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Biologie
Habitat
Le plasmodium est un parasite intracellulaire retrouvé chez l’homme au niveau du foie, du sang, dans d’autres organes. Chez l’anophèle on le retrouve au niveau intestinal, au niveau de la trompe. (cf. cycle évolutif)
Cycle évolutif
Le cycle évolutif des plasmodiums est très complexe. En effet, les plasmodiums sont des parasites dixènes dont la maturation et la multiplication exige un hôte vertébré (l’homme) chez qui se déroule la phase asexuée ou schizogonie et un hôte invertébré (l’anophèle femelle) pour la multiplication sexuée ou sporogonie.
• Chez l’homme
Le cycle asexué commence par la piqûre de l’homme par l’anophèle femelle infestée, qui injecte avec sa salive des milliers de sporozoides fusiformes.
Ces sporozoites disparaissent du sang en une demi-heure et envahissent les cellules hépatiques ou va se dérouler la schizogonie tissulaire ou phase exo érythrocytaire (figure1).
Dans l’hépatocyte, le sporozoite se transforme en trophozoite .Après une à trois semaines, le trophozoite qui a augmenté de taille, va subir une série de divisions nucléaires et les noyaux fils vont se répartir uniformément dans la cellule pour donner un schizonte ou « corps bleu ».
L’éclatement de ce schizonte libère de nombreux mérozoites qui passent dans la circulation sanguine, amorçant la schizogonie érythrocytaire ou phase érythrocytaire.
Le mérozoite de provenance hépatique, pénètre dans une hématie et prend une forme annulaire donnant ainsi le trophozoite jeune. Il augmente de taille et après plusieurs divisions nucléaires, devient un schizonte mure ou « corps de rosace ».
Le schizonte mure éclate et libère les mérozoites qui envahissent immédiatement de nouvelles hématies et y effectuent un nouveau cycle schizogonique.
L’éclatement du corps de rosace est contemporain à l’accès fébrile et chaque schizogonie érythrocytaire dure quarante huit heures (48h) pour Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax et Plasmodium ovalé et soixante douze heures (72h) pour Plasmodium malariae.
A la suite de plusieurs cycles érythrocytaires, certains mérozoites vont se différencier en éléments sexués appelés gamétocytes male et femelle ; ceux-ci ne pouvant poursuivre leur évolution que chez l’anophèle.
• Chez le moustique
En prenant un repas sanguin chez un sujet infesté, le moustique absorbe les différents stades du parasite. Les éléments asexués sont digérés tandis que les gamétocytes poursuivent leur évolution.
Dans la lumière intestinale du moustique, le gamétocyte femelle expulse son corpuscule chromatinien et devient macrogaméte haploïde et immobile.
Au même moment, le gamétocyte male subit plusieurs divisions nucléaires très rapides pour donner huit (8) noyaux fils qui vont se détacher avec leur prolongement cytoplasmique et donner des microgamètes mobiles qui vont aller à la rencontre du macrogaméte.
L’un des microgamètes pénètre dans le macrogamète, les deux noyaux fusionnent et donnent un œuf diploïde mobile appelé ookinète. Ce dernier traverse la paroi gastrique du moustique pour devenir un kyste nommé oocyste, à l’intérieur duquel se forment les sporozoites.
Libérés par l’éclatement de l’oocyste mur, les sporozoites migrent préférentiellement vers les glandes salivaires de l’anophèle femelle et seront inoculés à l’homme lors d’une piqûre infectante. Le cycle sporogonique dure dix (10) à quarante (40) jours en fonction de la température et de l’espèce plasmodiale en cause.
Caractères culturaux
Tragger et Jansen en 1976 ont pu cultiver les plasmodies à partir des milieux spécifiques : RPMI auquel on ajoute un tampon HEPES, de l’hypoxanthine, de la soude, de la gentamicine, du bicarbonate de sodium à 3,6%, du sérum humain frais à 15%, et du sang du groupe O. Le tout est ramené à un ph à 6.75.
L’incubation se fait à 37°C en atmosphère gazeuse (N2 :93%, CO2 : 4%, O2 : 3%), pendant 48 à 72 h.
Grâce à cette culture on peut préparer des antigènes pour réaliser les études de chimiosensibilité in vitro.
