Les peptides antimicrobiens produits par la fourmi Tetramorium bicarinatum

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Modèle des pores toroïdaux ou Wormhole model

Ce modèle est essentiellement connu pour les PAMs en hélices α. Ici, les peptides s’accumulent à la membrane parallèlement à celle-ci, en s’y fixant solidement grâce à leurs domaines hydrophobes. A partir d’une certaine concentration, les peptides s’insèrent entre les phospholipides membranaires, avec une orientation perpendiculaire à la membrane. Par la suite, les PAMs, qui sont amphiphiles, interagissent avec les têtes polaires de phospholipides par l’intermédiaire de leur domaine positif (Hirsh et al., 1996). Les complexes PAMs-phospholipides ainsi formés sont alors à l’origine de la formation de pores (Matsuzaki, 1999; Yeaman and Yount, 2003). La désintégration de ces pores permet ensuite la translocation des peptides dans le cytoplasme des cellules pathogènes (Figure 4). La melittine et la magainine utilisent ce modèle d’insertion (Lee et al., 2004; Matsuzaki, 1999). Cependant, la magainine emploie une variante de ce modèle, appelée « modèle par agrégats » ou « pores toroïdaux desordonnés» (Jenssen et al., 2006). Dans ce modèle, les PAMsn’adoptent pas de conformation perpendiculaire en s’insérant dans les phospholipides membranaires. Le LL-37 utilise également se modèle pour s’insérer dans les pathogènes cibles (Henzler-Wildman et al., 2004).

Modèle de pores en douve de tonneaux ou Barrel-stave model

Ce dernier modèle décrit la formation d’amas à l’aspect de tonneaux par les PAMs dans la membrane. Les peptides se fixent à la membrane et, comme dans le modèle de déstabilisation en tapis, induisent l’écartement des têtes hydrophiles externes des phospholipides membranaires. Ils pénètrent ensuite dans la cellule par leurs pôles hydrophobes en repoussant les phospholipides puis s’assemblent avec les chaînes carbonées des phospholipides en laissant leurs domaines hydrophiles libres qui formeront la paroi de spores (Figure 5). Ce modèle est par exemple décrit pour l’alaméthicine, PAM produit par le champignon Trichoderma viride (Bechinger, 1999).
Ces trois modèles principaux de déstabilisation membranaire ne sont cependant pas exclusifs. D’autre modèles moins fréquents ont en effets été identifiés comme par exemple le modèle de formation de clusters lipidiques, d’électroporation, de transport d’anions, etc… (Nguyen et al., 2011; Wimley and Hristova, 2011).
Après déstabilisation membranaire et translocation du côté intra-cytoplasmique, les PAMs peuvent pénétrer dans le cytoplasme et ainsi agir sur des cibles cytoplasmiques. Ils peuvent notamment interférer avec la synthèse des acides nucléiques, les voies métaboliques, l’activité enzymatique des pathogènes mais ils peuvent également agir sur la synthèse de la paroi (Brogden et al., 2003; Brogden, 2005; Jenssen et al., 2006).

Cibles intracellulaires des peptides antimicrobiens

Inhibition de la synthèse du peptidoglycane

Le peptidoglycane est une structure commune à toutes les bactéries, qui constitue la paroi bactérienne. Il est composé d’une partie glucidique (polysaccharides constitués de polymères de N-acétyl-glucosamine (NAG) et d’acide N-acétyl-muramique (NAM) reliés par des liaisons osidiques β1-4) et d’une partie peptidique qui correspond à un enchaînement répétitif d’unités de 4 acides aminés identiques (L-alanine reliée au NAM en position 1-D-glutamate- Acide diaminopimélique/Lysine- D-alanine).
Les PAMs inhibant la synthèse du peptidoglycane sont en général de petite taille, stables à la chaleur et comportent dans leur séquence des acides aminés soufrés. Ils agissent notamment en se liant au complexe D-Alanine-D-Alanine des précurseurs au stade lipidique, dont le clivage conduit à la formation du tétrapeptide (van Heijenoort, 2001). Ils bloquent ainsi la synthèse du peptidoglycane entraînant la mort cellulaire.

Inhibition de la synthèse protéique bactérienne

Certains PAMs ciblent, une fois présents dans le cytoplasme, des protéines impliquées dans la synthèse de protéines bactériennes. C’est le cas des apidaecines, PAMs riches en proline isolés chez l’abeille. Otvos et ses collaborateurs ont mis en évidence que ces PAMs se fixent spécifiquement à la protéine de choc thermique Dnak (70 kDa), qui possède une activité ATPase et participe à l’initiation de la synthèse de l’ADN bactérien, et de manière non-spécifique à la protéine chaperonine GroEL. Ce mécanisme est également employé par la pyrrhocoricine et la drosocine (Otvos et al., 2000).

