LES MICRO-ORGANISMES ET LES MILIEUX DE CULTURE UTILISES

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Identification de la plante

La plante a été déterminée au département Flore du Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza. Un échantillon d’herbier est déposé au Missouri Botanical Garden sous le numéro : 412.

Description botanique

La description botanique détaillée du genre Pachytrophe et de l’espèce Pachytrophe dimepate est donnée en annexe 1. La plante est présentée sur la figure 1 (p. 7).

Distribution géographique

Pachytrophe dimepate est largement répartie dans la région Est de Madagascar et dans la région du Lac Alaotra. Cependant, on ne la trouve pas dans la région Ouest.
Elle pousse dans les forêts primaires et la végétation secondaire au bord des rivières.
La répartition géographique de Pachytrophe dimepate est montrée sur la figure 2 (p.8).

Date et lieu de récolte

Notre matériel d’étude (les feuilles de la plante) a été récolté dans la région de Mahanoro, plus précisément dans la commune de Niarovana-Caroline, Ilaka-Est, à 318km d’Antananarivo, au mois d’Août 2006, période où la plante est au stade végétatif.

Préparation et conservation du matériel végétal

Les feuilles fraîchement récoltées sont séchées au soleil pendant une à deux semaines. Elles sont réduites en poudre à l’aide d’un mixer BLENDER (robot coupe GT 550). La poudre fine ainsi obtenue est conservée dans des bocaux hermétiques, à la température ambiante. Cette poudre représente notre matériel de départ.

LES PRODUITS CHIMIQUES

La plupart des produits chimiques et des solvants utilisés dans cette étude sont de qualité pour analyse et de marque MERCK ou PROLABO. Le support chromatographique utilisé pour la chromatographie sur couche mince est le gel de silice 60F254, étalé sur des plaques en plastique de dimensions 20cm x 20cm. L’épaisseur du gel est de 0,2mm.

METHODES

METHODES D’EXTRACTION

Extraction à froid

Le matériel végétal réduit en poudre est mis en suspension dans le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange hydroalcoolique 75%), selon le rapport 1/10 (P/V) (10ml de solvant pour 1g de poudre). Le mélange est soumis à une agitation magnétique durant 3h à la température ambiante, puis laissé macérer à + 4°C pendant une nuit. Le macérat est ensuite filtré sur quatre épaisseurs de gaze après avoir été agité à nouveau pendant 1h. Le filtrat obtenu est centrifugé à 10.000 tours /min (centrifugeuse JOUAN, UJ1 B-159), pendant 30 min. Le culot est écarté et le surnageant recueilli. Son volume est réduit jusqu’au rapport 1/1 (1ml de solvant pour 1g de matériel de départ), par évaporation du solvant d’extraction (§ 2.2.3., p. 13).

Extraction à chaud

La poudre végétale est délayée dans le solvant d’extraction (eau distillée ou mélange hydroalcoolique 75%), suivant le rapport 1/10 (P/V). Le mélange est chauffé à reflux pendant 3h sur la plaque chauffante, sous agitation magnétique, à la température d’ébullition du solvant d’extraction. Après refroidissement, l’ensemble est laissé macérer pendant une nuit à + 4°C.
La suite de la manipulation est identique à celle de l’extraction à froid.

METHODES DE PURIFICATION

Traitement par la chaleur

Principe

Cette méthode est utilisée pour éliminer certaines macromolécules telles que les protéines ou les acides nucléiques qui coagulent sous l’effet de la chaleur.

Mode opératoire

L’extrait à traiter est chauffé au bain-marie bouillant à 96°C pendant 15min. Le précipité formé est éliminé par centrifugation (centrifugeuse BREMSE, TH12) à 3000 tours/min pendant 15 min.

Dialyse

Principe

La dialyse est une technique de séparation des substances en fonction de leur taille. La membrane poreuse du boudin de dialyse joue le rôle de tamis. Les substances traversent la membrane en diffusant dans le liquide de contre-dialyse se trouvant à l’extérieur de la membrane. L’effet tamis explique la perméabilité à certaines substances et l’imperméabilité à d’autres, en fonction de leur taille. Au cours de la dialyse, la diffusion des grosses molécules est lente ou nulle, celle des petites se fait selon un gradient de concentration (voir annexe 6).
Les facteurs pouvant influencer la dialyse ou la vitesse de diffusion d’une substance à travers la membrane sont :
™ la température
™ le rapport : surface de la membrane / volume de la solution à dialyser
™ le pH du liquide à dialyser et celui du liquide de contre-dialyse.