Caractères antigéniques
A la surface de la membrane, on note des structures englobées dans une épaisseur de 20 nm formant une couche dense, compacte et fibrillaire. Ces structures interviennent dans l’invasion parasitaire à l’intérieur du globule rouge. Le mécanisme réel d’intervention de ces structures n’est pas bien compris jusqu’à présent. On pense qu’elles jouent un rôle important dans l’interaction entre le parasite et les récepteurs du globule rouge dans l’attachement initial du mérozoïte. Ces structures sont : les mérozoïtes surfaces protéines (MSP) avec MSP-1, MSP-2, MSP-3 et MSP-4. Le MSP-1 est le premier qui intervient dans l’attachement du mérozoïte. Au niveau des micronèmes existent des erythrocytes-binding proteins (EBA- 175) de 175 Kda. Au moment de l’invasion des globules rouges, des granules denses sont observés : ce sont les Ring-infected Erythrocytes Surface Antigen (RESA), avec une taille de 155 Kda. Enfin on note la présence de Serine Repeat Antigen (SERA) de 113 à 126 kDa qui interviennent dans le transfert de substances du cytoplasme du mérozoïte vers la surface du globule rouge. L’Histidine Rich Protein (HRP-1 et HRP-2) est également retrouvé à la surface de la membrane du mérozoïte.
Le vecteur
Le vecteur connu du paludisme est l’anophèle femelle qui est un arthropode appartenant :
• à l’ordre des Diptères
• à la sous ordre des Nématocères
• à la famille des Culicidae
• à la sous famille des Anophèlinae
• au genre Anophèles
Il existe environ 400 espèces décrites, dont près de soixante sont vectrices du paludisme.
Au Sénégal on retrouve uniquement Anophèles funestus et Anophèles gambiae.
Les anophèles passent au cours de leur vie par quatre stades successifs : œuf, larve, nymphe et imago ou adulte. Les trois premiers sont aquatiques tandis que l’adulte à une vie aérienne.
La durée de vie de l’anophèle est d’environ trois à cinq semaines et seules les femelles sont hématophages. Les anophèles fécondées doivent effectuées un ou deux repas sanguins pour permettre la maturation des œufs qu’elles déposent par grappes dans les collections d’eau. Les gîtes larvaires sont variables selon les espèces.
Les modes de transmission
Le principal mode de contamination est la piqûre de l’homme par l’anophèle femelle infesté. Cependant il en existe d’autres très rares en zone d’endémie, que sont :
• la transmission matérno-fœtale par voie transplacentaire
• la transmission par transfusion de sang parasité.
Les facteurs favorisant la transmission
La température, l’eau, l’humidité et les phénomènes anthropiques constituent les facteurs entraînant la transmission.
Immunologie
Les facteurs immunitaires impliqués dans le paludisme sont divers, complexes et mal connus. Il existe une résistance innée de l’homme vis à vis de certains plasmodii et une résistance acquise d’origine immunologique. Des phénomènes d’origine auto-immune et d’immunodépression semblent également jouer un rôle.
Résistance innée
L’homme est spontanément résistant au paludisme des animaux ; de même certains sujets sont résistants à certains plasmodiums humains. Les mécanismes de cette résistance sont d’origine génétique non immunologique et font intervenir des facteurs érythrocytaires membranaires et intracellulaires :
• les sujets du groupe sanguin Duffy négatif sont résistants à l’infection à Plasmodium vivax.
En effet, les antigènes de ce groupe sanguin sont associés à des récepteurs spécifiques pour l’adhésion et la pénétration des mérozoïtes de Plasmodium vivax. Cela pourrait expliquer la rareté du paludisme à Plasmodium vivax chez les noirs africains et américains qui appartiennent toujours au groupe sanguin Duffy négatif (génotype FyFy) ;
• une anomalie de membrane du globule rouge, l’ovalocytose, réduit l’invasion de l’hématie par Plasmodium falciparum. Ce phénomène a été étudié en Papouasie-Nouvelle-Guinée où il existe une association géographique entre le paludisme et cette affection génétique ;
• la présence de l’hémoglobine fœtale dans les hématies retarde la croissance de Plasmodium falciparum ;
• l’influence de l’hémoglobine S est toujours admise comme facteur protecteur. Cependant, elle reste sujette à quelques controverses ;
• la protection conférée par le déficit en G6PD a été remise en question par les travaux de Martin en 1994. Il a montré in vitro que le parasite se développe bien dans les hématies déficientes en G6PD, en l’absence de stress oxydant.