Mécanismes de résistance aux peptides antimicrobiens

Bien qu’elles soient moins fréquentes et plus lentes à se mettre en place, des résistances aux PAMs se développent aussi chez les microorganismes pathogènes. Elles sont en premier lieu induites par la capacité naturelle de microorganismes d’une niche écologique donnée à résister à de fortes concentrations de peptides endogènes (Kraus and Peschel, 2006). En effet, l’acquisition d’une résistance aux PAMs par des souches naturellement sensibles est peu probable. De plus, l’acquisition de résistances à certains PAMs ne signifie pas que la souche pathogène sera résistante à tous les PAMs. Plusieurs mécanismes ont été décrits pour déclencher une résistance aux PAMs (Nizet, 2006; Peschel and Sahl, 2006). Les microorganismes peuvent produire diverses protéases entraînant la dégradation des PAMs et les rendant inactifs. Ce mécanisme est notamment utilisé par les bactéries, comme par exemple Staphylococcus aureus sur le LL-37(Sieprawska-Lupa et al., 2004). Certains pathogènes sont également capables de reconnaître les PAMs et peuvent limiter leur accès à la membrane plasmique via l’action de « molécules piégeuses ». Cette action peut être directe, par l’intermédiaire de molécules de surface, ou indirecte via des molécules sécrétées qui vont se lier aux PAMs (Schmidtchen et al., 2001). Les propriétés membranaires des agents pathogènes peuvent également être modifiées. Par exemple, de nombreuses bactéries peuvent réduire la charge négative de leur membrane afin d’éviter les interactions avec les PAMs cationiques et ainsi se protéger de la lyse par ces peptides (Neuhaus and Baddiley, 2003). Par ailleurs, certains microorganismes peuvent modifier la séquence en acides aminés des PAMs dans le but de modifier leur caractère cationique ou amphipatique, ce qui altère les propriétés fonctionnelles de ces peptides (Peschel, 2002; Peschel and Collins, 2001). Un autre mécanisme courant d’échappement à l’activité antimicrobienne des PAMs par les pathogènes est la présence à la membrane de ces derniers de pompes à efflux. Ces pompes, retrouvées chez certaines bactéries, participent au transport actif de molécules à l’extérieur des cellules de manière ATP-dépendante (Cattoir, 2004) et sont également capables d’expulser les PAMs hors des cellules. Un exemple d’utilisation de ce mécanisme est l’évacuation du LL-37 ou encore de la protégrine-1par la bactérie Neisseria gonorrhoeae, via son système de pompes à efflux nommé MtrCDE (Shafer et al., 1998).
La figure 6 résume les principaux effets de résistance aux PAMs développés par les pathogènes.

Propriétés fonctionnelles des macrophages

La phagocytose

La phagocytose est une fonction clé des macrophages qui est nécessaire à la défense immunitaire innée et adaptative anti-infectieuse. En effet, elle permet l’élimination des microorganismes pathogènes, mais aussi des cellules sénescentes, des débris cellulaires et des particules exogènes. Ce processus est également nécessaire à l’organogenèse, au remodelage et à l’homéostasie tissulaire notamment à travers la phagocytose des cellules et débris apoptotiques (efférocytose). Dans la réponse immunitaire, la phagocytose est une fonction spécifique des phagocytes « professionnel » que sont les monocytes et macrophages, les cellules dendritiques et les neutrophiles. Elle diffère entre ces différentes populations cellulaires, mais on retrouve cependant de nombreuses caractéristiques communes (Flannagan et al., 2012). Cette fonction phagocytaire correspond à la capture, l’ingestion et la dégradation des pathogènes et est associée à la présentation antigéniques. La reconnaissance des pathogènes à phagocyter par les récepteurs de phagocytose se fait soit par la reconnaissance directe de motifs antigéniques soit indirectement via la reconnaissance d’opsonines (molécules du complément, immunoglobulines) recouvrant la surface du pathogène (Underhill and Goodridge, 2012).
La phagocytose se divise en trois phases: la reconnaissance, l’internalisation puis la dégradation du composé à phagocyter. La reconnaissance des structures d’intérêt par le récepteur déclenche le réarrangement du réseau d’actine dans la cellule, ce qui conduit à l’invagination de la membrane plasmique et la formation des phagosomes. Celui-ci est produit à partir de la fusion de la membrane plasmique avec des vésicules issues d’organites intracellulaires (endosomes et réticulum endoplasmique). Ensuite le phagosome se ferme et entame un processus de maturation qui est reflété par l’acidification des vésicules (pH proche de 4-5) suite à sa fusion avec les lysosomes. Le pH acide des phagolysosomes formé permet l’activation optimale des enzymes lysosomales et nécessaires à la dégradation des éléments ingérés (Flannagan et al., 2012; Kinchen and Ravichandran, 2008).
Le processus de phagocytose est un point commun à tous les états de polarisation des macrophages. Ainsi, le panel de récepteurs qu’ils exprimeront conditionnera le type de ligands et les pathogènes reconnus via les récepteurs de phagocytose et, de ce fait, orientera la réponse immunitaire des macrophages engendrée par le processus phagocytaire.

Les intermédiaires réactifs de l’oxygène (IROs)

Le processus de phagocytose est le plus souvent associé à une hyperactivité oxidative conduisant à la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ces composés, toxiques pour les microorganismes, participent à leur destruction en entraînant la peroxydation des lipides, l’oxydation des protéines et des acides nucléiques des pathogènes.
Les intermédiaires réactifs de l’oxygène sont produits au niveau des membranes cellulaires (membrane plasmique ou membrane mitochondriale) par l’action du complexe enzymatique NADPH (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oxydase activé. Ce complexe, qui est présent sous forme inactive dans le cytoplasme des phagocytes non activés, est composé de sous-unités cytosplasmiques (p67 phox, p40 phox, p47 phox et Rac) et membranaires (p21phox, gp91phox et Rap) (Vignais, 2002). Suite à l’activation des monocytes/ macrophages, les sous unités cytoplasmiques sont recrutées au niveau de la membrane plasmique ou des phagosomes, permettant ainsi l’assemblage de la NADPH oxydase au niveau de ces membranes(El-Benna et al., 2009). Suite à cet assemblage, la NADPH oxydase transfère des électrons du NADPH à l’oxygène moléculaire pour produire l’anion superoxyde (O2.-). S’ensuivent des cascades enzymatiques aboutissant à la production de diverses espèces réactives de l’oxygène. Ainsi, l’anion superoxyde constitue un substrat de choix pour la génération de peroxyde d’hydrogène (H2O2) par l’enzyme superoxyde dismutase (SOD). L’ H2O2 formé est ensuite engagé dans une réaction catalysée par la myéloperoxydase (MPO) conduisant à la production de puissants agents oxydants comme l’acide hypochloreux (HOCl). Ces différents composés produits se retrouvent alors en concentration importante dans le phagosome et exercent des effets cytotoxiques sur les éléments phagocytés. De plus, certains types de macrophages ont la capacité à produire, après induction de l’enzyme iNOS (inducible nitric oxyde synthase), des dérivés nitrés comme le monoxyde d’azote (NO) par oxydation des noyaux azotés de la L-arginine et de la L-citrulline. Le NO, en association avec l’anion superoxyde, permet la formation de peroxynitrites (ONOO-) qui sont elles aussi des espèces très réactives (Figure 9).
Le contrôle de la production de ces différentes espèces réactives de l’oxygène, qui sont surtout produites par les macrophages M1 en forte quantité, est nécessaire afin d’éviter de causer des dommages cellulaires chez l’hôte. Ainsi, pour se protéger, les cellules disposent d’enzymes telles que les peroxydases et les catalases qui sont capables d’éliminer le peroxyde d’hydrogène limitant ainsi la production de ces radicaux libres toxiques pour la cellule.

