Soutenance mémoire
Les traitements de la maladie de Parkinson
Actuellement, il n’existe aucun traitement curatif de la MP. Les traitements sont uniquement symptomatiques visant à corriger les symptômes moteurs et non moteurs afin d’améliorer le vécu du malade. Il existe plusieurs types de traitements : les traitements pharmacologiques, les traitements chirurgicaux et la prise en charge non médicamenteuse.
Les traitements pharmacologiques
Traitements dopaminergiques
La lévodopa (L-DOPA) est actuellement la molécule la plus efficace contre les troubles moteurs de la MP. Son administration va compenser la diminution de dopamine induite par la déficience dopaminergique et ainsi améliorer les symptômes moteurs. Les patients traités avec la L-DOPA présentent une période d’embellie appelée « lune de miel » qui dure quelques années, en moyenne 8 (Cotzias et al., 1969).
La L-DOPA qui peut traverser la barrière hémato-encéphalique, est transformée, en particulier par les neurones de la voie nigro-striée, en dopamine par une décarboxylase. Une fois absorbée, elle est rapidement décarboxylée mais une petite portion de la dose uniquement va entrer dans le système nerveux central. En périphérie, l’administration de L-DOPA et sa transformation en dopamine va engendrer des effets secondaires tels que des nausées et de l’hypertension artérielle. Ce traitement est donc, en général, couplé à un inhibiteur de la décarboxylase périphérique (carbidopa ou bensérazide) qui ne traverse pas la barrière hématoencéphalique. Ceci permet de diminuer les effets secondaires dus à sa transformation en périphérie tout en augmentant par 10 la disponibilité de la L-DOPA au niveau du système nerveux central.
La L-DOPA réduit les troubles moteurs de la MP mais n’affecte pas les symptômes non moteurs (Cools et al. 2006). Mais après quelques années de traitement, l’organisme est de moins en moins sensible et des complications motrices peuvent survenir telles que des dyskinésies ou des fluctuations motrices (effet « on-off ») qui peuvent être plus handicapantes que la maladie elle-même (Damier et al., 2002 ; Derkinderen et al., 2002). Les dyskinésies vont apparaître chez 30 à 50 % des patients après 5 ans de traitement et chez 90 % des patients après 10 ans. Les principaux facteurs de survenue des dyskinésies sont un âge de début de la maladie précoce, une dénervation dopaminergique nigrostriatale importante, la durée du traitement et l’augmentation de la dose de L-DOPA (Fahn et al., 2000).
D’autres médicaments ont été développés pour prolonger l’effet thérapeutique de la LDOPA en inhibant les enzymes participant à sa dégradation. L’utilisation des inhibiteurs de la MAO va permettre de réduire les symptômes en inhibant la dégradation de la dopamine secrétée par les neurones. Les inhibiteurs de la Catéchol-O-Méthyl Transférase (COMT) sont actuellement développés. Ils agissent essentiellement au niveau périphérique (tube digestif, foie et plasma), en inhibant la transformation par la COMT de la L-DOPA en 3-O-méthyldopa (3-OMD), un métabolite inactif présumé antagoniser la pénétration de la L-DOPA dans le cerveau.
Des agonistes dopaminergiques peuvent aussi être utilisés. Ils vont mimer l’effet de la dopamine en stimulant les récepteurs dopaminergiques. Leur activité pharmacologique est indépendante du stock de neurones dopaminergiques fonctionnels puisqu’ils agissent directement sur les récepteurs post-synaptiques qui restent en partie préservés au cours de la maladie cependant ce type de traitement entraîne progressivement une baisse de sensibilité des récepteurs dopaminergiques, les symptômes pouvant alors augmenter.
Les anti-cholinergiques
L’utilisation des médicaments anti-cholinergiques muscariniques a pour but de diminuer l’excès relatif d’acétylcholine dans le striatum afin d’équilibrer les taux de dopamine et d’acétylcholine pour retrouver un fonctionnement normal des ganglions de la base. Leur action centrale anti-parkinsonienne est surtout efficace sur le tremblement de repos, moins sur l’hypertonie et quasiment nulle sur l’akinésie (Olanow et al., 2009).
Actuellement, ils ne sont que très peu utilisés en raison du fort risque d’effets indésirables.
