010). Cependant, il a été décrit ultérieurement qu’en plus de stabiliser les structures macromoléculaires, les polyamines agissent comme des molécules régulatrices dans de nombreux processus cellulaires fondamentaux. Ceux-ci comprennent la division cellulaire, la différenciation et la prolifération, la mort cellulaire, la synthèse de l’ADN et des protéines et l’expression génique (Alcázar et al., 2010). De plus, l’accumulation de polyamines apporterait une tolérance accrue aux multiples stress abiotiques, y compris la tolérance à la chaleur (pour revue Asthir et Deep, 2011). En effet, les polyamines joueraient également un rôle important dans la protection des plantes contre le stress abiotique en raison de leur rôle dans l’ajustement osmotique, le maintien de la stabilité de la membrane et le piégeage des radicaux libres (Cvikrová et al., 2012).

Pour cela, les polyamines pourraient interagir avec les membranes et les acides nucléiques, mais également avec les protéines kinases et les facteurs de transcription et seraient donc impliqués dans les voies de transduction du signal (Cvikrová et al., 2012). Selon Yiu et al. (2009), les polyamines ont également des propriétés antiradicalaires et une activité antioxydante qui confère une protection contre les stress abiotiques. La biosynthèse des trois polyamines les plus courantes (putrescine (Put), spermidine (Spd) et spermine (Sp)) est initiée soit par décarboxylation directe de l’ornithine par l’ornithine décarboxylase (ODC), soit par décarboxylation de l’arginine par l’arginine décarboxylase (ADC) (figure 1). Une autre enzyme essentielle pour la synthèse de polyamines est la S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC), qui est nécessaire pour la production du groupe aminopropyle utilisé dans la biosynthèse de Spd et Sp (Cvikrová et al., 2012). Par conséquent, les polyamines et l’éthylène pourraient agir de manière antagoniste en rivalisant avec le substrat commun SAM. Alors que l’éthylène contribuerait à la sénescence et à la maturation des fruits, les polyamines favoriseraient la croissance et inhiberaient la sénescence (Bitrián et al., 2012).

Les protéines de choc thermique (HSPs) Pour se protéger contre les hausses de températures, les plantes synthétisent des HSPs (Heat Shock Proteins). Les HSPs sont divisés en cinq grandes classes, à savoir, HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, et de petites protéines de choc thermique (sHSPs) (Lin et al., 2018 ; Richter et al., 2010). Les HSPs sont impliquées dans le maintien et la restauration de l’homéostasie des protéines lors du stress thermique. En effet, elles améliorent les problèmes causés par le mauvais repliement et l’agrégation des protéines en empêchant la formation d’agrégats protéiques non spécifiques et en aidant les protéines à acquérir leurs structures natives (Queitsch et al., 2000 ; Richter et al., 2010). HSP 101, HSP 70, HSP 17.6 et HSP 17.7 peuvent également protéger les cellules végétales contre la mort cellulaire programmée induite par la chaleur selon Lin et al. (2018). Les protéines de la famille des HSPs 100 sont une localisées dans le cytosol (comme l’HSP 101) et comprennent à la fois des éléments inductibles à la chaleur et constitutifs. Elles favorisent la réactivation des protéines dénaturées par la chaleur (Queitsch et al., 2000). Elles sont dépendantes de l’ATP et peuvent tirer les protéines mal repliées à travers leur pore central, permettant aux protéines de se replier (Richter et al., 2010).

De plus les protéines HSPs 100 coopérent généralement avec les HSPs 70 pendant le traitement des protéines agrégées (Liberek et al., 2008). Les petites HSPs (sHSPs) (12 à 40 KDa) se distinguent par une localisation intracellulaire diverse (cytosolique – par exemple 17.6 -, mitochondriale, chloroplastique, peroxysomique et nucléaire) et sont indépendantes de l’ATP. Elles sont proposées comme première ligne de défense, interagissant avec les protéines dénaturées pour empêcher leur agrégation lors du stress et les présentant aux chaperons HSP 100 et HSP 70 dépendants de l’ATP qui peuvent désagréger et replier les protéines non-natives (McLoughlin et al., 2016). 4. Extraction et dosage des protéines Les échantillons avec 2 billes de verre dans des tubes de 1,5 mL sont tout d’abord trempés dans de l’azote liquide puis mis dans des portoirs sortis de congélateur à -80 °C. Le broyage est effectué 1 min à 30 Hertz par TissueLyser de Qiagen.

