Les phases stationnaires greffées apolaires et l’analyse de solutés basiques

La chromatographie en phase liquide sur phase stationnaire apolaire s’est imposée comme une méthode de choix pour l’analyse de composés pharmaceutiques. En raison de la multiplicité des procédures de fabrication des colonnes, provenant des voies d’obtention variées pour la matrice de silice, de la pluralité des greffons, des différentes méthodes de greffage et de traitements ultérieurs éventuels, de nombreuses phases stationnaires apolaires sont disponibles. Si cette diversité permet en théorie de couvrir une large gamme de problèmes séparatifs, elle constitue aussi une difficulté de taille pour l’analyste confronté au choix de la colonne adéquate. Ce choix est rendu d’autant plus difficile que sont réunies dans des catégories génériques des phases aux propriétés chromatographiques très différentes. En outre, cette diversité s’est encore accentuée avec l’apparition des phases dites « special base » ou « base deactivated », dédiées à l’analyse de composés basiques, comme on en rencontre fréquemment dans le domaine pharmaceutique. Ces composés, qui se caractérisent par la présence d’un ou plusieurs groupements amine, sont susceptibles de développer avec les silanols résiduels présents en surface des interactions supplémentaires à l’origine souvent d’asymétrie de pic et de perte de résolution. Derrière l’appellation « special base » se dissimule une multitude de stratégies visant à diminuer ces interactions indésirables. Au niveau de l’industrie pharmaceutique, la problématique du choix de la colonne est devenue critique : comment sélectionner rationnellement une phase stationnaire apte à la séparation de composés basiques d’intérêt, qui possède de surcroît une bonne durée de vie, parmi plus de 600 disponibles commercialement [1] ? Le besoin de caractérisation n’émane pas seulement d’une industrie à la recherche d’un outil pour optimiser son développement de méthodes, mais de tous les utilisateurs, puisque ce problème se pose aussi lors du simple remplacement d’une colonne qui n’est plus commercialisée. La seule approche rationnelle consiste à fournir une méthodologie, fondée sur des mesures chromatographiques, pour la caractérisation des phases stationnaires d’intérêt. Si la procédure de test s’avère fiable et robuste, elle pourra être mise en œuvre pour établir une base de données dédiée à la classification des colonnes, ouverte à l’incorporation de nouvelles phases. Plusieurs approches ont été décrites dans la littérature, mais aucune ne s’est imposée à ce jour, probablement parce que des conditions expérimentales trop restreintes conduisent à des contradictions dans les classifications proposées.

Les phases stationnaires greffées apolaires et l’analyse de solutés basiques 

Pour assurer des standards séparatifs de haute qualité et respecter les recommandations et/ou obligations réglementaires de type ICH, FDA ou des différentes pharmacopées, l’analyse de composés pharmaceutiques doit pouvoir disposer de supports possédant les caractéristiques suivantes :
• Des phases stationnaires présentant une modularité des propriétés de rétention et de sélectivité, pour faire face à tout type d’analyse ;
• Une bonne stabilité à long terme tant d’un point de vue mécanique que chimique, notamment sur une gamme étendue de pH et pour des températures supérieures à l’ambiante si besoin est ;
• Des particules possédant une haute surface spécifique pour une meilleure capacité d’échange et de distribution homogène en ce qui concerne leur taille et leur diamètre de pores ;
• Des pores de taille adaptée à celle des molécules à séparer et de connectivité suffisante pour permettre un transfert de masse efficace ;
• Une matrice homogène en énergie de surface et aisément modifiable chimiquement.

Ces critères présupposent l’emploi d’un matériau dont la chimie est connue, tant au niveau de la maîtrise de sa synthèse qu’au niveau de la modification de sa surface. Répondant à cette condition préalable et présentant une haute surface spécifique alliée à une forte résistance mécanique, la silice s’est imposée comme le matériau de choix. Ainsi, la plupart des phases stationnaires sont constituées de particules de silices greffées. D’autres supports répondant à ces critères sont aussi disponibles, comme ceux à base de polymères, d’autres oxydes de métaux (oxydes de zirconium [2], d’aluminium, de titane [3-22]), ou de carbone graphitisé poreux [23-28]. Cependant, nous nous limiterons aux phases stationnaires à base de silice eu égard à l’importance de leur offre et de la prépondérance de leur utilisation dans l’analyse des composés pharmaceutiques.