L’amantadine
L’amantadine est un composé antiviral qui a également des propriétés pharmacologiques anti-parkinsoniennes. Elle augmente la libération de dopamine, bloque la recapture de la dopamine et stimule les récepteurs dopaminergiques. C’est aussi un antagoniste des récepteurs N-méthyl-D-aspartate, elle agit sur l’ensemble des fonctions motrices (Olanow et al., 2009).
Les traitements des symptômes non moteurs
Les médecins disposent à l’heure actuelle d’une pharmacopée très large afin de traiter et soulager les patients des symptômes non moteurs liés à la MP comme les troubles cardiaques, digestifs, cognitifs ou encore les troubles du sommeil.
La stimulation cérébrale profonde
La stimulation cérébrale profonde (SCP) est une électrostimulation à haute fréquence du noyau sous thalamique (Limousin et al., 1995 ; Pollak et al., 1996 ; Krack et al., 1997) au moyen d’un stimulateur placé sous la peau au niveau du thorax qui envoie des impulsions électriques. Elle agit sur les dysfonctionnements situés en aval de la dénervation et permet ainsi d’obtenir une nette amélioration de l’état de santé du patient sans pour autant stopper l’évolution de la maladie (Blond et al., 1992 ; Tasker et al., 1997).
L’efficacité de cette chirurgie fonctionnelle est très bonne chez la majorité des patients opérés ces dernières années. Elle permet dans de nombreux cas de diminuer les doses de LDOPA voir stopper sa prise et donc d’atténuer considérablement les effets secondaires liés à la médicamentation. Cependant, cette opération n’est réalisable que chez 5 à 10 % des patients (Limousin et al., 1997 ; Bejjani et al., 1999) étant généralement recommandée aux patients dans les tous premiers stades de la maladie.
La thérapie cellulaire
Après une tentative décevante d’autogreffes de surrénales par Madrazo à la fin des années 80 (Madrazo et al., 1987) et les travaux de Dunnett chez l’animal (Dunnett et al., 1991), des greffes de neuroblastes foetaux ont été tentées chez l’homme (Peschanski et al., 1994 ; Kordower et al., 1995). L’allogreffe de neuroblastes fœtaux a pour objectif de remplacer les neurones dopaminergiques dégénérescents chez les patients. Les greffes sont réalisées avec des neuroblastes fœtaux à un stade très peu différencié et provenant du mésencéphale ventral. Les résultats cliniques publiés montrent une nette amélioration de l’état de santé des patients au cours du temps. La survie et de l’intégration du greffon dans le parenchyme striatal ont été démontrées lors d’analyses post mortem (Kordower et al., 1995).
Cependant, cette technique pose des problèmes de logistique (liés au nombre important de fœtus nécessaires pour greffer un patient) et d’éthique (liés à l’utilisation de fœtus humains).
De plus, l’apparition d’effets secondaires (dyskinésies) chez des patients greffés a stoppé les essais (Freed et al., 2001). Cependant, une nouvelle alternative à ces greffes et à leurs limites est apparue ces dernières années avec l’isolement et l’étude des cellules souches embryonnaires et plus particulièrement des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS). En effet, ce sont des cellules souches pluripotentes dont on dirige la différenciation afin d’obtenir le type cellulaire et le phénotype désiré. Elles constituent une source de cellule prometteuse pour la médecine régénérative dans de nombreuses pathologies en particulier les maladies neurodégénératives. En 2011, l’équipe de Lorenz Studer arrivait à greffer des neurones mésencéphaliques dérivés de cellules souches embryonnaires humaines dans 3 espèces différentes de modèles parkinsoniens. Les neurones greffés se sont intégrés avec un profil moléculaire, biochimique et électrophysiologique caractéristique des neurones dopaminergiques et aboutissant à une récupération fonctionnelle. Ce qui est une grande avancée et créé de grandes perspectives pour la thérapie cellulaire (Kriks et al., 2011).
Les thérapies complémentaires
En ajout du traitement pharmacologique et/ou chirurgical, d’autres thérapies peuvent être ajoutées au projet thérapeutique comme de la rééducation du patient, du maintien de l’activité physique (kinésithérapie, ergothérapie) ou encore de la diététique cela dans le but d’optimiser l’efficacité du traitement « principal » et d’améliorer le quotidien du patient.