Mode opératoire

Le boudin à dialyse ou sac à dialyse utilisé se présente sous forme de cylindre allongé en cellophane (référence 27/32) de 3,3 cm de largeur (à plat). Il est perméable aux substances dont le poids moléculaire est inférieur à 15000 Da.
Préparation de la membrane de dialyse
La membrane de dialyse contient des glycérines, des composés sulfurés et des métaux lourds qu’il faut préalablement éliminer par trempage dans de l’eau distillée bouillante pendant 15min. Cette opération est répétée 3 à 4 fois. Apres refroidissement, la membrane ainsi préparée peut être conservée à +4°C pendant 2 à 3 jours dans la dernière eau bouillie.
Le boudin à dialyse contenant l’extrait à dialyser est fermé à ses deux extrémités par un noeud. Il est immergé dans le liquide de contre-dialyse (100 fois le volume de l’extrait) placé dans un becher. Afin d’éviter la formation d’un gradient de concentration des substances diffusibles autour du boudin de dialyse, une agitation magnétique de l’ensemble est nécessaire. Le liquide de contre-dialyse doit être renouvelé fréquemment afin d’accélérer la disparition des substances diffusibles dans le boudin et de maintenir la différence de concentration entre les deux milieux.
A la fin de la dialyse, la solution à l’intérieur du boudin à dialyse (adialysat) ainsi que celle à l’extérieur (dialysat) sont concentrées par évaporation.

Fractionnement par le n-butanol

Principe

Cette technique permet le fractionnement des substances selon leur solubilité relative vis-à-vis de deux solvants non miscibles et de polarités différentes tels que le n-butanol et l’eau.

Mode opératoire

L’extrait à tester et le n-butanol sont mélangés volume à volume dans une ampoule à décanter. Après une forte agitation manuelle, l’ensemble est laissé décanter jusqu’à séparation nette de deux phases : une phase supérieure organique et une phase inférieure aqueuse.
La phase butanolique est recueillie, alors que la phase aqueuse est soumise à deux autres traitements identiques au premier. Les trois phases organiques rassemblées, ainsi que la phase aqueuse sont filtrées séparément sur papier filtre pour éliminer les éléments insolubles. Le butanol est évaporé de la phase organique. Il est nécessaire d’ajouter un grand volume d’eau pour éliminer totalement le solvant.
Dans la phase aqueuse, le résidu de n-butanol est évaporé après addition d’eau distillée.
La solution finale est ramenée à son volume initial par évaporation.

Précipitation par l’acétone

Principe

Cette technique consiste à abaisser la polarité et le pouvoir dissolvant d’un milieu aqueux par addition d’un solvant moins polaire miscible. Il en résulte que les substances les moins solubles précipitent.

Mode opératoire

Le résidu d’évaporation à sec de l’extrait à traiter est repris dans du méthanol selon le rapport 1/4 (P/V), (4ml de méthanol pour 1g de résidu sec). Le mélange est soumis à une agitation magnétique jusqu’à l’obtention d’une solution homogène.
Le volume d’acétone nécessaire (5 fois le volume de la solution méthanolique) est versé goutte à goutte dans la solution méthanolique précédente. L’opération se déroule dans un bac à glace sous agitation magnétique. La saturation finale en acétone est d’environ 80%.

Le mélange est ensuite laissé au repos à 0°C jusqu’à décantation complète du précipité formé. Le surnageant est éliminé par aspiration, tandis que le précipité est abandonné à l’air libre jusqu’à la disparition de l’odeur du solvant. Il est ensuite repris dans de l’eau distillée. Afin d’éliminer les traces du solvant, une légère évaporation est réalisée.

Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)

Principe

Les sels de métaux lourds, comme l’ANP, ont la capacité de précipiter certaines macromolécules telles que les acides nucléiques, les polysaccharides ainsi que les protéines.

Mode opératoire

La solution d’ANP à 20% (P/V) de volume défini, est versée goutte à goutte dans l’extrait à traiter sous agitation magnétique. Le précipité formé est éliminé par centrifugation (centrifugeuse BREMSE, TH12) à 3000 tours/min pendant 10 min.
L’ajout d’une solution aqueuse de phosphate disodique à 10% (P/V) dans le surnageant est nécessaire, pour éliminer l’excès de plomb sous forme de précipité. Le précipité est écarté par centrifugation pendant 10 min. Le surnageant est ramené au volume initial par évaporation.

METHODE DE CONCENTRATION

Toutes les opérations d’évaporation de solvant et de réduction de volume des extraits sont réalisées à la température 50-55°C, à l’aide d’un évaporateur rotatif BÜCHI. La pression est réduite au moyen d’une pompe à vide.