• HILL, en 1991 en Gambie, a montré que des antigènes du système HLA intervenaient dans la résistance de l’individu au parasite.
La résistance acquise
L’immunité acquise au cours du paludisme est différente de ce qu’elle est habituellement dans les autres maladies infectieuses.
En effet, il ne s’agit pas d’une immunité totale, stérilisante et protectrice, mais d’une immunité incomplète, transitoire, n’empêchant pas les ré – infestations. Ce qui lui a valu d’être dénommée « PREMUNITION ». Elle joue un grand rôle en zone d’endémie où elle limite la gravité du paludisme et le risque de complications mortelles.
Cette immunité est longue à s’installer (au Sénégal, il faut dix à quinze ans) et facile à s’effondrer un à deux ans, dés que l’on quitte la zone infestée. Les anticorps anti-plasmodium apparaissent rapidement après l’infestation. Le taux des immunoglobulines M (IgM) s’élève dés le 3ème jour et s’abaisse à partir du 20ème jour, puis apparaissent les immunoglobulines G (IgG) qui persistent tardivement.
Une partie seulement de ces immunoglobulines, notamment les IgG représentent des anticorps protecteurs spécifiques.
Au cours du paludisme, on peut noter la présence de complexes immuns dans le sang, mais aussi une cryoglobulinémie et une baisse du complément sérique.
L’immunité cellulaire résulte surtout de l’action des macrophages, des lymphocytes et de la rate.
Le plasmodium aurait des propriétés immunosuppressives en inhibant, en période de transmission intense, la réponse lympho-proliférative de l’hôte.
Répartition géographique
Le paludisme sévit dans pratiquement toutes les zones intertropicales et existe encore dans plusieurs zones subtropicales ou même tempérées (figure2).
En effet, l’intensification des voyages internationaux augmente le nombre de cas importés, ce qui pourrait réintroduire le paludisme dans des zones actuellement indemnes. L’Europe connaît des cas de paludisme dits d’importation.
Le paludisme est pratiquement inexistant à une altitude supérieure à 2000 mètres. Il recouvre en fait « la ceinture de pauvreté du monde » c’est-à-dire concerne actuellement plus de cent pays essentiellement les plus pauvres d’Afrique, d’Asie, d’Amérique du sud et du centre.
Plasmodium falciparum ne se trouve qu’en zone inter tropicale, Plasmodium vivax est retrouvé en Afrique du nord, à Madagascar, en Asie et en Amérique du sud, alors que le Plasmodium ovale est surtout localisé en Afrique centrale et Plasmodium malariae existe partout mais en faible quantité.
Le paludisme sévit à l’état endémique partout où les conditions climatiques du milieu permettent l’implantation de l’anophèle et l’accomplissement de son cycle de reproduction. Les cas récemment découverts dans les pays où le paludisme a été éradiqué sont le fruit du paludisme d’importation et des aéroports du fait du nombre de plus en plus important des déplacements vers les pays tropicaux.
Au Sénégal, le paludisme sévit à l’état endémique avec une recrudescence saisonnière. L’essentiel de la transmission s’effectue au cours de la saison des pluies et en début de saison sèche, période favorable au développement des espèces vectrices.
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DU PALUDISME
Diagnostic direct
Il permet de faire un diagnostic de certitude de la présence de la maladie. Il repose sur la mise en évidence du parasite dans le sang en utilisant les techniques suivantes:
La goutte épaisse
C’est la technique de concentration la plus ancienne. Elle concentre de 7 à 20 fois par rapport au frottis mince et reste considérée comme la technique de référence par l’OMS. Elle se prépare par étalement d’une goutte de sang, d’un diamètre d’environ 1 cm, au milieu d’une lame porte objet en effectuant des mouvements en spiral à l’aide du coin d’une autre lame du meme type. Après séchage pendant quelques heures, une deshémoglobinisation à l’eau et une coloration au May Grunwald Giemsa sont effectuées. L’examen microscopique permet de détecter les trophozoites qui apparaissent avec un contour cytoplasmique bleu et une chromatine rouge foncé. La parasitémie peut être estimée en rapportant le nombre de parasites observés au nombre de leucocytes dénombrés sur un hémogramme pratiqué simultanément.