Les modèles animaux de la maladie de Parkinson
Afin d’étudier et de mieux comprendre les mécanismes mis en jeux dans la MP, différents modèles animaux ont été créés. Il existe des modèles neurotoxiques et génétiques.
Les modèles neurotoxiques
Le modèle 6-OHDA
La 6-OHDA est la neurotoxine la plus couramment utilisée pour générer des modèles d’étude de la MP in vitro et in vivo (Ungerstedt et al., 1968 et 1976 ; Sachs et al., 1975 ; Blum et al., 2001). Il s’agit d’une toxine spécifique des neurones catécholaminergiques (Betarbet et al., 2002) étant captée par les transporteurs dopaminergiques et noradrénergiques (Luthman et al., 1989). Au niveau cellulaire, la toxine va être oxydée générant des radicaux libres et inhibant le complexe I mitochondrial induisant la mort cellulaire par apoptose, ce qui va entraîner la mort sélective des neurones dopaminergiques de la zone ciblée de façon relativement spécifique. La mort des neurones dopaminergiques très rapide (intervenant dès 3-4j) est suivie par la dégénérescence des fibres dopaminergiques du striatum et donc la diminution du taux de dopamine dans le striatum. Cette toxine ne pouvant passer la barrière hématoencéphalique, son administration se fait par injection stéréotaxique intracérébrale. Les sites d’injection les plus fréquemment utilisés sont la SN, le faisceau médian du télencéphale (FMT) ou le striatum (Javoy et al., 1976 ; Jonsson et al., 1982).
Autres modèles toxiques : les pesticides
Les modèles animaux induits par des pesticides peuvent notamment aider à établir un lien causal de toxiques environnementaux dans l’étiologie de la MP. Les principaux utilisés sont la roténone ou le paraquat et le Maneb. Ce sont des inhibiteurs des complexes mitochondriaux (I pour la roténone et le paraquat, III pour le Maneb). Ces nouveaux modèles ont pour objectif de reproduire au maximum les troubles physiopathologiques et cliniques de la MP en induisant des dégénérescences d’autres systèmes de neurotransmetteurs ainsi que dans d’autres structures.
Les principaux intérêts des modèles neurotoxiques sont leur rapidité et leur simplicité permettant d’obtenir rapidement une lésion neuronale relativement spécifique des neurones dopaminergiques de la SN et ainsi de tester des molécules anti-parkinsoniennes ou le bénéfice de nouvelles thérapies telles que la transplantation ou la thérapie génique (Bjorklund et al., 2003). Toutefois, ces modèles ne vont pas reproduire toutes les caractéristiques de la maladie notamment la présence de LB dans les neurones dopaminergiques ni le caractère progressif de la maladie et surtout ne visent à reproduire principalement que l’atteinte de la substance noire ce qui ne représente donc qu’un pan de la pathologie bien plus complexe.
Aux vues des limites de ces modèles, il a été développé des modèles génétiques dans l’optique de reproduire le plus fidèlement possible la physiopathologie de la MP en s’appuyant sur les gènes associés aux formes familiales de MP.
Test des anticorps anti-α-synucléine
Afin de caractériser notre modèle transgénique de la MP, des rats âgés de 3 à 25 mois ont été perfusés. Leur cerveau a été coupé au cryostat. Les coupes de 16 µm ont été récupérées de façon sériées sur des lames cotées à la gélatine. Ainsi, différents marquages et colorations ont pu être réalisés sur l’ensemble des structures du cerveau notamment les BO et la SN.
L’analyse commence par une coloration au Crésyl violet afin d’étudier l’architectonique du cerveau. Ce marquage n’a pas montré de différences significatives entre les rats témoins et les rats transgéniques et ce quel que soit leur âge.
Un marquage de l’α-syn humaine est réalisé afin de cartographier l’expression du transgène dans les différentes structures du cerveau. Pour cela, l’affinité de différents anticorps a été évaluée dans un premier temps sur une lignée cellulaire transfectée avec un vecteur viral codant pour l’α-syn humaine puis sur des coupes de cerveau au niveau de la SN.
Nous avons ainsi choisi l’anticorps anti-α-syn humaine MAB0261 de Biosource (Invitrogen, Cergy Pontoise, France). Cet anticorps ne présente aucune cross-réaction avec le rat. Nous pouvons donc observer l’expression du transgène indépendamment de l’α-syn endogène.
