Les Microcines : peptides antibactériens des entérobacteries synthétisés selon la voie ribosomique

Par leur nombre et leur diversité, les microorganismes occupent une place essentielle dans tous les écosystèmes. Par référence aux activités humaines, ils sont parfois considérés comme utiles ou nuisibles. Leur importance est à l’origine de nombreux travaux, en écologie et en agroalimentaire notamment, et les recherches sur la génétique des microorganismes sont de plus en plus pointues et riches d’applications.

Les diverses espèces cohabitant dans une niche écologique donnée et leurs propriétés métaboliques, peuvent être exploitées pour leur capacité de transformation et dégradation de composés chimiques (station d’épuration) ou de fermentation (production d’éthanol, de méthionine, …). La modification génétique des espèces permet alors d’optimiser la production ou la dégradation de tel ou tel composé. Parallèlement à ces métabolites de petites masses moléculaires, de nombreux peptides et protéines sont sécrétés par les microorganismes, et en particulier des peptides et des protéines aux activités antimicrobiennes qui présentent un intérêt important.

La majorité des êtres vivants, eucaryotes ou procaryotes sécrètent des peptides et protéines aux propriétés antimicrobiennes. Chez les eucaryotes, ils sont majoritairement impliqués dans l’immunité dite innée. Ils contribuent ainsi à la protection de la plante ou de l’animal vis-à-vis d’un environnement riche en microorganismes, parmi lesquels bon nombre sont pathogènes, en tant que barrière chimique d’une part, mais aussi en tant qu’activateurs des processus de réponse inflammatoire. Ils sont ainsi sécrétés par un grand nombre de tissus en contact direct avec les microorganismes, tels que l’épiderme, l’épithélium respiratoire, digestif et urinaire, ou les cellules circulantes comme les phagocytes (pour revues, consulter Gallo et al. 2002, Jenssen et al. 2006)). Chez les procaryotes, si le rôle de ces peptides et protéines se révèle multiple, leur fonction première semble malgré tout être une fonction de défense. En effet, comme chez les eucaryotes, ils empêchent, par leur caractère antibiotique, la prolifération de microorganismes externes ou internes à leur écosystème naturel et rivalisent pour les nutriments présents dans leur niche écologique. Ils permettent ainsi de stabiliser un équilibre de la flore microbienne dans un écosystème donné (Riley et Wertz 2002, Riley et Goldstone 2003).

Souches bactériennes, plasmides et milieux 

Souches bactériennes et plasmides

Choix des vecteurs – Le clonage des gènes amplifiés par PCR a été effectué dans pMOSBlue. L’insertion se fait dans le gène lacZ, qui code la ß-galactosidase. Cette enzyme dégrade le chromophore X-Gal, dérivé du β-D-galactoside, en un produit bleu. Cette technique de clonage permet donc très aisément de sélectionner visuellement les clones ayant effectivement intégré l’insert. En effet, lorsque le clonage a réussi, les colonies obtenues sur milieu gélosé contenant le X Gal sont blanches, et non bleues, indiquant une absence d’activité ßgalactosidase.

Le vecteur d’expression choisi est pET28b, dans lequel le gène cloné est sous le contrôle du promoteur fort du phage T7 (reconnu par l’ARN polymérase du phage T7). Il permet de produire une protéine sous forme de fusion avec une étiquette des six histidines en position N-terminale. Cette étiquette facilite non seulement la détection de la protéine recombinante grâce à des anticorps commerciaux anti-histidine, mais aussi la purification de la protéine recombinante .

Choix des souches – Les souches E. coli ER2566 et E. coli BL21(DE3), ont été choisies pour l’expression des protéines recombinantes, dont le gène est porté par les dérivés du plasmide pET28b. En effet, ces souches portent sur leur génome le gène de l’ARN polymérase du phage T7 sous le contrôle du promoteur lacUV5 de l’opéron lactose. La transcription de ce gène peut donc être induite grâce à l’IPTG, un dérivé du galactose qui n’est pas métabolisé par les bactéries. Dans ces conditions, l’ARN polymérase du phage T7 ainsi produite va activer le promoteur du phage T7 et donc induire la synthèse de la protéine recombinante . Afin de minimiser la dégradation intracellulaire de la protéine recombinante lors de sa production, nous avons aussi utilisé les souches E. coli BL21 (DE3) et E. coli ER2566, qui dérivent respectivement de E. coli B de E. coli K12, car elles ne possèdent pas les gènes codant les protéases Lon et OmpT.