La matrice de silice

La silice SiO2, ou dioxyde de silicium, est le matériau le plus abondant de la croûte terrestre. Que ce soit sous forme cristalline (quartz, cristobalite, etc….) ou sous forme amorphe (verre anhydre ou silice colloïdale hydratée), la silice est utilisée dans un très grand nombre d’applications industrielles qui couvrent des domaines très différents : l’électronique, l’optique, les céramiques, la pétrochimie (catalyse, lubrifiants, revêtements de surface, renforcement de polymères), les industries des silicones et cimentière… La silice pouvant servir d’adsorbant, on retrouve son emploi en chromatographie depuis les années 1920.

Propriétés générales
La silice utilisée en chromatographie est une silice amorphe et poreuse [29]. Comme elle est hydroxylée et hydratée, on la désigne communément sous le terme de « gel de silice » [30] de formule SiO2, xH2O. Si sa résistance mécanique a pour origine le matériau en masse, les propriétés d’adsorption lui sont par contre conférées par sa grande surface d’échange. Or comme pour tous matériaux, la surface n’est jamais régulière, d’autant moins lorsqu’ils sont poreux.

En premier lieu, nous nous intéresserons aux caractéristiques locales de la silice à l’échelle de quelques atomes (< 1nm), puis nous décrirons les propriétés supplémentaires apportées par l’organisation du matériau à différents ordres de grandeur, que ce soit à l’échelle du pore ou de la particule (quelques micromètres).

Nature de la surface et chimie des silanols

A l’échelle atomique, la silice s’organise suivant un réseau formé de tétraèdres SiO4 (hybridation des orbitales de type sp3 ) liés chacun par leurs sommets. La surface du gel se compose de deux types de fonctions chimiques : les ponts siloxane Si–O–Si et les groupements silanol Si–OH. Si les ponts siloxane constituent la structure interne du réseau de silice, ils ne constituent pas pour autant l’essentiel de son squelette en surface . En effet, la présence d’eau en surface assure l’ouverture d’un certain nombre de ponts pour former des groupements silanol. La concentration de chacun de ces groupements varie suivant la température. A température ambiante, lorsque la surface est à son maximum d’hydroxylation, le nombre de groupes hydroxyles par unité de surface, αOH, avoisine 4,6±0,5 OH.nm-2 (soit 7,6±0,8 µmol/m²) [31] tandis qu’au-delà de 1200°C, seuls les ponts siloxane persistent. Ces derniers, résultant alors de la déshydratation de deux silanols voisins, sont hydrophobes et ne participent guère au phénomène d’adsorption, qui trouve en revanche son origine dans la présence des groupements silanol : hydrophiles, ils sont capables d’interagir par liaisons hydrogène mais aussi par liaisons de type π [32, 33] (cf. Annexe 1). On distingue différents types de silanols : les silanols libres ou isolés, les silanols vicinaux ou associés (liés par liaison hydrogène) et les silanols géminaux (encore dénommés silanediols). La distance moyenne séparant deux  silanols isolés est estimée à 0,5 nm. Pour que deux groupements puissent interagir par liaison H, il faut qu’ils soient séparés de moins de 0,31 nm. Lorsque la distance est inférieure à 0,28 nm, les silanols sont qualifiés de vicinaux puisqu’ils peuvent alors interagir avec plusieurs de leurs homologues [32].

L’aire moyenne occupée par un groupement hydroxyle est évaluée à 0,217 nm² [29]. Cependant, elle est dépendante du type de silanol : elle s’élève à 0,450 nm² pour un silanol isolé tandis qu’elle est réduite à 0,068 nm² pour des silanols vicinaux, pour une température inférieure à 300°C [31]. En présence d’eau, la surface de silice présente divers stades d’hydratation : autant les silanols peuvent n’être que simplement hydratés s’ils ne sont liés qu’à une seule molécule d’eau, autant la surface peut être entièrement recouverte d’une couche d’eau mono ou plurimoléculaire, aboutissant à un gel de silice fortement hydraté et dont les propriétés d’adsorption seront alors totalement masquées.