Etude des bulbes olfactifs
Analyse immunohistochimique
Nous avons comparé l’expression de l’α-syn humaine à celle de la TH de rat. La première structure observée a été le BO. Dans cette structure, une région nous intéresse plus particulièrement. Ce sont les glomérules olfactifs. En effet, des neurones dopaminergiques sont présents dans cette zone du BO.
Une forte expression de l’α-syn humaine a été observée dans les bulbes olfactifs des rats transgéniques âgés de 3 à 25 mois contrairement aux rats témoins. L’α-syn humaine est exprimée dans une zone du BO exprimant la TH, les glomérules.
Une analyse au microscope confocal permet de mettre en évidence une colocalisation de l’α-syn humaine (en rouge) et de la TH de rat (en vert) au niveau des glomérules dans les BO.
Détection d’agrégats protéiques
Suite à un marquage de l’α-syn humaine, nous avons observé des agrégats d’α-syn humaine dans les neurones dopaminergiques de la zone glomérulaire des BO des rats transgéniques âgés de 25 mois. Un marquage à la Thioflavine T a permis de mettre en évidence la présence d’agrégats protéiques dans les BO de rat âgé de 21 mois. Au niveau des BO, ces agrégats sont uniquement retrouvés dans les cellules de la zone glomérulaire des rats transgéniques, ce qui suggère l’implication de l’α-syn humaine dans l’apparition de ces agrégats. Cependant, nous n’avons pas de contrôle positif pour cette expérience. En effet, une coupe de cerveau humain provenant d’un patient décédé d’une démence à corps de Lewy pourrait nous permettre d’avoir un contrôle fort de cette expérience.
Mesure de la largeur de la zone glomérulaire
Des photos des BO (dont la TH a été immuno-marquée) de 5 rats transgéniques et 5 rats témoins âgés de 25 mois ont été prises. La largeur de la zone glomérulaire a été mesurée dans le but d’évaluer une éventuelle différence de l’innervation dopaminergique dans les BO entre les rats transgéniques et les rats témoins. Les BO sont divisés en 3 parties égales. Nous observons une augmentation significative de la largeur de la zone glomérulaire dans la partiemédiane du BO chez les rats transgéniques à 25 mois.
Comptage des cellules TH-positives dans la zone glomérulaire du BO
Les cellules TH-positives et les cellules exprimant l’α-syn humaine des BO de rats âgés de 25 mois ont été quantifiées sur 6 coupes consécutives. Nous avons pu observer que les rats transgéniques présentent un plus grand nombre de neurones dopaminergiques que les rats témoins dans la zone glomérulaire. En effet, les rats transgéniques comptent 27 % de neurones dopaminergiques en moins par rapport aux rats témoins à 25 mois. Par ailleurs, nous avons noté qu’il existe une importante variabilité entre les individus en ce qui concerne l’expression protéique du transgène dans la zone glomérulaire et dans la couche de cellules mitrales. La différence observée dans le nombre de neurones dopaminergiques dans la zone glomérulaire entre les rats transgéniques et les rats témoins n’est pas retrouvée dans la couche de cellules mitrales.
Analyse de la fonction olfactive des rats
L’un des premiers symptômes de la MP est un trouble de l’olfaction. De plus, notre modèle présente une forte expression de l’α-syn dans les BO dès 3 mois. Ces 2 observations nous ont conduits à analyser la fonction olfactive des rats transgéniques.
Chez le raton
Dans un premier temps, nous avons testé la fonction olfactive des ratons à l’âge de 7 jours. A cet âge, les ratons sont aveugles et vont se déplacer uniquement grâce à leur fonction olfactive.
Une centaine de ratons ont été testés. Aucune différence significative n’a été observée entre les rats transgéniques et les rats témoins. Au cours du test qui dure 2 minutes, les ratons transgéniques et témoins passent 60 % du temps de l’expérience au-dessus du compartiment comprenant la sciure de sa propre cage. Cette sciure contient l’odeur de la mère et de la portée. Les ratons testés en se déplaçant sur ce compartiment montrent qu’ils perçoivent les odeurs. Ce test est réalisé en aveugle. En effet, le génotypage des ratons est réalisé à l’âge de 2 semaines.