Cytokines/chimiokines

La production de cytokines et de chimiokines est fortement liée à la différenciation et au type d’activation des monocytes et macrophages. Ces médiateurs, qui sont de petits peptides intervenant dans la réponse immunitaire, sont important dans le dialogue entre les lymphocytes T et les monocytes/macrophages, permettant à la réponse immune d’évoluer dans le temps, de modifier le panel de cellules recrutées ainsi que leur répertoire fonctionnel.

Les cytokines

Les cytokines constituent une grande famille complexe de petites molécules solubles impliquées dans la réponse immunitaires comprenant notamment les interleukines (IL, au nombre de 35), les interférons (IFN), le TNFα, etc… Elles contribuent au microenvironnement des monocytes et macrophages et de ce fait, orientent finement le comportement de ces cellules. En effet, ces molécules constituent des signaux majeurs de différenciation des monocytes et macrophages, en induisant la transcription et l’expression de nombreux gènes impliqués dans la programmation de ces cellules. Les lymphocytes T CD4+ helper (comprenant les lymphocytes Th1 et les Th2) et les lymphocytes Natural killer(NK) sont les principales sources de production des cytokines intervenant dans la polarisation des macrophages. Les lymphocytes Th1 produisent des cytokines telles que l’IFNγ et l’IL-2 qui interviennent dans l’immunité à médiation cellulaire contre les pathogènes intracellulaires (bactéries, virus, champignons) (Mosmann and Coffman, 1989). L’IFNγ produit par ces cellules est un facteur crucial d’activation des macrophages vers un phénotype M1 et dans le rétrocontrôle négatif de la réponse Th2. Cette dernière, via la production de cytokines comme l’IL-4, l’IL-5, l’IL-9, l’IL-10 ou encore l’IL-13 et l’IL-25, est impliquée dans la défense contre les pathogènes extracellulaires multicellulaires (parasites: helminthes, etc…) mais aussi dans des pathologies allergiques comme par exemple la dermatite atopique ou l’asthme allergique (Riffo-Vasquez and Spina, 2002). L’IL-4 et l’IL-13 produites par ces cellules représentent les cytokines majeures de l’induction de la polarisation alternative (M2a) des macrophages (Mantovani et al., 2004).
Les macrophages produisent également une grande diversité de cytokines dont le panel varie selon leur état d’activation, orientant ainsi leur réponse. Suite à la reconnaissance d’organismes pathogènes, ils produisent des cytokines pro-inflammatoires telles que les cytokines de la famille de l’IL-1 (IL-1α, IL-1β et IL-18), l’IL-6 et l’IL-12 (Barksby et al., 2007). Le TNF-α est une cytokine principalement sécrétée par les monocytes et macrophages, qui initie la production d’une cascade de cytokines qui vont favoriser la mise en place de la réponse inflammatoire (Mukhopadhyay et al., 2006).
La production de cytokines de la famille de l’IL-1 a récemment été associée à l’activation d’un complexe protéique majeur impliqué dans le développement de la réponse inflammatoire, appelé inflammasome (Ciraci et al., 2012; Martinon et al., 2009) et qui sera décrit plus tard dans ce manuscrit. Brièvement, l’inflammasome est un complexe qui, en s’activant, induit la maturation de la forme inactive de l’IL-1β (pro-IL-1β) en IL-1β active sécrétée grâce à un clivage enzymatique finement contrôlé par la Caspase-1. De la même manière, il intervient également dans la sécrétion d’IL-18 sous forme mature. Ceci permet une réponse très rapide ne nécessitant pas de régulation transcriptionnelle directe. Ce complexe joue un rôle majeur dans le développement de la réponse inflammatoire puisque la sécrétion des cytokines de la famille de l’IL-1 est indispensable à la mise en place de cette réponse via l’activation et le recrutement de nombreux médiateurs cellulaires et solubles. L’importance de ces cytokines dans le processus inflammatoire est telle qu’une mauvaise régulation de la sécrétion de ces facteurs solubles est à l’origine de nombreuses pathologies inflammatoires d’origine génétique (Syndrome de Muckle Wells, etc…), auto-immune (goutte et pseudo-goutte par exemple) ou environnementale (allergie, asbestose, silicose) (Agostini et al., 2004; Cassel et al., 2008; Dostert et al., 2008; Duewell et al., 2010).
Les macrophages sont également capables de sécréter des cytokines anti-inflammatoires telles que l’IL-10, qui inhibe la production d’IFNγ et d’IL-2 (Zuany-Amorim et al., 1997), et le TGF-β. L’IL-10 régule aussi négativement la production de TNF-α, d’IL-1β ainsi que des chimiokines CC telles que MCP1 (Monocyte chimioattractant protein 1 ou CCL2), Rantes (Regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted ou CCL5) ou MIP-1 (Macrophage inflammatory protein 1α) et les chimiokines CXC KC (Keratinocyte-derived chemokine) et IP-10 (Interferon gamma-induced protein 10 ou CXCL10) par les macrophages (Moore et al., 2001). De plus, cette cytokine est responsable du phénomène d’anergie des lymphocytes qui est associé à l’induction des lymphocytes T régulateurs (Moore et al., 2001).
Le TGF-β produit par les monocytes et les macrophages permet quant à lui de limiter la réponse inflammatoire en inhibant la E-sélectine impliquée dans l’adhésion et le recrutement des leucocytes sur le site de l’inflammation et en diminuant la production de RLO (Wahl, 1994). Il induit également l’expression de Foxp3 (Forkhead box P3) chez les lymphocytes T régulateurs, facteur de transcription indispensable au maintien de leur activité immunosuppressive, ce qui démontre que le TGF-β est également important dans le contrôle de la réponse immune adaptative (Chen et al., 2003; Williams and Rudensky, 2007). De plus, il favorise la réparation tissulaire en stimulant la prolifération des fibroblastes, la synthèse de collagène et le remodelage de la matrice extracellulaire néoformée (Mosser and Edwards, 2008; Nall et al., 1996).
La sécrétion de ces cytokines varie selon l’état d’activation des macrophages. Ainsi, les macrophages M1 sécrèteront d’avantage de cytokines pro-inflammatoires. Les macrophages M2 sécrètent quant à eux des cytokines anti-inflammatoires en grande quantité. Cependant, certains d’entre eux, comme les macrophages M2b, sont capable de sécréter des chimiokines pro-inflammatoires comme l’IL-1β et le TNF-α, en association avec les chimiokines anti-inflammatoires.

