Les modèles murins transgéniques

Les lignées de souris transgéniques pour un récepteur à l’antigène des LT (TCR)

Le développement des techniques de clonage de LT et de transgénèse a permis la génération de lignées de souris exprimant un TCR spécifique d’un peptide d’une protéine de la myéline à la surface d’une large proportion de leurs LT. Ces lignées constituent, d’une part, des sources aisément manipulables de LT auto-réactifs, relativement homogènes et de spécificité connue, qui pourront être utilisés dans des expériences d’induction d’EAE par transfert adoptif. D’autre part, l’activation spontanée ou induite des LT exprimant le TCR transgénique, spécifique d’un auto-antigène myélinique donc auto-réactifs chez ces animaux, génère des modèles de maladie auto-immune ciblant la myéline. Par exemple, Waldner et al. (2000) ont généré une lignée de souris transgénique appelée « PLP-TCR », en introduisant par transgénèse les chaînes α et β du TCR d’un clone de LT CD4+ spécifique du complexe I-As:PLP139-151. Lorsque ces animaux sont élevés dans des conditions exemptes d’organismes pathogènes spécifiques (EOPS), environ 40% d’entre eux développent une EAE spontanée sévère dès l’âge de 6 semaines. Ces modèles offrent ainsi l’opportunité d’étudier, sur une population auto réactive et encéphalitogène artificiellement amplifiée, les conditions de rupture de la tolérance immune vis-à-vis d’auto-antigènes spécifiques du SNC. En effet, on retrouve dans le sang de patients atteints de SEP et des individus sains, des LT auto-réactifs capables de proliférer et de se différencier en cellules effectrices en réponse à une stimulation par des antigènes de la myéline.

Cependant, les contextes génétiques et environnementaux et les états pathologiques, dans lesquels ces LT potentiellement pathogènes peuvent être activés restent à caractériser. Par exemple, Goverman et al. (1993) ont généré une lignée de souris transgéniques pour un TCR spécifique du complexe I-Au:MBP1-11. Le pourcentage de souris de cette lignée développant une EAE spontanée est faible lorsqu’elles sont maintenues dans des conditions EOPS, mais augmente très significativement lorsqu’elles sont élevées en animalerie conventionnelle, suggérant un rôle de la charge microbienne environnante dans la rupture de la tolérance au soi. Ces modèles permettent également d’étudier les mécanismes physiologiques de contrôle des populations de LT auto-réactifs. En utilisant une seconde lignée de souris TCR transgénique exprimant un TCR spécifique du peptide MBP1-11 et restreint par I-Au, Olivares-Villagomez et al. (1998) ont mis en évidence l’existence d’une population de LT CD4+ exprimant des TCR composés de chaînes α et β endogènes (par opposition aux réarrangements imposés par transgénèse) capable de protéger les souris de l’EAE.

En effet, une EAE spontanée survient chez 100% de ces souris lorsqu’elles n’expriment que le TCR transgénique auto-réactif, alors que la fréquence d’apparition de la maladie est réduite à 14% lorsque ces souris sont capables de produire des LT CD4+ d’autres spécificités. Enfin, les animaux TCR transgéniques permettent de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, telles que celles basées sur l’élimination sélective d’une population de LT auto-réactifs de spécificité connue au cours d’une maladie auto-immune.

Les lignées de souris transgéniques exprimant un « néo » auto-antigène

Une autre approche consiste à créer des animaux exprimant par transgénèse une protéine exogène sous le contrôle du promoteur d’une protéine spécifique du SNC. Dans les types cellulaires où il est naturellement actif, le promoteur conduit à l’expression du transgène. Ces animaux permettent d’étudier les mécanismes d’induction de la tolérance au soi et les conditions de rupture de cet état de tolérance. Par exemple, des souris exprimant une protéine du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) sous contrôle du promoteur d’une protéine de la myéline ont été générées. Ces animaux ne développent pas de maladie auto immune spontanée bien que des LT spécifiques du « néo » auto-antigène soient retrouvés dans le sang. L’infection de ces animaux avec le LCMV induit une réponse immune qui élimine le virus et, après la clairance du virus, les animaux développent une atteinte inflammatoire asymptomatique du SNC. Une seconde infection avec le LCMV induit l’exacerbation de l’atteinte neurologique avec apparition de symptômes et développement de lésions de démyélinisation. De plus, lorsque la seconde infection est réalisée avec un autre virus exprimant des épitopes capables d’induire l’activation croisée de LT spécifiques du LCMV, les animaux développent également cette maladie neurologique sévère (Evans et al., 1996).

