Les plantes et leurs métabolites secondaires

Les plantes et leurs métabolites secondaires

Analyse des plantes

1. Mesure de la croissance
– longueur de la partie aérienne : la taille de la plante est mesurée de la base de la tige jusqu’au sommet de la dernière feuille (Long.a) exprimé en centimètre.
2. Estimation de l’infection mycorhizienne des racines
La mise en évidence de l’infection mycorhizienne des racines, se fait en microscopie optique à travers une technique de coloration non vitale au bleu de Trypan (BT), décrite par Philips et Hayman (1970), révélant l’ensemble de la biomasse fongique:
1. Eclaircissage: Les échantillons de racines, prélevés au hasard, sont soigneusement rincés pour éliminer le substrat adhérent. Ensuite, les fragments radiculaires sont digérés dans une solution d’hydroxyde de potassium (KOH) à 10% pendant 45 min à 90 °C à l’étuve, afin de vider les cellules de leur contenu cytoplasmique ce qui facilite leur coloration.
2. Coloration: Les racines sont bien rincées à l’eau distillée et placées dans une solution de lactophénol au bleu de Trypan (0.5%) à 90°C dans l’étuve, pendant 15 minutes.
– Technique d’estimation des paramètres de mycorhization Nous avons utilisé la technique décrite par Trouvelot et al. (1986). Cette méthode permet de juger de l’état de la mycorhization et reflète les potentialités du système symbiotique. Les racines colorées sont découpées en fragments d’environ un centimètre de longueur. Trente fragments pris au hasard sont montés et écrasés entre lame et lamelle dans du lactoglycérol, à raison de 15 fragments par lame. L’estimation de l’infection endomycorhizienne est faite par observation au microscope photonique. Plusieurs paramètres sont ainsi évalués :
– (F%) : La fréquence de mycorhization reflète l’importance et le pourcentage de fragments de racines infectées. – (M%) : L’intensité de colonisation du cortex exprime la portion du cortex colonisé par rapport à l’ensemble du système radiculaire. – (A%) : La fréquence des arbuscules dans le système radiculaire.

Dosage des phénols

Principe de dosage Ce dosage repose sur la méthode utilisant le réactif de Folin-ciocalteau ‚ce réactif est constitué d’un mélange d’acide phosphotungstique et d’acide phosphomolybdique.
L’oxydation des phénols réduit ce réactif en un mélange d’oxydes bleus de tungstène et de molybdène. L’intensité de la couleur est proportionnelle au taux de composés phénoliques oxydés.
Extraction des composés phénoliques totaux
 Des fragments de partie aérienne et radiculaire (0‚5g) sont broyés au mortier contenant un volume de 5ml‚ d’éthanol 50 % (solution hydro alcoolique).  Les extraits sont récupérés dans des tubes munis des couvercles et bien numérotées ‚ensuite les tubes sont laissés dans le réfrigérateur pendant une nuit pour laisser le temps à l’éthanol pour extraire le maximum de phénol présent dans l’extrait.  Dans les tubes qui contiennent les extraits de feuilles il y avait un risque d’avoir l’existence de chlorophylles que nous avons essayé d’éliminer en ajoutant dans 3ml d’extrait 0‚5ml de chloroformes‚ les tubes sont vortexés et centrifugés pendant 5min à 5000 rpm
% a = (100 mA3 + 50 mA2 + 10 mA1) / 100
%A = a x (M/100).
 A l’aide d’une micropipette le surnagent est aspiré et mis dans un autre tube pour le dosage des phénols totaux.
 Dosage des composés phénoliques totaux
 dans des tubes à essai nous avons préparé le mélange suivant : 0‚5ml d’extrait‚3ml d’eau‚ 0‚5ml de Na2Co3 20 %‚mélanger‚ attendre 3min puis ajouter 1ml de réactif de Folin-ciocalteu. Mélanger et placer les tubes à 40˚C pendant 30min. lire l’absorbance à 760nm.
 Gamme étalon : La gamme étalon est réalisée en utilisant l’acide gallique. A partir d’une solution d’acide gallique de 1g/l‚ préparer les dilutions suivantes 100mg/l‚ 50mg/l ‚ 25mg/l‚ 12‚5mg/l‚ ‚25mg/l.  Préparer six tubes comme pour les extraits avec 1ml de ces dilutions.  Lire l’absorbance à 760nm.
Dosage des tanins condensés (TC) Il est basé sur la propriété que les tannins se transforment on anthocyanes par chauffage en milieu acide (Ribereau-Gayon, P., Stonestreet, E., 1966). L’autre partie de l’extrait éthanolique est utilisée pour le dosage des tanins condensés. Sur deux séries de tubes, on met 3 ml de l’extrait éthanolique auquel on rajoute 3 ml d’HCl concentré. On nomme les Tubes 1, ceux qui sont placés dans le bain marie à 100°C pendant 30 minutes, suivis d’un refroidissement rapide sous un jet d’eau; et les Tubes 2, ceux qui sont maintenus à température ambiante. Sur les deux séries, on rajoute 0.5ml d’éthanol concentré, la lecture est réalisée au spectrophotomètre à 550nm. Les calculs sont rapportés à une relation : D.O (TC) = (D.O1 – D.O2) × 19,33. Avec DO1 : DO des tubes 1 – DO2 : DO des tubes 2