L’inflammasome

L’inflammasome est un complexe multiprotéique exprimé dans les cellules myéloïdes qui est capable d’activer des caspases inflammatoires, conduisant à la production et à la sécrétion des cytokines IL-1β et IL-18. A ce jour, 5 complexes inflammasomes différents ont été et caractérisés: les inflammasomes Nlrp 1, 3 et 6, AIM2 (Absent in melanoma 2) et Nlrc4 (Figure 10). Ils reconnaissent et sont activés par une large gamme de PAMPs et de DAMPs et chaque inflammasome est induit par des signaux différents.
D’une manière générale, les inflammasomes sont constitués d’une protéine récepteur reconnaissant le stimulus inducteur et permettant, dans les cellules activées, le recrutement de la protéine adaptatrice ASC (ou PYCARD, Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD). Celle-ci permet le recrutement et l’activation de caspases qui sont des protéases à Cystéine, principalement la caspase-1 conduisant ainsi à la production par clivage protéolytique et la sécrétion d’IL-1β et d’IL-18 sous forme active.

La voie des cyclooxygénases

La synthèse des protanoïdes par les monocytes et les macrophages est induite suite à un signal inflammatoire ou infectieux, déclenché par la phagocytose de levures comme C. albicans ou de parasites comme Leishmania infantum.
Suite à la libération de l’AA par la cPLA2, celui-ci subit une étape de cyclisation puis l’addition de deux molécules d’oxygène sous l’action des COX. Les COX sont des enzymes membranaires possédant deux activités enzymatiques distinctes, dont l’action combinée conduit à la formation de la PGH2. Dans un premier temps, l’activité cyclooxygénase convertit l’AA en PGG2(Smith et al., 1996). Ce métabolite instable est ensuite rapidement oxydé via l’activité peroxydase des COX. La PGH2 ainsi formée sert ensuite de substrat commun à la formation de PG, des thromboxanes et prostacyclines qui seront produites sous l’action de différentes enzymes.
Les COX existent sous deux isoformes qui sont codées par deux gènes distincts. COX1 est exprimée de manière constitutive, c’est-à-dire qu’elle s’exprime en absence de toute stimulation dans la plupart des tissus. A l’inverse, COX2 est une enzyme inductible qui peut être activée par un grand nombre de facteurs parmi lesquels les facteurs de croissance (TGFβ, EGF (Epidermal growth factor), etc…), certaines cytokines comme l’IL-1α, l’IL-1β ou le TNF-α, des endotoxines, etc… (Crofford, 1997). Les PGs sont reconnues par des RCPG et peuvent agir, par l’intermédiaire de ces derniers, en tant que messagers autocrines ou paracrines. Elles interviennent dans la modulation du taux d’AMPc (Adénosine 3’-5’ monophophate cyclique) et le flux calcique à travers l’activation de la phospholipase C (PLC) et de la protéine kinase C (PKC) (Narumiya and FitzGerald, 2001; Narumiya et al., 1999). Elles peuvent également induire la stabilisation du complexe cytosolique NF-κB/Iκ-B et ainsi inhiber la transcription des gènes cibles de NF-κB. De façon intéressante, la PGD2 peut aussi être métabolisée en 15-déoxy-Δ12, 14-PGJ2 dans les macrophages, ce métabolite étant un ligand endogène du récepteur nucléaire PPARγ.