Les rats transgéniques ne présentent donc pas de troubles de la fonction olfactive à la naissance. Notre étude a pour objectif de développer un modèle progressif de la MP. Aucun trouble n’est détecté à la naissance, il nous faut donc tester les rats au cours du temps.
Chez l’adulte, perception d’une odeur répulsive
Nous avons développé des tests afin d’analyser la fonction olfactive des rats adultes.
Tout d’abord, nous avons testé la fonction olfactive des rats en évaluant la perception par les animaux d’une odeur répulsive, celle de l’acide acétique. Les tests ont été réalisés avec 4 rats témoins (en noir) et 7 rats transgéniques (en gris) âgés de 1 à 2 ans. L’analyse des films sur les rats témoins ont montré des résultats positifs c’est à dire que l’odeur perçue lorsque le papier filtre imbibé d’acide acétique à 40 % est présenté, est répulsive. Le rat fait alors un mouvement de retrait ; il perçoit donc cette odeur. Nous présentons le papier filtre 4 fois à chaque rat. Ainsi un score sur 4 est attribué à chaque rat, 4 traduisant un retrait à chaque présentation de l’odeur. Le test est aussi réussi par les rats transgéniques MA2 et MA4, deux fondateurs. Par contre, il semble y avoir une différence pour les rats de la lignée MA3. Ces animaux obtiennent un score pour ce test environ deux fois moins bon que les autres rats c’est-à-dire qu’ils vont réaliser un retrait, lorsque le papier filtre imbibé d’acide acétique leur est présenté, qu’une fois sur 2.
Ce test nous a permis de mettre en évidence l’apparition de troubles de la fonction olfactive chez 5 rats âgés de 1 à 2 ans de la lignée MA3. Cependant, après quelques sessions de test, un problème est survenu. Les rats témoins utilisés pour cette expérience ont commencé à faire des apnées lorsque le papier filtre imbibé d’acide acétique leur était présenté. Leur score a donc chuté. Le témoin positif de l’expérience n’étant plus fiable, nousavons dû développer un nouveau test.
Chez l’adulte, perception d’une odeur attractive
Pour ce nouveau test, nous avons utilisé une odeur attractive, le lait de coco. Ce test a été réalisé avec 4 rats témoins et 4 rats transgéniques. De plus, l’olfaction des 10 rats (5 transgéniques et 5 témoins) utilisés dans l’étude comportementale a été analysée dans ce test entre 9 et 25 mois.
Les rats témoins sont attirés par l’odeur du lait de coco et vont passer une majorité du temps de l’expérience dans le compartiment contenant le papier filtre imbibé de lait de coco.
Le ratio odeur / eau va donc augmenter. Au fur et à mesure des sessions de tests, les rats témoins passent de plus en plus de temps du côté du lait de coco. A 25 mois, les rats témoins passent les _ du temps de l’expérience du côté de l’odeur. Les rats transgéniques quant à eux vont explorer de façon égale tous les compartiments de l’expérience quelque soit l’âge auquel ils sont testés. Ceci est traduit par leur rapport odeur/eau qui reste relativement stable autour de 1.
Le locus coeruleus
Le LC est une structure composée de noyaux riches en neurones noradrénergiques.
Ces neurones expriment donc la TH. De plus, cette structure est aussi atteinte chez les patients. Nous avons observé l’expression du transgène dans les neurones de cette structure.
Le marquage de la TH chez les animaux transgéniques semble plus faible que chez les rats témoins. D’après le comptage des neurones TH-positifs de cette structure, les rats transgéniques présentent une perte de 23 % des neurones noradrénergiques. Cependant la différence n’est pas significative. Ce résultat ne représente qu’une tendance. Nous devons augmenter la taille des groupes afin de pouvoir confirmer ou non cette tendance.
La zone périventriculaire
Nous avons aussi retrouvé des cellules exprimant l’α-syn humaine autour du troisième ventricule. Les marquages ont montré quelques gros neurones exprimant la TH de rat et l’α-syn humaine. Les comptages des neurones TH-positifs n’ont révélé aucune différence entre le groupe des rats témoins et celui des rats transgéniques.
