Les nanoparticules de dioxyde de titane

Les produits cosmétiques sont définis, par l’article L5131-1 du CSP (Code de la santé publique), comme suit : « on entend par produit cosmétique toute substance ou préparation destinée à être mise en contact avec les diverses parties superficielles du corps humain, notamment l’épiderme, les systèmes pileux et capillaire, les ongles […], en vue, exclusivement ou principalement, de les nettoyer, de les parfumer, d’en modifier l’aspect, de les protéger, de les maintenir en bon état ou de corriger les odeurs corporelles. » [1]. L’article L5131-4 du CSP stipule que : « les produits cosmétiques mis sur le marché ne doivent pas nuire à la santé humaine lorsqu’ils sont appliqués dans les conditions normales ou raisonnablement prévisibles d’utilisation compte tenu, notamment, de la présentation du produit, des mentions portées sur l’étiquetage ainsi que de toutes autres informations destinées aux consommateurs. ». Ces produits peuvent, cependant, entraîner des réactions cutanées, comme des allergies, dermatites ou inflammations et les métaux sont souvent incriminés. L’aluminium, par exemple, sous forme saline, est utilisé dans les déodorants, comme anti-transpirant. L’aluminium réduit la sécrétion de sueur en rétrécissant ou en obstruant temporairement les canaux des glandes sudoripares, pour éliminer les mauvaises odeurs, mais peut entraîner des irritations, et il pourrait être lié au cancer du sein [2]. Il appartient à la catégorie des éléments, avec le chrome, ne réagissant pas avec la sueur mais qui peuvent former des ions allergisants [3]. Le cobalt, sous forme de sels ou de micro/nanoparticules (NPs), est fréquemment utilisé comme colorant notamment dans les fards à paupière [4]. L’allergie au cobalt est connue, surtout dans le cas de contact cutané d’origine professionnelle. Il appartient à la catégorie des éléments réagissant avec la sueur et pouvant former des ions allergisants [5]. Ces réactions sont causées par la possible pénétration de ces métaux dans la peau [6,7], car l’âge, l’exposition au soleil, les maladies et les blessures de la peau peuvent augmenter la pénétration des produits cosmétiques.

Les nanoparticules de dioxyde de titane

Présentation du TiO2

Le titane (Ti) est un métal léger d’aspect blanc métallique , découvert en 1791 par M. Gregor, un minéralogiste amateur anglais. Il n’est pas dangereux pour la santé, ni pour l’environnement sous forme de métal massif car il résiste à la corrosion. Il possède cinq isotopes stables : 46Ti (7,93%), 47Ti (7,28%), 48Ti (73,94%), 49Ti (5,51%) et 50Ti (5,34%) .

Le composé oxygéné du titane le plus utilisé est le dioxyde de titane (TiO2). C’est une poudre cristalline incolore à blanche , constituée de particules (de taille micro ou nanométrique). Ce matériau semi-conducteur possède des propriétés antipollution, autonettoyantes et photo-catalytiques (filtre UV), présente une résistance aux produits chimiques et une stabilité thermique.

Présentation des NPs de TiO2

Les objets nanométriques sont appelés des particules ultrafines dont la taille, qui varie entre 1 et 100 nm, confère des propriétés physico-chimiques, une absorption et une physique de surface différentes, par rapport aux microparticules ou aux matériaux massifs. Leur usage et leur toxicité seraient influencés par la taille, forme (sphérique, allongée, fibreuse…), présence d’une modification de surface (revêtement) et cristallinité de la particule.

Les NPs sont plus réactives que les particules micrométriques à dose équivalente en masse car leur surface spécifique (ratio surface d’échange / taille) est plus élevée. Leur surface d’échange externe est considérablement plus grande, ce qui décuple leurs effets physicochimiques. Une régulation de la taille des particules créées est possible pour différentes propriétés et usages, sous forme nanométrique avec un diamètre entre 1 et 100 nm (comme les P25) .

Les origines des nanoparticules du TiO2 peuvent être :
● Artificielle d’origine anthropique non intentionnelle : produits de combustion, diesel…
● Artificielle d’origine anthropique intentionnelle : carbones, oxydes, céramiques et polymères…

Il existe trois polymorphes naturels principaux du TiO2 . Les deux formes les plus répandues sont rutile et anatase.