La voie des lipoxygénases

Parallèlement à la voie des COX, la voie des lipoxygénases permet la formation de leucotriènes (LTs), de lipoxines (LXs) et d’acides gras hydroperoxydés (HPETEs) ou hydroxylés (HETEs) à partir de l’AA (Samuelsson et al., 1987).
Les leucotriènes sont des lipides bioactifs produits par un nombre restreint de cellules, en particulier par les mastocytes et les macrophages. Comme les PGs, ils exercent leurs effets par l’intermédiaire de RCPGs. Ils sont produits grâce à l’action de la 5-LOX combinée à d’autres enzymes spécifiques des différents leucotriènes existant. Cette enzyme, initialement présente dans le cytosol ou le noyau, est recrutée à la membrane plasmique en même temps que la cPLA2 lors de son processus d’activation. Au niveau de la membrane plasmique, la FLAP (Five lipoxygenase-activating protein) favorise la présentation de l’AA à la 5-LOX qui induit, dans un premier temps, l’oxygénation de ce dernier. Ceci conduit à la formation de composés intermédiaires que sont les 5-HPETEs. La 5-LOX catalyse ensuite la déshydratation de ces 5-HPETEs en leucotriène A4 (LTA4). Ce métabolite électrophile instable est directement converti soit en LTB4, par l’action de la LTA4 hydrolase, soit en LTC4 obtenu par la conjugaison du LTA4 avec le glutathion grâce à la LTC4 synthase. Ce dernier est converti en LTD4 et LTE4 et est impliqué dans les réactions allergiques (Gronert et al., 1999; Peters-Golden and Brock, 2001). Le LTB4 est quant à lui, un puissant agent chimiotactique des neutrophiles. Cependant, des études récentes ont également démontré son rôle dans l’activation de l’inflammasome et ainsi dans la production d’IL-1β (Amaral et al., 2012).
Le LTA4 formé suite à la conversion de l’AA par la 5-LO peut également être métabolisé par les enzymes 12-LO et 15-LO, ces deux enzymes étant présentes sous forme combinée 12/15-LOX chez la souris. Ceci conduit à la formation de l’intermédiaire métabolique 5(S),6(S)-époxy-15(S)-hyproxy-eicosatétraénoïque qui sera à son tour converti en lipoxine A4 (LXA4) ou en lipoxine B4 (LXB4) selon les hydrolases présentes dans les cellules (LXA4 hydrolase pour la LXA4 hydrolase (LXA4H) et LXB4H respectivement). Les lipoxines peuvent également être produites par l’action des 12 et 15-LOX sur l’AA qui va directement former du 12 ou 15-HPETE qui sera ensuite métabolisé par la 5-LOX puis la LXA4H ou la LXB4H.
Les lipoxines ont un rôle anti-inflammatoire et agissent également dans la résolution de l’inflammation, notamment via des RCPGs. En effet, elles sont connues pour contrôler la réponse inflammatoire dans des pathologies comme l’asthme, l’arthrite ou encore les affections gastro-intestinales, parodontales, rénales et pulmonaires. Elles interviennent aussi dans la régulation de la réponse immunitaire suite à une infection par des parasites (Bafica et al., 2005; Serhan and Savill, 2005).

Polarisation des macrophages

Les fonctions effectrices des macrophages sont étroitement liées à leur état de différenciation et d’activation, lui-même dicté par leur environnement cellulaire et moléculaire. Ces cellules sont caractérisées par une plasticité phénotypique et fonctionnelle qui leur permet de répondre aux différents signaux micro-environnementaux (cytokines, signaux de danger, etc…) en se polarisant. Il a été mis en évidence dans les années 1970s qu’en fonction des signaux, les macrophages pouvaient se polariser selon deux voies d’activation : la voie classique et la voie alternative de polarisation. Ainsi, des macrophages soumis à un environnement cytokinique Th1produisant de l’interféron-γ (IFN-γ) ou de TNFα, associé à la présence de LPS, composant de la paroi des bactéries Gram négatif, se dirigent vers la voie classique d’activation et deviennent pro-inflammatoires. Ces macrophages sont aussi appelés macrophages M1 en référence au contexte Th1 les induisant. A l’inverse, tous les macrophages activés par une voie différente de la « voie classique » sont par extension associés à la « voie alternative », plus tard renommés macrophages M2, car induits dans un contexte Th2 (Figure 13). C’est en 2003 que l’équipe de Gordon crée la classification M1/M2 des macrophages, basée sur le modèle de nomenclature Th1/Th2 des lymphocytes T CD4+ déjà existante(Gordon, 2003). Les macrophages M1 et M2 se distinguent par le niveau d’expression de récepteurs membranaires et intracellulaires mais aussi en fonction des médiateurs solubles qu’ils produisent (cytokines, chimiokines, médiateurs lipidiques, ROS, etc…). Cependant, les données scientifiques actuelles ont permis de nuancer cette notion de polarisation. En effet, on ne parle plus de dichotomie M1/M2. La polarisation M1/M2 se définit plutôt comme étant un continuum d’états fonctionnels avec un panel différent d’expression des récepteurs (PRR entre autres) et de fonctions variant selon les stimuli présents dans le microenvironnement.
En 2004, Mantovani et ses collègues affinent encore plus la classification des macrophages en subdivisant les types de macrophages M2(Mantovani et al., 2004). Schématiquement, on retrouve les macrophages M2a induits par l’exposition à l’IL-4 ou à l’IL-13 et qui participent à l’inflammation de type 2 (Th2/Th17), les macrophages M2b dits « immunomodulateurs » de l’inflammation de type 2, les macrophages M2c « réparateurs » des tissus endommagés et les macrophages M2d qui ont un rôle anti-inflammatoire (Figure 13). Chaque polarisation n’est pas un état figé et est dépendante de l’environnement cellulaire et moléculaire des macrophages.