Le cortex cérébral
De la même façon, nous avons retrouvé des neurones présentant une accumulation d’α-syn humaine mutée dans le subiculum et dans le cortex cérébral occipito-pariétal des rats transgéniques. Or des corps de Lewy ont été retrouvés dans des neurones corticaux de patients décédés de la MP (Braak et al., 2006).
Discussion
Le but de cette étude était de développer un nouveau modèle de la MP plus proche de la pathologie humaine que ceux existants. Notre modèle est un rat transgénique qui exprime donc le gène humain de l’α-syn doublement muté sous le contrôle du promoteur de la TH de rat. Ainsi, tout comme dans certaines formes héréditaires de la pathologie humaine, nous espérons observer l’expression du transgène dans les neurones dopaminergiques des rats. En orientant l’expression de l’α-syn humaine doublement mutée dans les neurones dopaminergiques, nous voulons provoquer la dégénérescence de cette population neuronale et ainsi observer l’apparition de la symptomatologie caractéristique de la MP en étant le plus proche de la physiopathologie de la maladie
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Table des matières
Abréviations
I- Introduction
1- Les maladies neurodégénératives
2- La maladie de Parkinson
2.1- Historique
2.2- Aspects cliniques
2.2.1- Epidémiologie
2.2.2- Etiologie
a.Les facteurs environnementaux
b.Les facteurs génétiques
c.Les dysfonctions cellulaires
d.Les corps de Lewy et les neurites de Lewy
e.L’alpha-synucléine
2.3- Les ganglions de la base et la maladie de Parkinson
2.3.1- Le striatum
2.3.2- Le pallidum
2.3.3- La substance noire
2.3.4- Le noyau sous-thalamique ou corps de Luys
2.3.5- Organisation fonctionnelle des ganglions de la base et maladie de Parkinson
2.4- Physiopathologie : la théorie de Braak
2.5- Les symptômes de la maladie de Parkinson
2.5.1- symptômes moteurs
2.5.2- symptômes non moteurs
a.La démence
b. L’anxiété et la dépression
c.Les troubles du sommeil
d. Les dysfonctions du système nerveux autonome
e. Les troubles olfactifs : l’hyposmie
3- Les traitements de la maladie de Parkinson
3.1- Les traitements pharmacologiques
3.1.1- Traitements dopaminergiques
3.1.2- Les anti-cholinergiques
3.1.3- L’amantadine
3.1.4- Les traitements des symptômes non moteurs
3.2- La stimulation cérébrale profonde
3.3- La thérapie cellulaire
3.4- Les thérapies complémentaires
4- Les modèles animaux de la maladie de Parkinson
4.1- Les modèles neurotoxiques
4.1.1- Le modèle 6-OHDA
4.1.2- Le modèle MPTP
4.1.3- Autres modèles toxiques : les pesticides
4.2- Les modèles génétiques
4.2.1- Les modèle de maladie de Parkinson autosomique dominante
a.Modèles α-syn
b.Modèles LRRK2
c.Modèles Nurr1
4.2.2- Les modèle de maladie de Parkinson autosomique récessive
a.Modèles parkine
b.Modèles PINK1
c.Modèles DJ-1
II- Objectifs
III- Résultats
1- Création et développement des lignées
2- Analyse de l’expression de transcrits par PCR quantitative en temps réel
3- Test des anticorps anti-α-synucléine
4- Etude des bulbes olfactifs
4.1- Analyse immunohistochimique
4.2- Détection d’agrégats protéiques
4.3- Mesure de la largeur de la zone glomérulaire
4.4- Comptage des cellules TH-positives dans la zone glomérulaire du BO
4.5- Analyse de la fonction olfactive des rats
a.Chez le raton
b.Chez l’adulte, perception d’une odeur répulsive
c.Chez l’adulte, perception d’une odeur attractive
4.6- Analyse de l’expression du transgène par Western blot
5- Etude de la voie nigro-striée
5.1- Analyse immunohistochimique
5.2- Analyse de la neurodégénérescence
5.3- Etude du comportement neurologique et moteur
6- Etude des autres structures
6.1- Le locus coeruleus
6.2- La zone périventriculaire
6.3- Le cortex cérébral
V- Discussion
La création du modèle
BO et mise en évidence de l’hyposmie
Système nigro-strié et troubles moteurs
LC et troubles du sommeil
Bibliographie