Le frottis sanguin
Il se réalise facilement et ne nécessite pas de matériel particulier. Après séchage d’environ 10 à 15 minutes, une goutte de sang est étalée sur la lame de verre, fixée à l’alcool méthylique, puis colorée au May Grunwald Giemsa. Le seuil de détection est de l’ordre de 200 parasites par mm3 par l’examen de cent champs microscopiques. Les hématies se colorent en rouge rosé, les trophozoites ont un cytoplasme coloré en bleu et les chromatines en rouge foncé. Le diagnostic d’espèces se fait en fonction des critères morphologiques des parasites.
La quantification parasitaire en pourcentage d’hématies parasitées est classique : on considère que sur une zone bien étalée, on a environ 200 hématies au grossissement x 1000
La PCR (Polymerase Chain Reaction)
C’est un processus d’amplification de l’ADN parasitaire mise au point vers les années 1980. Elle conduit au diagnostic pour l’ensemble des espèces plasmodiales. Elle permet également de déceler les résistances et les mutations par le biais du génotypage. Elle est sensible et spécifique.
¾ Principe
Dans la cellule, la duplication a lieu avant la mitose. L’enzyme qui intervient dans cette duplication est l’ADN polymérase. Cette enzyme allonge les chaînes de nucléotides.
Après la séparation des deux brins de la molécule d’ADN (on parle de dénaturation), des fragments d’ADN appelés amorces s’apparient (ou s’hybrident) à leur séquence complémentaire au niveau de chaque brin d’ADN. L’ADN polymérase les allonge par ajout de nucléotides, aboutissant à la formation d’une copie complémentaire de chaque brin d’ADN. On obtient ainsi deux nouvelles molécules identiques à la molécule de départ ; c’est la polymérisation.
La PCR est basée sur ce même principe mais elle utilise deux amorces qui sont sous forme d’ADN simple brin. Elle comporte trois étapes principales qui sont : la dénaturation, l’hybridation et l’extension.
• La dénaturation
C’est l’étape pendant laquelle les deux brins de l’ADN sont séparés par une élévation de la température correspondant à la température de fusion. A ce stade 50% de l’ADN se trouve sous forme de simples brins. En fait, plus la température est élevée, plus le nombre de molécules d’ADN simples brins
augmente. Cette température peut aller jusqu’à 97°C. Cette étape dure 15 à 30 secondes en fonction de la longueur de la séquence.
• L’hybridation
C’est la seconde étape et a lieu lors du refroidissement avec la baisse de la température de la réaction. Les amorces s’hybrident à leurs séquences complémentaires sur l’ADN cible. La température d’hybridation varie entre 50 et 72°C. Cette étape dépend également de la séquence et du nombre de nucléotides de l’amorce.
• L’extension
C’est la dernière étape. Chaque amorce fixée sur l’un des deux brins va s’étendre à partir de son extrémité 5’ par une succession de nucléotides par le biais de l’ADN polymérase. L’extension des deux amorces se fait en sens opposé en incluant la séquence à amplifier. La température portée à 72°C permet à l’ADN polymérase thermostable, d’effectuer une synthèse plus rapide.
Ces trois étapes sont répétées 35 à 40 fois selon de la quantité d’ADN de départ.
¾ Détection et analyse des produits de la PCR
• L’électrophorèse
L’électrophorèse est la migration de particules chargées sous l’influence d’un champ électrique. Dans un milieu liquide, les acides nucléiques se déplacent à la même vitesse donc ils peuvent y être séparés qu’en fonction de leur taille. Les milieux utilisés sont ceux qui freinent les molécules en fonction de leur taille, c’est le cas des gels. En PCR, les fragments obtenus sont analysés sur gels d’agarose ou d’acryline.
• La révélation des produits de la PCR
Les produits de PCR sont décelés après marquage. Les méthodes de marquage les plus sensibles sont celles qui utilisent soit du bromure d’éthidium (BET), soit du nitrate d’argent (AgNO3), soit des radio-isotopes.