Les macrophages M1

Caractéristiques phénotypiques

Les macrophages M1 correspondent à une activation « classique » des macrophages induite dans un contexte Th1, par l’association de deux signaux : l’interféron gamma (IFNγ) couplé à un stimulus bactérien tel que les LPS ou à des cytokines comme le TNFα ou le GM-CSF (Granulocyte macrophage-colony stimulating factor) (Martinez et al., 2006; Mosser, 2003). Ces macrophages M1 produisent alors de l’IL-12 qui, en synergie avec l’IL-18, constitue un signal fort pour le développement d’une réponse adaptative Th1. En retour, les lymphocytes Th1 ainsi activés produisent des niveaux plus élevés d’IFNγ. L’activation classique des macrophages est alors totale et déclenchée de manière durable.
D’une manière générale, la polarisation M1 est caractérisée par une forte inflammation et est nécessaire à la résistance de l’hôte contre les pathogènes intracellulaires tels que les mycobactéries, les bactéries et les virus. Ces macrophages à activation classique favorisent également la résistance aux tumeurs (Mantovani, 2008). Cependant, les macrophages M1 sont aussi impliqués dans les dommages tissulaires, notamment les lésions de l’ADN suite à la production d’espèces radicalaires, et dans des pathologies dues à une inflammation chronique comme la polyarthrite rhumatoïde (Gordon, 2003).
Les macrophages M1 sont caractérisés par la surexpression de récepteurs membranaires qui reconnaissent les pathogènes opsonisés par les molécules du complément (CRs) ou les immunoglobulines (récepteurs aux fragments constants des immunoglobulines, FcγR) mais aussi les TLRs (Toll-like receptor). Les voies de signalisation déclenchées suite à l’engagement de ces récepteurs induisent l’activation des facteurs de transcription NF-κB (Nuclear factor kappa B) et STAT (Signal transducer and activation of transcription)-1 ainsi que des voies de signalisation des MAPK (Mitogen activated protein kinase) et des IRFs (Interferon regulatory factor) (Held et al., 1999; Schroder et al., 2006). L’activation de ces différentes voies permet la production en grandes quantités de cytokines pro-inflammatoires telles que le TNFα, l’IL-1β, l’IL-6, l’IL-12 ou encore l’IL-23. L’amplification de la réponse inflammatoire déclenchée par les macrophages M1 passe également par la capacité de l’IFN-γ à inhiber l’effet de l’IL-10. Ainsi, l’IFN-γ inhibe le rétrocontrôle négatif déclenché par une activation excessive du TLR-2 et la production d’IL-10 via l’activation du facteur de transcription AP-1 (Activator protein-1) (Hu et al., 2007). De plus, l’expression des FcγR et des CR confère aux macrophages M1 une forte activité de phagocytose des pathogènes opsonisés.
Les macrophages M1 sont également d’importants producteurs de chimiokines permettant le recrutement des lymphocytes Th1, T CD8 cytotoxiques de type 1 et NK (Natural Killer) mais aussi d’autres macrophages inflammatoires. Les principales chimiokines produites sont essentiellement de type CC (CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL19, CCL20) mais aussi la production de CXCL10 et CXCL13 est également augmentée par l’IFN-γ (Mantovani et al., 2004; Martinez et al., 2006).
Ils produisent également des lipides bioactifs tels que les prostaglandines (PG), notamment la PGE2, et les leucotriènes, principalement le leucotriène B4 (LTB4). Les eicosanoïdes produits par les macrophages M1 permettent, entre autres, de déclencher la libération de cytokines (Aoki and Narumiya, 2012). Par exemple, la PGE2 induit, via son récepteur EP4 et avec le LPS, l’expression des cytokines pro-inflammatoires IL-6 et IL-1β mais aussi l’expression de l’enzyme responsable de la synthèse des prostaglandines COX-2 (Cyclooxygénase 2) (Hinz et al., 2000).
Cependant, elle est également connue pour avoir des effets opposés selon le stimulus et le récepteur engagé (EP1 ou EP4). Ainsi, elle peut induire la production d’IL-10 et de ce fait avoir des propriétés immunomodulatrices (Akaogi et al., 2004; Hata and Breyer, 2004; Nataraj et al., 2001; Takayama et al., 2002). Le LTB4, un autre lipide bioactif important dans la réponse inflammatoire et jouant un rôle chimiotactique essentiel, est impliqué dans le recrutement des monocytes et des neutrophiles sur le site inflammatoire (Hoover et al., 1984; Lewis et al., 1981). Cet eicosanoïde entraîne également la sécrétion d’IL-1β par les macrophages et d’IL-2 ou encore d’INF-γ par les lymphocytes (Amaral et al., 2012; Rola-Pleszczynski and Lemaire, 1985; Rola-Pleszczynski et al., 1986). Il a également été montré que le LTB4 favorise la phagocytose de pathogènes par les neutrophiles et les macrophages (Mancuso et al., 2001; Okamoto et al., 2010).
En outre, les macrophages M1 sont capables de déclencher un puissant mécanisme microbicide en induisant l’expression de la NO synthase inductible (iNOS) et de sous-unités de la NADPH oxydase. L’induction de ces enzymes, suite à la reconnaissance d’agonistes reconnus par les récepteurs exprimés par les macrophages M1, a pour conséquence une forte production d’intermédiaires réactif de l’oxygène (ROS) par la NADPH et d’espèces nitrosylées produites par l’enzyme iNOS (MacMicking et al., 1997; Vignais, 2002). Cette forte activité microbicide des macrophages M1 est associée à une capacité importante de présentation de l’antigène par les molécules de CMH (Complexe majeur d’histocompatibilité) I et II dont l’expression est augmentée par l’’IFN-γ.

Récepteurs exprimés à la surface des macrophages M1

Les fonctions effectrices des macrophages sont déclenchées suite à la reconnaissance d’éléments pathogènes par l’intermédiaire de nombreux récepteurs. Ces récepteurs peuvent interagir soit avec des molécules sécrétées par le système immunitaire qui se fixent sur les pathogènes (opsonisation des pathogènes), comme les molécules du complément et les fragments d’immunoglobulines (Ig), ou avec des structures microbiennes conservées telles que des constituants de la paroi ou les acides nucléiques (Plüddemann et al., 2011). Une qualité optimale de l’interaction récepteurs-pathogènes est indispensable pour le déclenchement des fonctions effectrices adaptées des macrophages. La coordination des réponses immunes innée et adaptative dépend également de cette étape initiale et est nécessaire à la clairance du pathogène tout en limitant les effets cytotoxiques de la réponse inflammatoire et les dommages tissulaires associés.
Les macrophages M1 expriment à leur surface trois familles de récepteurs: les TLRs qui reconnaissent des PAMPs exprimés à la surface des pathogènes, les récepteurs au complément (CR) et les récepteurs aux fragments constants des IgG (FcγR, Fc gamma receptor), ces deux derniers reconnaissant les pathogènes opsonisés (Figure 14).