Les tubes sont sortis des portoirs et de nouveau mis dans l’azote liquide. Il est rajouté 500 μL de tampon SEE [50 mM Na2HPO4 ; 50 mM NaH2PO4 (pH8) ; 10 mM d’EDTA (chélatant les ions métalliques et inhibant les protéases utilisant ces ions) ; 0,1 % de Triton-X 100 et 0,1 % de Sarcosyl (Nlaurysarcosine) (détergents solubilisant les membranes et permettant d’en extraire les protéines) contenant du DTT 10 mM (réduit les ponts disulfures des protéines) et un cocktail antiprotéase (anti protéase (AP) 25 X (inhibant l’action des protéases) et PMSF 100 X (inhibiteur de protéases à sérine)] dans chaque tube. Les tubes sont ensuite réchauffés puis vortexés. Pour améliorer la lyse des cellules un « freeze-thaw » est réalisé : tubes mis dans l’azote (congélation) pendant 1 min environ puis décongélation en les réchauffant. Les tubes sont vortexés une dernière fois avant d’être mis sur glace. Le dosage des protéines est réalisé selon la méthode de Bradford (Bradford, 1976) à l’aide d’une courbe étalon d’albumine sérique de boeuf (BSA) allant de 0 à 5 μg de BSA à 0,1 mg/mL (tableau IV). Pour chaque échantillon d’une culture (C, P, H et PH pour les traitements thermiques et C, P 100, P 500, H, PH 100, PH 500 pour les traitements chimiques), il est prélevé trois volumes différents (1, 2 et 4 μL) de surnageant mis dans 200 μL de réactif de Bradford 4X et complétés avec de l’eau distillée pour atteindre 250 μL de volume total, transférés dans une plaque 96 puits. Deux gammes étalons sont réalisées par plaque. La lecture de l’absorbance est effectuée à 595 nm sur le spectrophotomètre SPECTRO starnano de BMG LABTECH et les données sont traitées par le logiciel Mars. En effet, le changement de la couleur du bleu de Coomassie se réalise par liaison avec les acides aminés basiques (arginine, histidine, lysine) et les résidus hydrophobes des acides aminés présents dans les protéines. Par conséquent, la concentration en protéine peut être mesurée à cette longueur d’onde.

Oxygraphie

Pour les différentes conditions testées (Coxy, Poxy, Hoxy et PHoxy ou C, P 100, P 500, H, PH 100 et PH 500 (figure 2)) de chaque culture, la concentration de dioxygène a été mesurée à l’aide d’une électrode à oxygène (figure 6) Oxy-Lab de Hansatech. L’électrode à oxygène contient une membrane de téflon qui est perméable aux gaz et imperméable à l’eau. Par conséquent, on conserve le même volume (1 mL d’eau naturel d’Evian) mis dans la chambre. L’électrode est polarisée et le courant électrique est proportionnel à la concentration en dioxygène. Cela permet donc de déterminer, à la suite de la calibration et de la mesure du courant électrique, la concentration en dioxygène à l’aide du logiciel O2 View. Pour chaque condition testée, il est prélevé une petite motte de plantules (environ 1/3 des plantules présentes dans un puits) puis elle est mise dans la chambre de l’électrode à oxygène. La concentration en dioxygène est d’environ 250 nmol au départ et la température est contrôlée à 25 °C grâce à un bain-marie.

La concentration en dioxygène est d’abord mesurée à l’obscurité. Dans cette condition il y a consommation de dioxygène. Les plantules sont ensuite éclairées, dans cette condition d’éclairement les plantules produisent de l’oxygène grâce à la photosynthèse. Les plantules sont ensuite de nouveau remises en condition d’obscurité et la mesure continue jusqu’à atteindre une consommation de dioxygène stable comme présenté dans la figure 7. A la fin de la mesure l’échantillon est placé dans des tubes de 1,5 mL et mis au congélateur à – 25 °C en attendant de réaliser toutes les mesures de respirations et photosynthèses des différents échantillons. Les échantillons sont ensuite sortis du congélateur et il est rajouté dans chaque tube 1 mL de DMF (diméthylformamide). Les échantillons sont ensuite placés à – 4 °C en attendant de pouvoir réaliser le dosage de la chlorophylle. Grâce au logiciel Excel et des données recueillies après mesure de la chlorophylle et de la respiration et de la photosynthèse, il est calculé pour chaque échantillon la photosynthèse nette et brute ainsi que la respiration en nmol.s-1.mg chll-1. La photosynthèse brute est la somme de la respiration plus celle de la photosynthèse nette. Une moyenne avec écart-type pour les réplicats est effectuée.

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Table des matières

TABLE DES FIGURES
TABLE DES TABLEAUX
LISTE DES ANNEXES
INTRODUCTION
1. L’institut
2. Intérêt et enjeu
3. Perception de la chaleur et signalisation
4. Prétraitement thermique
5. Les polyamines
6. Les protéines de choc thermique (HSPs)
7. Impact de la chaleur sur la photosynthèse et la respiration
8. Objectif du stage
MATERIELS ET METHODES
1. Matériels végétals
2. Priming thermique et choc thermique
3. Priming chimique par les polyamines (Spermidine (Spd), Spermine (Sp) et Putrescine (Pu))
4. Extraction et dosage des protéines
5. Electrophorèse et Western Blot
6. Dosage de la chlorophylle
7. Oxygraphie
8. Calculs et Statistiques
RESULTATS
1. Acclimatation au stress thermique
2. Effet des polyamines sur les plantules sans stress thermique
3. Est-il possible de mimer un priming thermique par un priming chimique avec des polyamines ?
4. Est-il possible de mimer un priming thermique par un priming chimique si le temps entre le priming et le stress est plus court ?
5. Effet des polyamines sur la photosynthèse
6. Influence du temps de culture sur la photosynthèse et la respiration
7. Effet mémoire d’un double priming
8. Le double priming influence-t-il la mémoire du priming ?
9. Influence de la température du stress sur la respiration et la photosynthèse
10. Force de protection d’un double priming suivi d’un choc thermique à 45°C
DISCUSSION
1. Prétraitement et choc thermique
2. Les polyamines
CONCLUSION ET PERCEPTIVES
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES I : PLANNING EXPERIMENTAL
ANNEXES II : EFFET DE 100 μM DE SPERMINE SUR LA PHOTOSYNTHESE