• La détermination de la taille des fragments
Elle se fait par l’introduction d’un marqueur de taille (ou de poids moléculaire) que l’on fait migrer en même temps que les échantillons. Le marqueur permet de connaître la taille des différents fragments obtenus.
Le QBC (Quantitative Buffy Coast)
C’est la méthode de diagnostic utilisant la coloration des acides nucléiques par l’acridine orange La lecture est rapide, environ 3 à 5 minutes et le seuil de détection est identique à celui de la goutte épaisse.
Cette technique ne permet pas le diagnostic d’espèces ni le calcul de la parasitémie.
La sonde à ADN
Elle permet de reconnaître dans un prélèvement de sang, des fragments du génome du parasite soupçonné à l’aide de sondes marquées au phosphore radioactif P32.
Diagnostic indirect
Méthodes sérologiques
Ce sont des méthodes immunologiques. La présence de Plasmodiumdans le sang provoque la formation d’anticorps dirigés contre les antigènes du parasite. On peut ainsi titrer le complexe antigène- anticorps.
Les différentes techniques utilisées sont :
. l’immunofluorescence indirecte;
. l’immunoélectrophorèse;
. l’immuno-enzymologie (ELISA);
. l’hémagglutination, l’immuno-diffusion.
Ces analyses sont surtout utiles dans le diagnostic rétrospectif d’une fièvre tropicale, dans la prévention du paludisme post transfusionnel, dans les enquêtes épidémiologiques et le suivi des anticorps après un accès aigu.
Ces dernières années de nouvelles techniques fondées sur les tests immuno-chromatographiques du sang complet ont été développées pour le diagnostic rapide du paludisme.
C’est ainsi que l’on distingue :
• les tests recherchant l’antigène HRP-2 (Histidin Rich Protein 2)
Ils permettent la mise en évidence de l’antigène HRP2 libéré spécifiquement par P. falciparum dans le sang des malades. Il s’agit de kits très sensibles (Parachek®, Parasight®, Core Malaria®). Ils ne permettent pas d’apprécier la parasitémie. Ils présentent une bonne capacité de détection, même dans les cas des parasitémies faibles avec examen microscopique négatif.
Test unitaire, sa réalisation et sa lecture ne nécessite aucun appareillage. Après hémolyse et absorption par capillarité sur une bandelette de nitrocellulose de l’échantillon sanguin, l’HRP2 est détecté par adjonction d’un anticorps monoclonal. La sensibilité est de l’ordre de 95 à 98 %. En raison de la persistance de l’antigénémie pendant parfois plus d’une semaine, ces tests peuvent rester positifs après disparition de la parasitémie. Cette particularité peut permettre le diagnostic rétrospectif d’accès palustres en cas de traitement présomptif effectué à l’aveugle.
• le test de détection de la Lactico déshydrogénase plasmodiale
La pLDH (Plasmodium Lactico déshydrogénase) est une enzyme glycolytique soluble exprimée à des niveaux élevés aux stades asexués des parasites du paludisme. Elle est trouvée chez chacune des quatre espèces humaines de Plasmodium.
Désordres biologiques non spécifiques
• Une anémie hémolytique est présente dans tous les cas de paludisme, anémie normocytaire le plus souvent normochrome, parfois hypochrome.
• Une thrombopénie est presque toujours observée.
• La fonction hépatique est souvent altérée de même que la fonction rénale.
TRAITEMENT
Les médicaments antipaludiques
Ils peuvent être classés en deux grands groupes :
– les schizonticides ;
– les gamétocytocides.