Les récepteurs reconnaissant les pathogènes opsonisés

Les macrophages peuvent reconnaître de manière non spécifique des pathogènes recouverts de molécules produites par d’autres cellules du système immunitaire que sont les immunoglobulines (Ig) et/ou les facteurs du complément. Ce mécanisme, appelé opsonisation des pathogènes, peut être spécifique ou non spécifique et permet de diversifier et d’augmenter le répertoire de reconnaissance des pathogènes. L’opsonisation est particulièrement importante dans le cas où les pathogènes ne présentent pas de motifs conservés accessibles pour être reconnus par les récepteurs des macrophages (Stuart and Ezekowitz, 2005).
– Les récepteurs aux fragments constants des IgG
Les récepteurs aux fragments constants des IgG (FcγR) appartiennent à la superfamille des immunoglobulines et permettent la reconnaissance de pathogènes recouverts d’IgG. Ils sont au nombre de trois récepteurs différents : FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) et FcγRIII (CD16)(Gerber and Mosser, 2001) (Figure 18).
Ces récepteurs transmembranaires ont en commun 2 ou 3 domaines extracellulaires immunoglobulin-like qui reconnaissent la partie constante (Fc) des IgG. Ils présentent au niveau de leur extrémité intra-cytoplasmique des domaines de type ITAM/ITIM (Immuno-receptor tyrosine-based activation/inhibition motif) permettant le recrutement de kinases ou de phosphatases. Ces différentes enzymes activent ou inhibent les cascades de phosphorylations nécessaires à l’induction de la phagocytose et à la transduction d’un signal afin de moduler la réponse immunitaire.
Une fois activés, les récepteurs possédant un motif ITAM permettent le recrutement de la protéine tyrosine kinase Syk (Spleen tyrosine kinase) qui à son tour va activer des substrats tels que la PI3K (Phosphoinositide-3-kinase), Erk (Extracellular signal-regulated kinase), etc… (Ravetch and Bolland, 2001). Les récepteurs possédant un motif ITIM (FcγRIIB1/B2) vont recruter la phosphatase SHIP (SH2 domain-containing inositol 5’-phosphatase) qui va inactiver les messagers libérés suite à l’activation d’autres FcγR couplés à un motif ITAM, évitant ainsi la libération de Ca2+(Ravetch and Bolland, 2001). Les voies de signalisation déclenchées par les FcγR permettent d’activer les fonctions cellulaires telles que l’endocytose, la phagocytose, le phénomène de cytotoxicité ADCC (Antibody-dependant cell-mediated cytotoxicity) ainsi que la production de médiateurs pro-inflammatoires (Gerber and Mosser, 2001) (Figure 19).
– Les récepteurs au complément
Les récepteurs au complément (CRs) sont subdivisés en trois sous-types de récepteurs. Le premier groupe comporte les récepteurs CR1 et CR2 qui sont composés, dans leur domaine extracellulaire, d’unités répétées consensus appelées SCR (Short consensus repeat). Les récepteurs CR3 et CR4 appartiennent eux à la famille des intégrines β2 et le troisième type de CR, CRIg fait partie de la superfamille des imumnoglobulines (van Lookeren Campagne et al., 2007) (Figure 20).
Le récepteur CR1 (CD35) est une glycoprotéine composée de 30 SCR, un segment transmembranaire et d’une petite partie intra-cytoplasmique. Il reconnaît les molécules du complément C3b et C4b sans induire leur internalisation (Krych-Goldberg and Atkinson, 2001). Il joue un rôle majeur dans la clairance des complexes immuns présents dans la circulation sanguine, évitant ainsi que leur dépôt ne devienne pathologique.
Le récepteurs CR2 (CD21) reconnaît les fractions du complément iC3b et C3dg et est le récepteur principal favorisant la prolifération des lymphocytes B(Matsumoto et al., 1991; Weis et al., 1984). Chez la souris, les CR1 et CR2 sont produits à partir de l’épissage alternatif du même gène.
Les récepteurs CR3 et CR4 sont des récepteurs hétérodimériques de surface appelés CD11b/CD18 et CD11c/ CD18 respectivement, appartenant à la famille des intégrines (Arnaout, 1990; Newton et al., 1997). Ils sont majoritairement exprimés à la surface des neutrophiles, des monocytes, des macrophages et des cellules NK (Ross, 2000). Ils sont tous deux impliqués dans les phénomènes d’adhésion à la matrice extracellulaire, de phagocytose mais également dans la migration des leucocytes en réponse à une inflammation (Ross, 2000). La chaîne C11b du récepteur CR3 présente à son extrémité N-terminale un domaine I commun à la famille des intégrines qui interagit avec la molécule C3b du complément (Balsam et al., 1998; Zhang and Plow, 1996). CR3 possède également en C-terminal un domaine lectin-like de reconnaissance des polysaccharides, qui lui permet de reconnaître les β-glucanes exprimés à la paroi de pathogènes comme Candida albicans (O’Brien et al., 2012; Xia et al., 1999). Ce récepteur est positivement régulé par les cytokines et le PMA (Phorbol-12-myristate-13-acetate) (Ross, 2000) et active des voies de signalisation pro- inflammatoires (Xia et al., 1999).
Le récepteur IgCR a récemment été identifié comme appartenant à la superfamille des immunoglobulins (Helmy et al., 2006; Langnaese et al., 2000). Son expression est restreinte à certains macrophages résidents (cellules de Kupffer, macrophages interstitiels cardiaques, macrophages présents dans la synovie des articulations et les cellules spumeuses contenues dans les plaques d’athérome) et participe à l’homéostasie en internalisant des agents potentiellement pathogéniques.