Géométrie et énergie de surface
Les matériaux solides ne possèdent jamais une surface parfaitement plane ou régulière, y compris ceux extrêmement organisés comme le PTFE ou le carbone sous forme graphite : persiste toujours un degré de désordre, variant suivant la nature du solide. Le désordre est plus prononcé pour les matériaux non cristallins, ou amorphes, comme la silice utilisée à des fins chromatographiques. Les surfaces réelles des solides présentent un degré limité d’organisation, quantifié par la dimension fractale D. Sa valeur pour la silice amorphe est estimée à 2,94±0,04 [36] pour un maximum de 3. Elle dénote donc une très grande porosité et explique ainsi les propriétés particulièrement adsorbantes de ce support. Ces propriétés fractales sont étroitement liées aux mécanismes de croissance du matériau [37].

Structure des pores

La structure poreuse d’un solide est caractérisée par les paramètres suivants : la porosité du matériau, le diamètre, la forme et la distribution de taille des pores, leur connectivité ainsi que leur volume et surface spécifique [41, 48-51]. Ces paramètres sont issus de différentes mesures de sorption. La porosité d’un matériau se définit par celle offerte aux molécules en phases gazeuse ou liquide. Selon les recommandations de l’IUPAC [52], le diamètre moyen de pore D définit la catégorie à laquelle le matériau appartient :
• D <2 nm : solide microporeux ;
• 2< D <20 nm : solide mésoporeux ;
• D >50 nm : solide macroporeux.

La surface spécifique Sp et le volume de pore vp sont déduits d’isothermes d’adsorption. Les silices utilisées classiquement en chromatographie sont mésoporeuses et possèdent généralement une distribution de pores unimodale .

Propriétés du support greffé 

Les groupements silanol résiduels 

Le taux de greffage variant de 25 à 50% [97, 98], il reste donc en surface au minimum 50% de groupements silanol n’ayant pas réagi. Par leur capacité notamment à interagir par mécanisme d’échange d’ions avec des composés cationiques lorsqu’ils sont sous forme anionique SiO-, ils sont souvent invoqués pour expliquer les traînes de pic constatées pour des composés basiques sous forme BH+ , entraînant une perte de résolution chromatographique gênante pour la séparation. Aussi plusieurs solutions ont été proposées pour résoudre les problèmes attribués aux silanols résiduels :

1. L’emploi d’un pH suffisamment acide pour la phase mobile, afin de s’affranchir de l’ionisation des groupements silanol ; cependant, ces conditions se révèlent souvent insuffisamment discriminantes pour séparer les composés d’intérêt, pas assez retenus du fait de leur état ionisé ;
2. L’utilisation d’un pH suffisamment élevé pour la phase mobile, pour supprimer l’ionisation des composés basiques, au risque d’être confronté à des problèmes de stabilité de la phase stationnaire – la silice se dissout à pH alcalin – et des solutés à analyser – certains produits se dégradent rapidement en milieu alcalin ;
3. L’addition à la phase mobile d’un agent cationique compétiteur, par exemple la triéthylamine, qui se charge du blocage des sites indésirables, pour diminuer la traîne de pic, sans pour autant la supprimer et susceptible d’entraîner des perturbations au niveau de la détection [33, 99, 100].

D’autre part, à la présence de silanols résiduels se combine celle d’impuretés métalliques [101]. En effet, ces impuretés contenues dans la silice initiale, qui ont tendance à se concentrer en surface de la matrice, constituent des sites de Lewis et exaltent l’acidité des silanols adjacents .

Les silanols dont l’acidité est renforcée par les métaux sont source d’interactions fortes avec des agents chélatants et certains composés basiques. La présence de cations métalliques participe ainsi à l’hétérogénéité chimique de surface de la silice. En pratique, s’affranchir de toute contamination métallique est difficile puisque que l’instrumentation est elle-même source de cations métalliques : cela requerrait au moins l’utilisation d’instruments dépourvus de pièces métalliques en contact avec le circuit fluidique [103]. Le taux d’impuretés métalliques natif, c’està-dire contenu au niveau de la phase stationnaire avant utilisation, dépend de son procédé de synthèse [50] et permet de définir deux catégories de silice [104-106] :

Type A les silices traditionnelles, contenant une large teneur en impuretés métalliques (valeurs typiques : 1000 ppm de sodium, 200 ppm d’aluminium et 150 ppm pour le fer) ;
Type B les silices ultra pures, de technologie plus récente, voient leur taux global s’abaisser à moins de 20 ppm.