METHODES D’ANALYSE

Chromatographie sur couche mince (CCM)

Principe

La chromatographie sur couche mince est un procédé de micro-analyse simple et rapide qui permet de tester la pureté des composés organiques.
Elle fait intervenir les phénomènes physico-chimiques de partage et d’adsorption. Elle est basée sur le transfert des constituants de l’échantillon à séparer d’une phase fixe, qui est un adsorbant maintenu sur une plaque en plastique, vers une phase mobile qui est un solvant ou un mélange de solvants (état liquide).
La vitesse de migration des substances dépend de leur affinité pour la phase mobile d’une part, et des forces d’adsorption dues au support fixe d’autre part (RANDERATH, 1964; AUDIGIE et coll; 1989; MAHUZIER et HAMON, 1990).

Mode opératoire

Dépôt de l’échantillon
Les extraits à analyser sont déposés à l’aide d’un capillaire sur une plaque de gel de silice (voir § 2.1.2., p. 6) découpée aux dimensions voulues. Les dépôts se présentent sous forme de fins traits horizontaux de 7mm espacés de 6mm, situés à 1,5 cm du bord inférieur de la plaque et à 1,3cm de chaque bord latéral. Chaque dépôt est suivi d’un séchage au moyen d’un séchoir à main.
La plaque préparée est placée dans une cuve à chromatographie (DESAGA), saturée en vapeurs du solvant, le système butanol / acide acétique / eau distillée ou B/A/E 60/20/20 (P/P/P).
Cette saturation préalable est obtenue par application de papier filtre imbibé du solvant de migration contre les parois internes du récipient.
La migration du solvant se fait par capillarité vers le haut de la plaque, et quand il parvient à 0,5cm du bord supérieur du support, la chromatographie est stoppée. La plaque est retirée de la cuve, puis séchée au séchoir à main.
Révélation du chromatogramme
Les substances ayant migré sur la plaque sont révélées grâce :
− à une visualisation sous lumière ultra-violette à 254nm et à 366nm. Les constituants apparaissent sous forme de taches fluorescentes ;
− à une pulvérisation du réactif à la vanilline sulfurique sur la plaque. Les constituants apparaissent sous forme de taches rose-violacé qui deviennent noires après chauffage à 120°C pendant 5min.
La composition du réactif à la vanilline sulfurique est donnée en annexe 2.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
Première partie : ETUDE CHIMIQUE
1. INTRODUCTION
2. MATERIELS ET METHODES
2.1. MATERIELS
2.1.1. LE MATERIEL VEGETAL
2.1.1.1. Classification de la plante
2.1.1.2. Identification de la plante
2.1.1.3. Description botanique
2.1.1.4. Distribution géographique
2.1.1.5. Date et lieu de récolte
2.1.1.6. Préparation et conservation du matériel végétal
2.1.2. LES PRODUITS CHIMIQUES
2.2. METHODES
2.2.1. METHODES D’EXTRACTION
2.2.1.1. Extraction à froid
2.2.1.2. Extraction à chaud
2.2.2. METHODES DE PURIFICATION
2.2.2.1. Traitement par la chaleur
2.2.2.1.1. Principe
2.2.2.1.2. Mode opératoire
2.2.2.2. Dialyse
2.2.2.2.1. Principe
2.2.2.2.2. Mode opératoire
2.2.2.3. Fractionnement par le n-butanol
2.2.2.3.1. Principe
2.2.2.3.2. Mode opératoire
2.2.2.4. Précipitation par l’acétone
2.2.2.4.1. Principe
2.2.2.4.2. Mode opératoire
2.2.2.5. Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)
2.2.2.5.1. Principe
2.2.2.5.2. Mode opératoire
2.2.3. METHODE DE CONCENTRATION
2.2.4. METHODES D’ANALYSE
2.2.4.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)
2.2.4.1.1. Principe
2.2.4.1.2. Mode opératoire
2.2.4.2. Méthodes de détection des familles chimiques
2.2.4.2.1. Les alcaloïdes
2.2.4.2.1.1. Test de MAYER
2.2.4.2.1.2. Test de WAGNER
2.2.4.2.1.3. Test de DRAGENDORFF
2.2.4.2.2. Les polyphénols
2.2.4.2.2.1. Test à la gélatine
2.2.4.2.2.2. Test à la gélatine salée
2.2.4.2.2.3. Test au chlorure ferrique (FeCl3)
2.2.4.2.3. Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes
2.2.4.2.3.1. Les flavonoïdes : Test de WILSTATER
2.2.4.2.3.2. Les leucoanthocyanes : Test de BATE-SMITH