Facteurs de transcription impliqués dans la polarisation M1 des macrophages

La reconnaissance par les macrophages d’un élément étranger ou d’un tissu lésé engendre chez ces derniers des signaux qui vont activer un programme de différenciation sous le contrôle de complexes transcriptionnels. Ceux-ci vont être à l’origine de l’expression de différents panels de gènes et ainsi orienter le phénotype et les fonctions des macrophages, induisant des changements marqués dans leur activité.
Dans cette partie, nous nous intéresserons aux signaux intrinsèques de différenciation des macrophages M1 et plus particulièrement aux facteurs de transcription spécifiques de cette polarisation STAT-1, IRF5. Nous aborderons également le facteur de transcription NF-κB qui est commun aux polarisations M1 et M2 et intervient dans le contrôle de l’expression de gènes impliqués dans l’inflammation.

STAT-1

STAT-1 appartient à une famille de protéines transductrices des signaux et activatrices de la transcription, constituée de 7 membres chez les mammifères.
Les protéines STAT sont majoritairement activées par des facteurs de croissance comme l’hormone de croissance (Han et al., 1996), l’EGF (Epidermal growth factor) (Leaman et al., 1996) ou encore le PDGF (Platelet derived growth factor)(Vignais et al., 1996), et des cytokines comme l’IL-6 et les interférons. La voie Jak (Janus associated kinase)/STAT-1 est impliquée dans la majorité des effets pléiotropiques de l’IFN-γ (Darnell et al., 1994).
L’IFN-γ exerce ses effets sur les cellules en interagissant avec son récepteur spécifique constitué de deux sous-unités, IFNGR1 et IFNGR2, exprimé de façon quasi-ubiquitaire. Cette interaction entraîne l’oligomérisation des deux kinases Jak1 et Jak2 puis leur activation par transphosphorylation. Une fois activées, elles phosphorylent le domaine intracellulaire du récepteur à l’IFN-γ sur des résidus Tyrosine, ce qui permet le recrutement de STAT-1 via son domaine SH2 (Src-homology-2 domain). S’ensuit la phosphorylation du facteur de transcription STAT-1 sur un résidu tyrosine, son homodimérisation qui dépend également de son domaine SH2, puis sa translocation nucléaire. Une fois dans le noyau, l’homodimère STAT-1-STAT-1 se lie à l’élément de réponse à l’IFN- γ GAS (Gamma-activated sequence) au niveau du promoteur de ses gènes cibles et régule ainsi leur transcription (Darnell et al., 1994) (Figure 20). En plus de l’IFN-γ, les récepteurs à l’IL-6, à la cytokine LIF (Leukemia inhibitory factor), à l’oncostatine M, à l’IL-10, à la prolactine, etc… ont également été décrits pour activer STAT-1(Campbell et al., 1995; David et al., 1994; Vignais et al., 1996).

Table des matières

Introduction Bibliographique
Les peptides antimicrobiens
I. Structure et classification des peptides antimicrobiens
1. Les peptides linéaires formant des hélices α
2. Les peptides à ponts disulfure
3. Les peptides linéaires riches en certains acides aminés
II. Les peptides antimicrobiens produits par les insectes
1. Généralités sur les peptides antimicrobiens d’insectes
2. Les peptides antimicrobiens issus du venin de fourmis
3. Les peptides antimicrobiens produits par la fourmi Tetramorium bicarinatum
III. Mécanismes d’action des peptides antimicrobiens cationiques
1. Modèle de déstabilisation en tapis ou Carpet-like model
2. Modèle des pores toroïdaux ou Wormhole model
3. Modèle de pores en douve de tonneaux ou Barrel-stave model
4. Cibles intracellulaires des peptides antimicrobiens
a) Inhibition de la synthèse du peptidoglycane
b) Inhibition de la synthèse protéique bactérienne
IV. Mécanismes de résistance aux peptides antimicrobiens
Les macrophages
I. Origine et différenciation
II. Propriétés fonctionnelles des macrophages
1. La phagocytose
2. Les intermédiaires réactifs de l’oxygène (IROs)
3. Cytokines/chimiokines
a) Les cytokines
b) L’inflammasome
c) Les chimiokines
4. Eicosanoïdes
a) La voie des cyclooxygénases
b) La voie des lipoxygénases
III. Polarisation des macrophages
1. Les macrophages M1
a) Caractéristiques phénotypiques
b) Récepteurs exprimés à la surface des macrophages M1
i. Les récepteurs Toll-like (TLRs)
ii. Les récepteurs reconnaissant les pathogènes opsonisés
c) Facteurs de transcription impliqués dans la polarisation M1 des macrophages
i. STAT-1
ii. IRF5
iii. NF-κB
2. Les macrophages M2
a) Caractéristiques phénotypiques
b) Les différents sous-types de macrophages M2
i. Macrophages M2a
ii. Macrophages M2b
iii. Macrophages M2c
iv. Macrophages M2d
c) Récepteurs exprimés à la surface des macrophages M2
i. Les récepteurs scavenger
ii. Les récepteurs lectine de type C (CLRs)
d) Facteurs de transcription impliqués dans la polarisation M2 des macrophages
i. STAT-6
ii. PPARγ
iii. LRH-1
e) Rôle des macrophages M2 dans la réponse à Candida albicans
i. Reconnaissance et élimination de C. albicans par les macrophages
ii. Polarisation des macrophages en réponse à C. albicans
Rôle des peptides antimicrobiens dans l’immuno-modulation
I. Modulation de la défense immune innée par les PAMs
1. Effets des PAMs sur la production de cytokines/chimiokines par les cellules immunitaires innées
2. Effet des PAMs sur le chimiotactisme
3. Effet des PAMs sur la modulation de la réponse inflammatoire et la réponse antiinfectieuse
a) Contrôle de la réponse inflammatoire
b) Contrôle de la réponse anti-infectieuse
II. Modulation de la défense immune adaptative par les PAMs
III. Mécanismes d’action
IV. Implication des PAMs dans les pathologies
Résultats
Conclusion générale Et perspectives
Références

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