La forme rutile  est plus dense et plus stable que la forme anatase . Il a été montré que ces NPs de TiO2 et leur structure diffèrent à l’échelle nanométrique, lors de l’observation au microscope électronique à transmission (MET,) : la phase rutile a une forme en bâtonnets [35,36] alors que la phase anatase a une forme sphérique.

Les formes anatase ou l’association anatase/rutile, sans enrobage sont utilisées pour les dentifrices, médicaments, peintures et ciments ou dans l’alimentaire, alors que les formes rutile ou l’association rutile/anatase, avec enrobage sont utilisées en cosmétique. Dans les crèmes solaires, le TiO2 rutile (10 nm) est souvent enrobé avec de l’hydroxyde d’aluminium (Al(OH)3).

Les voies d’entrées et les risques des NPs de TiO2 sur la santé

Plus les NPs sont petites et plus leurs propriétés inflammatoires, oxydantes et irritantes sont grandes. Les NPs de TiO2 peuvent pénétrer dans des organismes animaux par :
● La voie aérienne sous forme de gouttelettes ou d’aérosols
● La voie digestive
● La voie cutanée (détaillée plus loin) et oculaire.

Les deux chemins de pénétration percutanée (à travers la peau, Figure I.4) sont : transépidermique (intercellulaire et transcellulaire) et transfolliculaire (follicules pileux et les glandes sudoripares) .

Une fois dans l’organisme, les NPs peuvent atteindre la circulation sanguine, ou s’accumuler au niveau des ganglions lymphatiques [12]. Les NPs de TiO2 peuvent entraîner des effets toxiques à long terme comme des effets reprotoxiques, des irritations des muqueuses respiratoires et oculaires. Chez le rat, une surcharge pulmonaire peut entraîner une réaction inflammatoire, des lésions prolifératives, ou encore une cytotoxicité (la cytotoxicité est la propriété d’un agent chimique ou biologique à être toxique pour les cellules, éventuellement jusqu’à les détruire) [34]. De ce fait, le SCCS (Scientific Committee on Consumer Safety) ne recommande pas l’utilisation des crèmes solaires en spray qui pourraient augmenter le risque d’inhalation des NPs de TiO2 .

La toxicité aiguë est faible par ingestion des NPs de TiO2. Elle a été prouvée chez le rat et dans le placenta humain [10,17]. Les particules micro et nanométriques s’accumulent au niveau du foie, de la rate, des poumons et des reins, suite à une translocation (migration des particules à partir de leur site de déposition) circulatoire. Les NPs de TiO2 ne sont pas filtrées dans l’eau ou dans l’air et se répandent dans la nature, il peut y avoir un risque pour l’environnement, les animaux et les plantes .

La peau 

Pour mener cette étude, il nous est apparu pertinent d’appliquer la crème solaire contenant des NPs de TiO2 sur des prélèvements de peau. La peau de cochon peut servir de support biologique car il s’agit de la peau de mammifère dont la physiologie est la plus proche de celle de l’Homme [44]. Cependant elle est plus épaisse [45]. Il existe également des possibilités de mener des études sur des peaux reconstruites (par imprimante 3D), ou des cultures de cellules humaines. Seulement, dans ces deux derniers cas, le matériel est de structure et de physiologies très éloignées de la peau humaine [46]. Nous avons donc opté pour des prélèvements de peau humaine, déchets opératoires d’abdominoplasties.

Le rôle de la peau 

La peau est un organe résistant, souple, qui pèse entre 3,5 à 5 kg et mesure 1,75 à 2 m2 pour un Homme [38,44]. Elle possède une fonction d’échanges (absorption de molécules extérieures grâce à sa perméabilité et d’élimination ou libération grâce à sa production de sueur). Elle capte des informations cognitives et est le siège de perceptions variées telles que la chaleur, le froid, le toucher, la douleur, qu’elle transmet au cerveau, permettant ainsi la défense et l’adaptation au milieu environnant .

Le rôle essentiel de la peau est la protection contre les agressions extérieures qu’elle remplit grâce à ses fonctions « barrières » :
❖ Contre les agressions physiques grâce à ses propriétés mécaniques (résistance, souplesse)
❖ Contre les agressions chimiques grâce aux propriétés d’imperméabilité de la couche cornée au film hydrolipidique de surface
❖ Contre les agressions infectieuses avec la production de défensines (protéines synthétisées impliquées dans la défense immunitaire) et les fonctions immunitaires de la peau
❖ Contre les rayons solaires et la chaleur grâce à la couche cornée et au système mélanocytaire.