Dosage des chlorophylles

Des fragments de feuilles (1 g) sont broyés au mortier préalablement placé dans la glace avec une pincée de carbonate de magnésium et 5g de sulfate de sodium anhydre. Ensuite‚10ml d’acétone à 80% sont versés dans le broyat‚ qui est filtré sur Büchner‚ le résidu est récupéré dans des tubes à essai.de nouvelles extractions sont réalisées avec l’acétone jusqu’à l’obtention d’un filtrat incolore (dépourvu de toutes traces des pigments chlorophylliennes) auquel on précise le volume final (Inskeep et Bloom‚1985).
Les mesures de DO sont faites au spectrophotomètre aux longueurs d’ondes de l’ordre de 663nm pour la chlorophylle a et 645nm pour la chlorophylle b.
Arnon et Mc Kinney (1941) ont établi des systèmes d’équations qui permettent de calculer les concentrations (g/l) en chlorophylle à partir d’absorbance à 663 et 645 nm d’un extrait acétonique à 80% sont :
Chlorophylle a = (0,0127 D.O663)-(0,00269 D.O 645)
Chlorophylle b = (0,0229 D.O 645)-(0,00468 D.O 663)
Chlorophylle totale = (0,0202 D.O 645) + (0,00802 D.O 663)

Table des matières

Liste d’abréviations
Résumé
Liste des figures
Liste des tableaux
Chapitre I : Revue bibliographique.
Introduction générale
I- Les plantes et leurs métabolites secondaires
Evolution, diversité et fonction des métabolites secondaires
II- Les huiles essentielles
1) Définition
2) Propriétés chimiques des huiles essentielles
3) Composition des huiles essentielles
3-1) Les terpénoïdes
3-2) Les composés aromatiques
3-3) Les composés d’origines diverses
III- Généralités sur les métaux lourds
1) Caractéristiques de certains éléments métalliques
1-1) Le chrome
1-2) Le zinc
1-3) Le cuivre
2) Les mécanismes impliqués dans l’assimilation des métaux
IV- Les mycorhizes
1) Les ectomycorhizes
2) Les endomycorhizes
2-1) Les mycorhizes à arbuscules
3) Processus d’infection
4) Modifications métaboliques induites par la mycorhization chez la plante hôte
5) Rôles des mycorhizes à arbuscules
V- Le basilic
1) Classification classique
2) Présentation de l’espèce
3) Différentes utilisations du basilic
4) Diététique officielle
5) Composition
6) Diététiques alternatives
Chapitre II : Matériel et méthodes
I- Matériel végétale
1) Plantes
2) Inoculum mycorhiziens
II- Préparation des solutions des éléments métalliques
III-Culture des plantes
1) Prégermination des graines
2) Mise en culture des plantules de basilic
2-1) Traitement des plantes par les solutions des métaux
2-2) Inoculation des plantes
2-3) Conditions de croissance des plantes
2-4) Prélèvement du matériel végétal
IV-Analyse des plantes
1) Mesure de la croissance
2) Estimation de l’infection mycorhizienne des racines
3) Dosage des phénols
3-1) Principe de dosage
3-2) Extraction des composés phénoliques totaux
3-3) Dosage des composés phénoliques totaux
3-4) Dosage des tanins condensés (TC)
4) Dosage des chlorophylles
5) Dosage des huiles essentielles
5-1) Extraction des huiles essentielles
5-2) Analyse des huiles essentielles par CPG /SM
6) Observation des feuilles des plantes au Microscopie électronique à balayage environnemental
Chapitre III : Résultats et discussion
I- Influence des métaux sur la croissance du basilic et sur les teneurs en chlorophylles
1) Influence des métaux sur les teneurs en chlorophylle totale
2) Influence des métaux sur les composés phénoliques des plantes du basilic
2-1) Teneurs en phénols totaux
2-2) Influence des métaux sur la teneures en tanins
3) Compositions chimiques des huiles essentielles du basilic
3-1) Témoin
3-2) Cu 1mM
3-3) Cu 5mM
3-4) Zn 5mM
3-5) CrIII 5mM
II- Influence de l’association mycorhizienne sur la croissance du basilic
1) Influence de la symbiose mycorhizienne sur la croissance des plantes du basilic
2) Colonisation mycorhizienne des racines
3) Teneur en phénols totaux
4) Influence sur la synthèse des huiles essentielles
4-1) Etude histologique des feuille
4-2) Composition chimique des huiles essentielles du basilic dans les plantes mycorhizées et les plantes non mycorhizées
Conclusion et Perspectives
Références bibliographiques

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