Milieux de culture

• Bouillons de culture
Luria-Bertani Broth (LB) : bactotryptone 10 g/l, extrait de levure 5 g/l, NaCl 5 g/l, pH 7 Milieu Minimum M63 : KH2PO4 100 mM, (NH4)2SO4 15 mM pH 7, supplémenté par du glucose 0,2 %, MgSO4 0,02 %, thiamine 1 mg/l, et 1 g/l d’hydrolysats tryptiques d’acide aminés (Difco) ou d’hydrolysats acide de caséine (Difco). Milieu Pauvre Poor-Broth (PB) : bactotryptone 10 g/l, NaCl 5 g/l .

Les antibiotiques (Sigma) ont été utilisés aux concentrations suivantes :
Ampicilline à 50 μg/ml
Chloramphénicol à 34 μg/ml
Tetracycline à 50 µg/ml
Kanamycine à 50 µg/ml .

• Milieux gélosés :
Ils dérivent des bouillons de culture et contiennent 6,5 g/l (gélose molle) ou 15 g/l (gélose dure) d’agar.

Clonage et transformation

Purification et dosage d’ADN 

Purification d’ADN par lyse alcaline
Les plasmides portés par les différentes souches ont été extraits selon la méthode de la lyse alcaline (Sambrook et al. 1989). Les plasmides utilisés pour le séquençage ont été extraits par échange d’ions grâce au procédé commercial « Miniplasmid Prep » (MoBio Laboratories Inc.) ou « Plasmid Midi Kit » (Qiagen).

Purification d’ADN par extraction de gel d’agarose
La purification des fragments d’ADN résultant de digestions enzymatiques a été réalisée par élution de gels d’agarose 0,7 à 2 % (tampon TAE : 40 mM Tris, 0,001 % acide acétique et 0,001 M EDTA, pH 8, coloration au BET), grâce au procédé commercial « Ultra Clean DNA Purification » (MoBio Laboratories Inc.).

Dosage d’ADN
La concentration et la pureté de l’ADN ont été déterminées par spectroscopie UV à 260 et 280 nm sur un spectrophotomètre UVIKON 932. Le rapport de l’absorbance à 260 nm sur celle à 280 nm permet d’estimer la pureté de l’ADN. Lorsque la valeur est inférieure à 1,65 ou supérieure à 2, les solutions sont considérées comme contaminées respectivement par des protéines ou de l’ARN.

Table des matières

INTRODUCTION
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES: LES MICROCINES
I. Les Microcines : peptides antibactériens des entérobacteries synthétisés selon la voie ribosomique
Publication n°1 : Microcins, gene-encoded antibacterial peptides from enterobacteria
II. Les microcines E492, J25 et C7/C51 : diversités structurelle et fonctionnelle des microcines
Publication n°2: Structural and functional diversity of microcins, gene-encoded antibacterial peptides from enterobacteria
MATERIELS ET METHODES
I. Souches bactériennes, plasmides et milieux
I.1. Souches bactériennes et plasmides
I.2. Milieux de culture
II. Clonage et transformation
II.1. Purification et dosage d’ADN
II.2. Obtention d’inserts d’ADN
II.3. Réactions enzymatiques
II.4. Transformation
II.5. Séquençage
III. Production et purification de peptides et protéines
III.1. Microcine J25 intacte et clivée à la thermolysine
III.2. McjA, précurseur de MccJ25
III.3. McjB et McjC, enzymes de maturation de MccJ25
III.4. FhuA, récepteurs aux sidérophores
IV. Caractérisation des peptides et protéines
IV.1. Dosage de solutions de peptides et protéines
IV.2. Electrophorèse sur gel d’acrylamide SDS
IV.3. Western Blot
IV.4. Digestion à la trypsine
IV.5. Spectrométrie de masse
IV.6. Dichroïsme circulaire
V. Anticorps polyclonaux anti-[His6-McjB] et anti-[His6-McjC]
VI. Mise en évidence d’interactions moléculaires
VI.1. Chromatographie d’exclusion
VI.2. Microcalorimétrie
VII. Analyse fonctionnelle des peptides et protéines
VII.1. Activité antimicrobienne
VII.2. Activité enzymatique de McjB et McjC
VII.3. Test antiviraux sur phage T5
CHAPITRE I : MECANISME D’IMPORT DE MCCJ25 DANS LES BACTERIES
I. Publication n°3: The iron-siderophore transporter FhuA is the receptor for the antimicrobial peptide microcin J25: role of the microcin Val11-Pro16 betahairpin region in the recognition mechanism
II. Synthèse des résultats
CHAPITRE II : ETUDE DE LA VOIE DE MATURATION DE MCCJ25
I. Publication n°4: Two enzymes catalyze the maturation of a lasso peptide in Escherichia coli
II. Synthèse des résultats
III. Résultats complémentaires
CONCLUSION

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