Structure de la peau humaine

La peau, dont l’épaisseur varie entre 1 mm au niveau des paupières, à 4 mm au niveau des plantes de pieds, est différente pour chacun et sa réponse dépend de l’âge, de la santé, de la zone du corps humain, etc. Elle est constituée de trois couches avec des caractéristiques physico-chimiques et annexes différentes. De l’intérieur vers l’extérieur de l’organisme, les trois tissus sont : l’hypoderme, le derme et l’épiderme .

L’hypoderme

L’hypoderme est constitué de cellules adipeuses (cellules de graisse) et de lipides. C’est une réserve d’énergie et un isolant thermique. C’est également un tissu conjonctif (occupant les intervalles entre les organes) richement vascularisé, qui sert de protection contre les chocs physiques.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1 PRESENTATION DU SUJET
I. Contexte
II. Les nanoparticules de dioxyde de titane
II.1. Présentation du TiO2
II.2. Présentation des NPs de TiO2
II.3. Les voies d’entrées et les risques des NPs de TiO2 sur la santé
III. La peau
III.1. Le rôle de la peau
III.2. Structure de la peau humaine
III.2.1. L’hypoderme
III.2.2. Le derme
III.2.2.a. Structure du derme
III.2.2.b. Les annexes cutanées
III.2.3. L’épiderme
III.2.3.a. Structure de l’épiderme viable
III.2.3.b. La couche cornée
III.3. Les réactions cutanées
III.3.1. Les réactions allergiques
III.3.2. Réactions face au soleil
III.3.3. Présentation de la crème solaire
IV. Etude de la pénétration des NPs de TiO2 dans la peau
IV.1. Les différents instruments utilisés pour l’étude de la pénétration des NPs dans la peau
IV.2. La corrélation d’instruments d’identification et / ou localisation des NPs
V. Objectifs de la thèse
CHAPITRE 2 PRESENTATION DES OUTILS D’ANALYSE
I. Présentation des instruments
I.1. La microscopie électronique
I.1.1. Le MEB
I.1.2. Le MET
I.1.2.a. Source d’électrons
I.1.2.b. Chambre échantillon
I.1.2.c. Diaphragmes et lentilles
I.1.2.d. Formation du contraste et de l’image
i. La diffraction
ii. Champ clair et champ sombre
I.1.2.e. Fonctionnement du STEM
I.1.3. Méthode d’analyse EDS en MET
I.1.4. Les contraintes de l’échantillon en MET
I.2. Le NanoSIMS
I.2.1. Généralités sur le SIMS
I.2.2. Fonctionnement du NanoSIMS
I.2.2.a. L’optique primaire
i. Choix de la source
ii. La colonne primaire I
iii. La colonne primaire II
I.2.2.b. La colonne coaxiale
I.2.2.c. Conditions d’analyse de l’échantillon
I.2.2.d. L’optique secondaire
i. La colonne secondaire
ii. Le spectromètre de masse
I.2.2.e. Plusieurs modes d’analyse
i. Sonde défocalisée
ii. Sonde focalisée : mode imagerie
iii. Traitement des données au NanoSIMS
I.2.3. Les contraintes liées à l’échantillon pour l’analyse au NanoSIMS
I.2.4. Utilisation du logiciel SRIM pour calculer l’épaisseur pulvérisée
II. Généralités sur la préparation d’échantillons biologiques
II.1. La fixation
II.2. Choix de la résine
II.3. Réalisation et récupération des coupes d’échantillon
III. Traitement de données images
III.1. Présentation du logiciel ImageJ
III.1.1. Elimination du vignettage
III.1.2. Mesure de la taille de la sonde
III.1.3. Le suréchantillonnage
III.2. Vérification de la corrélation entre les masses O et TiO
III.3. Logiciels utilisés pour la superposition de deux images
III.3.1. ImageJ en manuel
III.3.2. ICY avec le plugin EC-CLEM
III.3.3. Plugin Fijiyama d’ImageJ
III.3.4. MoDaT
III.3.5. Comparaison de l’image de référence avec l’image transformée
III.3.6. Méthode de la pyramide laplacienne
III.4. Présentation de MATLAB