Les schizonticides
Ils sont actifs contre les schizontes intra-globulaires et sont utilisés pour traiter ou prévenir un accès palustre. Cependant ils ont peu ou pas d’action sur les gamétocytes. Ils sont subdivisés en deux (2) groupes selon leur mode d’action :
– les schizonticides sanguins électifs, d’action rapide qui se concentrent fortement dans les hématies parasitées pour agir au niveau du noyau de l’hématozoaire (Quinine, Artémisinine et dérivés, Chloroquine, Amodiaquine, Halofantrine, Méfloquine) ;
– les schizonticides d’action lente qui inhibent la croissance du parasite en bloquant la division de son noyau.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : RAPPELS
1. DEFINITION
2. EPIDEMIOLOGIE
2.1/ Les agents pathogènes
2.1.1/ Classification
2.1.2/ Morphologie
2.1.3/ Biologie
2.1.3.1/ Habitat
2.1.3.2/ Cycle évolutif
2.1.3.3/ Caractères culturaux
2.1.3.4/ Caractères antigéniques
2.2/ Le vecteur
2.3/ Les modes de transmission
2.4/ Facteurs favorisant la transmission
2.5/ Immunologie
2.5.1/ Résistance innée
2.5.2/ Résistance acquise
2.6/ Répartition géographique
3. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
3.1/ Diagnostic direct
3.1.1/ La goutte épaisse
3.1.2/ Le frottis sanguin
3.1.3/ La PCR
3.1.4/ Le QBC
3.1.5/ La sonde à ADN
3.2/ Diagnostic indirect
3.2.1/ Méthodes sérologiques
3.2.2/ Désordres biologiques non spécifiques
4.1/ Les médicaments antipaludiques
4.1.1/ Les schizonticides
4.1.1.1/ Les schizonticides naturels
4.1.1.2/ Les schizonticides de synthèse
4.1.1.3/ Les associations schizonticides
4.1.2/ Les antibiotiques
4.1.3/ Les gamétocytocides
4.2/ Les nouvelles recommandations thérapeutiques / PNLP
4.2.1/ Contexte de justification
4.2.2/ Principes directeurs sur le traitement antipaludique
4.2.2.1/ Buts
4.2.2.2/ Instruction pour l’application des protocoles de traitement
4.2.3/ Directives relatives au traitement du paludisme simple
4.2.3.1/ Principe
4.2.3.2/ Cibles
4.2.3.3/ Cas particulier de la femme enceinte
4.2.3.4/ Présentation
4.2.3.5/ Posologie
4.2.3.6/ Alternative
4.2.4/ Directives relatives au traitement du paludisme grave
4.3/ La chimioprophylaxie du paludisme
5. LA CHIMIORESISTANCE DE P.falciparum
5.1/ Définition
5.2/ Mécanismes
5.2.1/ Nature de la résistance
5.2.2/ Apparition
5.2.3/ Propagation
5.3/ Facteurs favorisant
5.4/ Méthodes d’évaluation
5.4.1.1/ Anciennes méthodes
5.4.1.2/ Nouvelles méthodes
5.4.2/ Les tests in vivo
5.4.3/ Etudes des marqueurs génétiques de la résistance
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
1. CADRE BIOGEOGRAPHIQUE: LA REGION DE THIES
1.1/ Présentation de la région de Thiès
1.2/ Situation sanitaire à Thiès
1.3/ Endémicité palustre
2. CADRE D4ETUDE: LA SLAP
3. MATERIELS ET METHODES
3.1/ Matériels
3.1.1/ Appareils et supports
3.1.2/ Réactifs
3.2/ Méthodes
3.2.1/ Recrutement des patients
3.2.2/ Prélèvements
3.2.3/ Techniques parasitologiques
3.2.4/ Le DAPI-test
3.2.5/ Techniques de biologie moléculaire : étude du gène pfmdr1
3.2.5.1/ Extraction de l’ADN à partir du papier filtre
3.2.5.2/ Amplification du gène PFMDR1N86Y par la PCR
3.2.5.3/ Digestion enzymatique
3.2.5.4/ Vérification du produit d’amplification de la PCR
3.2.6/ Méthodes statistiques
4. RESULTATS
4.1/ Caractéristiques de la population d’étude
4.1.1/ Répartition de la population selon le sexe
4.1.2/ Répartition de la population en fonction de l’âge
4.1.3/ Répartition selon l’âge et le sexe
4.2/ La parasitémie
4.2.1/ Répartition selon le sexe
4.2.2/ Répartition selon l’âge
4.3/ Résultats de la biologie moléculaire
4.3.1/ Résultats de l’analyse du gène pfMDR1N86Y
4.3.2/ Répartition générale des souches
4.3.3/ Répartition selon l’âge
4.3.4/ Répartition selon le sexe
4.3.5/ Répartition des souches en fonction de la CI50
DISCUSSION
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS
REFFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
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