2.2.4.2.4. Les stéroïdes, les triterpènes et les stérols insaturés
2.2.4.2.4.1. Test de LIEBERMANN-BÜRCHARD
2.2.4.2.4.2. Test de SALKOWSKI
2.2.4.2.5. Les anthraquinones : Test de BORNTRÄGER
2.2.4.2.6. Les désoxyoses : Test de KELLER-KILLIANI
2.2.4.2.7. Les iridoïdes
2.2.4.2.8. Les saponines (test de mousse)
3. RESULTATS
3.1. EXTRACTION
3.1.1. EXTRACTION A FROID
3.1.1.1. Extraction aqueuse
3.1.1.2. Extraction hydroalcoolique 75%
3.1.2. EXTRACTION A CHAUD
3.1.2.1. Extraction aqueuse
3.1.2.2. Extraction hydroalcoolique 75%
3.2. PURIFICATION
3.2.1. Traitement par la chaleur
3.2.2. Dialyse
3.2.3. Fractionnement par le n-butanol
3.2.4. Précipitation par l’acétone
3.2.5. Précipitation par l’ANP
3.2.6. Rendement
3.27. Degré d’homogénéité des produits
3.3. CARACTERISATION CHIMIQUE
3.3.2. Nature chimique
4. DISCUSSION-CONCLUSION
Deuxième partie : ETUDE TOXICOLOGIQUE
1. INTRODUCTION
2. MATERIELS ET METHODES
2.1. MATERIELS
2.1.1. LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION
2.1.1.1. Les souris
2.1.1.2. Le sang de mouton
2.1.1.3. Les têtards de grenouille
2.1.1.4. Les poissons
2.1.1.5. Les larves de moustique
2.1.2. LES VEGETAUX D’EXPERIMENTATION
2.1.3. LES MICRO-ORGANISMES ET LES MILIEUX DE CULTURE UTILISES
2.1.3.1. Les micro-organismes utilisés
2.1.3.2. Les milieux de culture
2.1.4. LES DISQUES POUR LES TESTS D’ANTIBIOGRAMME
2.2. METHODES
2.2.1. METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX
2.2.1.1. Test sur la souris
2.2.1.1.1. Estimation de la toxicité
2.2.1.1.2. Détermination de la DL50 (24h)
2.2.1.2. Test hémolytique sur les hématies de mouton
2.2.1.2.1. Principe
2.2.1.2.2. Mode opératoire
2.2.1.3. Test sur les animaux à sang froid
2.2.1.3.1. Principe
2.2.1.3.2. Mode opératoire
2.2.1.3.2.1. Expérience sur les têtards de grenouille
2.2.1.3.2.2. Expérience sur les alevins de carpe
2.2.1.4. Test sur les larves de moustique
2.2.2. METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX
2.2.2.1. Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines
2.2.2.2. Etude des effets sur la croissance des jeunes plantules
2.2.2.2.1. Principe
2.2.2.2.2. Mode opératoire
2.2.2.3. Evaluation des effets sur la croissance des bourgeons axillaires
2.2.2.3.1. Principe
2.2.2.3.2. Mode opératoire
2.2.3. METHODES D’ETUDE DES EFFETS SUR LES MICRO-ORGANISMES
2.2.3.1. Stérilisation
2.2.3.2. Coloration de Gram
2.2.3.3. Etude de l’activité antimicrobienne
2.2.3.3.1. Principe
2.2.3.3.2. Mode opératoire
2.2.3.3.2.1. Préparation de l’inoculum
2.2.3.3.2.2. Inoculation du milieu
2.2.3.3.2.3. Mise en culture
2.2.3.4. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)
3. RESULTATS
3.1. EFFETS SUR LES ANIMAUX
3.1.1. EFFETS SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD
3.1.1.1. Effets de l’extrait (E3) sur la souris
3.1.1.1.1. Description des symptômes d’intoxication
3.1.1.1.2. Détermination de la DL50 (24h)
3.1.1.2. Effets des extraits sur les hématies de mouton
3.1.2. EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES ANIMAUX A SANG FROID
3.1.2.1. Effets de l’extrait brut sur les têtards de grenouille
3.1.2.2. Effets de l’extrait brut sur les alevins de carpe
3.1.3. EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES LARVES DE MOUSTIQUE
3.2. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES VEGETAUX
3.2.1. Effets de l’extrait brut sur le pouvoir germinatif des graines
3.2.2. Effets de l’extrait brut sur la croissance des jeunes plantules
3.2.3. Effets des extraits sur le développement des bourgeons axillaires
3.3. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICRO-ORGANISMES
3.3.1. Caractères d’identification morphologique des bactéries
3.3.2. Activité antimicrobienne des extraits
3.3.3. Détermination de la CMI
4. DISCUSSION-CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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