La différence entre ces deux types de silice se retrouve sur les mesures de pKa des silanols de silices vierges ou greffées [107, 108] : outre la présence de plusieurs classes de silanols se distinguant par des acidités différentes, les silices de type A se révèlent toujours plus acides que leurs homologues de type B. Les phases stationnaires dédiées à l’analyse de composés basiques possèdent toutes des silices de type B [109], raison pour laquelle nous nous limiterons à cette dernière catégorie dans nos travaux.

Table des matières

Introduction
Partie A : Synthèse bibliographique et problématique
Chapitre I Les phases stationnaires greffées apolaires et l’analyse de solutés basiques
I.A Introduction
I.B La matrice de silice
I.B.1 Propriétés générales
I.B.2 Méthode de synthèse de la silice : le sol-gel
I.C Les silices greffées apolaires
I.C.1 Méthodes de greffage
I.C.2 Propriétés du support greffé
I.D De l’origine de la diversité des phases : réduction de l’accès aux silanols résiduels et extension de la gamme de polarité
I.D.1 Introduction
I.D.2 Stratégies d’élimination des silanols
I.D.3 Stratégies de masquage des silanols
I.D.4 Combinaisons
I.E Conclusion
Chapitre II Pourquoi une classification fondée sur une caractérisation ciblée ?
II.A Introduction
II.B Les tests spectroscopiques
II.C Les tests chromatographiques
II.C.1 Tests basés sur des modèles
II.C.2 Tests descriptifs
II.D Conclusion
Chapitre III L’apport de la chimiométrie à la classification des colonnes chromatographiques
III.A Analyse de corrélation
III.A.1 Principe
III.A.2 Applications
III.A.3 Limitations
III.B Analyse en Composantes Principales
III.B.1 Principe
III.B.2 Applications
III.B.3 Limitations
III.C Analyse en Clusters
III.C.1 Principe
III.C.2 Applications
III.C.3 Limitations
III.D Couplages ACP-AHC
III.E Conclusion
Partie B : Développement du test
Chapitre IV Méthanol et acétonitrile : deux modificateurs non interchangeables
IV.A Introduction
IV.B Effet sur la force isoéluante
IV.B.1 Principe de l’étude et choix des solutés
IV.B.2 Conditions expérimentales
IV.B.3 Résultats et discussion
IV.C Effet sur les phases stationnaires
IV.C.1 Conditions expérimentales
IV.C.2 Résultats
IV.D Conclusion
Chapitre V Construction du test : d’un test étendu à un test réduit pertinent
V.A Introduction et principe
V.B Partie expérimentale
V.B.1 Appareillage
V.B.2 Jeu de solutés
V.B.3 Conditions chromatographiques
V.B.4 Colonnes testées
V.C Traitement des données
V.C.1 Prétraitement/Organisation des données
V.C.2 Outils chimiométriques utilisés
V.D Résultats et discussion
V.D.1 Test dans les conditions étendues
V.D.2 Réduction du test
V.D.3 Test final
V.E Conclusion
Chapitre VI Pouvoir discriminant du test : étude de la variabilité interlot
VI.A Introduction
VI.B Partie expérimentale
VI.B.1 Instrumentation
VI.B.2 Conditions chromatographiques
VI.B.3 Phases stationnaires
VI.C Traitement des données
VI.C.1 Modèle
VI.C.2 Principe de l’exploitation
VI.D Résultats et discussion
VI.D.1 Résultats sur les colonnes SymmetryShield RP18
VI.D.2 Résultats sur les colonnes XTerra RP18
VI.D.3 Comparaison des dispersions interlot
VI.E Conclusion
Chapitre VII Etude de robustesse : domaine d’application
VII.A Introduction
VII.B Plan d’expériences utilisé
VII.B.1 Identification des facteurs et des réponses
VII.B.2 Sélection du modèle
VII.B.3 Plan d’expérimentation
VII.C Réalisation expérimentale
VII.C.1 Réalisation des essais
VII.C.2 Protocole opératoire de chaque essai
VII.D Principe de l’exploitation
VII.D.1 Elimination des réponses peu informatives
VII.D.2 Calcul des effets et interprétation statistique
VII.D.3 Construction du domaine robuste
VII.E Résultats et discussion
VII.E.1 Indice d’information et sélection des réponses
VII.E.2 Estimation des coefficients du modèle et interprétation
VII.E.3 Détermination du domaine de robustesse
VII.F Conclusion
Conclusion

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