Ce modèle a ainsi permis de tester l’hypothèse selon laquelle une atteinte auto-immune du SNC peut être induite à la suite d’une infection par un virus exprimant un épitope présentant des similitudes structurelles avec un épitope du soi (phénomène de mimétisme moléculaire).

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Table des matières

Introduction
1 Etude bibliographique
1.1 Le système immunitaire spécifique: tolérance au soi et maladies auto-immunes
1.2 Les maladies inflammatoires démyélinisantes chez l’homme, la sclérose en plaques
1.3 Les modèles animaux d’affections auto-immunes du système nerveux central
1.3.1 L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) par immunisation active
1.3.1.1 Description
1.3.1.2 Les protéines de la myéline
1.3.1.3 L’immunopathologie de l’EAE
1.3.2 L’EAE par transfert adoptif de lymphocytes T
1.3.3 Les modèles murins transgéniques
1.3.3.1 Les lignées de souris transgéniques pour un récepteur à l’antigène des lymphocytes T
1.3.3.2 Les lignées de souris transgéniques exprimant un « néo » auto-antigène
2 Etude expérimentale
2.1 Génération d’un modèle d’étude du potentiel encéphalitogène de lymphocytes T CD8+ : justification et limites de la stratégie
2.2 Matériel et méthodes
2.2.1 Les lignées de souris transgéniques
2.2.1.1 La lignée GFAP-HA
2.2.1.2 La lignée CL4-TCR
2.2.1.3 Génération des souris double transgéniques GFAP-HA x CL4-TCR
2.2.1.4 Production et conditions d’élevage de ces lignées
2.2.1.5 Identification des animaux transgéniques par génotypage
2.2.1.5.1 Extraction de l’ADN
2.2.1.5.2 Polymerase chain reaction (PCR)
2.2.2 Génération in vitro de lymphocytes T cytotoxiques de type 1 (Tc1) à partir des lymphocytes T CD8+ des souris CL4TCR
2.2.2.1 Culture des Tc1
2.2.2.2 Caractérisation des populations de LT par ELISA et cytométrie en flux
2.2.2.2.1 ELISA
2.2.2.2.2 Cytométrie en flux
2.2.3 Transfert adoptif des lymphocytes cytotoxiques Tc1
2.2.4 Traitement par injection d’anticorps des souriceaux nouveau-nés double transgéniques GFAP-HA x CL4-TCR
2.2.5 Perfusion des animaux pour les études histologiques
2.3 Résultats
2.3.1 Induction chez les souris GFAP-HA adultes d’une atteinte auto-immune dirigée contre les astrocytes par transfert adoptif de lymphocytes T CD8+ activés spécifiques d’HA
2.3.1.1 Phénotype des lymphocytes Tc1 injectés
2.3.1.2 Contrôle du potentiel pathogène des lymphocytes Tc1 injectés
2.3.1.3 Transfert adoptif de 30×106 lymphocytes Tc1 chez les souris GFAP-HA adultes
2.3.1.3.1 Les Tc1 infiltrent le système nerveux central des souris receveuses GFAP-HA
2.3.1.3.2 Les Tc1 induisent la destruction sélective des cellules exprimant l’auto-antigène
2.3.2 Etude du phénotype des animaux double transgéniques GFAP-HA x CL4-TCR
2.3.2.1 Description
2.3.2.2 Origine auto-immune de la maladie développée par les souriceaux double transgéniques GFAP-HA x CL4-TCR
2.3.2.3 Traitement au long cours des souriceaux double transgéniques GFAP-HA x CL4-TCR avec un anticorps monoclonal anti-CD8 déplétant les lymphocytes CD8+ pathogènes
3 Discussion et perspectives
3.1 Potentiel encéphalitogène de lymphocytes T CD8+ spécifiques d’un auto-antigène astrocytaire
3.2 Modèle double transgénique GFAP-HA x CL4-TCR : rôle des cellules gliales entériques dans le maintien de l’intégrité de la paroi intestinale
3.3 Conclusion générale
Conclusion générale