III.5. Présentation du logiciel GPM 3D Soft
CHAPITRE 3 MISE AU POINT DE LA CORRELATION MET/NANOSIMS SUR UN ECHANTILLON MODELE DE CREME SOLAIRE
I. Préparation des échantillons modèles
I.1. Stratégie générale
I.2. Réalisation et récupération des coupes d’échantillon
I.2.1. Généralités
I.2.2. Réalisation de coupes semi-fines pour une analyse au MEB et NanoSIMS sur plot de silicium
I.2.3. Réalisation de coupes ultrafines pour une analyse au MEB, MET et NanoSIMS
I.3. Choix des conditions d’analyse sur les différents instruments
I.3.1. Jeol JEM 2010
I.3.2. Jeol ARM 200F
I.3.3. NanoSIMS
II. Identification et caractérisation des NPs de TiO2 dans la crème solaire
II.1. Recherche du TiO2 dans la crème solaire en MEB/EDS
II.2. Identification par DRX de la phase cristalline des NPs, contenues dans la crème solaire
II.3. Analyse NanoSIMS d’une coupe semi-fine de crème solaire en résine sur plot de Si
II.3.1. Sélection de la masse 48Ti16O au NanoSIMS
II.3.2. Analyse des isotopes naturels du titane au NanoSIMS
II.3.3. Calcul de l’épaisseur pulvérisée
II.4. Analyse en MET des NPs contenues dans les coupes de crème solaire en résine
II.4.1. Repérage de la zone d’intérêt au MEB
II.4.2. Caractérisation et identification des NPs en MET puis NanoSIMS
II.5. Vérification de la colocalisation de 16O et 48Ti16O
II.5.1. Vers une analyse des particules isolées à l’aide du STEM couplé à l’EDS
II.5.2. Détermination de l’ordre d’analyse : MET puis NanoSIMS
III. Corrélation des images MET et NanoSIMS
III.1. Présentation des images supports pour la corrélation
III.2. Elimination du vignettage de l’image MET
III.3. Superposition des images MET et NanoSIMS avec le logiciel MoDaT
III.3.1. Présentation des images superposées avec MoDaT
III.3.2. Effet du seuil sur l’interprétation de la superposition
III.3.3. Comparaison de l’image MET et de l’image NanoSIMS modifiée par MoDaT
III.4. Comparaison des résultats de MoDaT avec les résultats obtenus avec d’autres logiciels et discussion associée
III.5. Méthode de la pyramide laplacienne
IV. Vers une reconstruction 3D de la zone analysée au NanoSIMS
V. Discussion
CHAPITRE 4 CORRELATION MET/NANOSIMS APPLIQUEE A LA PEAU
I. Préparation de la peau en résine
I.1. Provenance de la peau
I.2. Application de la crème sur la peau
I.3. Protocole de cryofixation et inclusion en résine des prélèvements de peau par HPF/AFS
I.3.1. Cryofixation des prélèvements de peau
I.3.2. Déshydratation, inclusion en résine et polymérisation en moule par AFS
I.4. Réalisation et récupération des coupes d’échantillons
I.4.1. Réalisation de coupes semi-fines pour une observation au microscope optique
I.4.2. Coloration des coupes de peau
I.5. Contrôle de la qualité de la préparation au microscope optique
I.5.1. Coupes ultrafines pour une analyse au MEB, MET puis NanoSIMS
I.5.2. Post-contraste des coupes ultrafines
I.6. Choix des conditions d’analyse sur les différents instruments
II. Justification de l’utilisation de la même coupe plutôt que de deux coupes sériées
III. Corrélation MET/NanoSIMS appliquée aux analyses de coupes de peau
III.1. Présentation d’images de coupes de peau au MET et au NanoSIMS
III.2. Superposition de l’image MET et de l’image NanoSIMS avec le logiciel MoDaT
III.3. L’analyse des coupes en EDS, sans STEM
III.4. Moyens pour localiser les NPs (ou agrégats) dans la matrice biologique
IV. Reconstruction 3D de la zone analysée au NanoSIMS
V. Discussion
CONCLUSION GENERALE

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