Les méthodes d’évaluation de l’activité antioxydante

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Rôle physiologique des radicaux libres

Les radicaux libres ont un caractère paradoxal, ils sont incriminés dans de nombreuses maladies mais en revanche, ils jouent un rôle physiologique utile au niveau du fonctionnement de l’organisme.
En effet, les radicaux libres participent au fonctionnement de certaines enzymes, à la traduction des signaux cellulaires en agissant comme messagers secondaires, par exemple avec le radical de monoxyde d’azote (NO•) produit par les cellules endothéliales et qui régule entre autres la pression sanguine par son effet de relaxation des cellules musculaires lisses.
Les radicaux libres interviennent aussi dans la défense immunitaire contre les xénobiotiques (bactéries, virus…..) avec la production de monoxyde d’azote et d’anion superoxyde conduisant à la synthèse de peroxynitrite très dommageable pour les parois bactériennes, dans les phénomènes d’apoptose.
Ils induisent une oxydation de l’ADN entrainant, ainsi la production de protéines pro-apoptiques des cellules, au cycle cellulaire, dans la différenciation cellulaire, dans la régulation de dilation capillaire, au fonctionnement des neurones notamment à ceux de la mémoire, dans la fécondation de l’ovule, dans la régulation des gènes (Favier,. A, 2003 ; Pincemail J et al, 2007).

Toxicité des radicaux libres sur l’organisme

Les radicaux libres sont impliqués dans plusieurs pathologies humaines comme facteur déclenchant ou associé à des complications. En effet, les radicaux libres interagissent avec de nombreux substrats biologiques tels que les protéines, les acides nucléiques, les lipides etc.

Dommages oxydatifs sur les protéines et acides aminés

L’oxydation des protéines et des acides aminés par les ERO aboutit à la formation de produits carbonylés et hydroxylés. Les acides aminés soufrés dont la cystéine et la méthionine, les acides aminés basiques (arginine, leucine) et les acides aminés aromatiques tels que le tryptophane, la phénylalanine et la tyrosine sont plus particulièrement sensibles à ces phénomènes. Il existe différents types d’oxydation :
• Attaque directe : c’est la fragmentation des protéines et la formation de produits carbonylés. Ainsi, la fragmentation de l’arginine aboutit à la formation de semi-aldéhyde glutamique. Ces produits de fragmentation sont impliqués dans des maladies liées à des dysfonctionnements de neurotransmetteurs comme l’épilepsie
• Lipo-oxydation : c’est la réaction d’une protéine avec un aldéhyde produit au cours de la réaction de peroxydation lipidique.
L’accumulation de lipoprotéines oxydées au niveau de la paroi vasculaire et un dysfonctionnement endothélial sont notamment à l’origine de l’athérosclérose qui est une pathologie chronique d’évolution lente de l’intima des artères.
• Glyco-oxydation : les protéines vont se lier avec le glucose qui est sous forme aldéhydique. Les produits de réaction sont appelés produits de glycation avancée. Dans le cas du diabète, qui se traduit par une augmentation de la glycémie, les tissus sont, à terme, imprégnés de glucose entraînant ainsi une hyperproduction d’ERO par notamment la formation de produits de glycation avancée. Les ERO en excès vont alors altérer la paroi des vaisseaux et induire des complications vasculaires : micro et macro angiopathies (Pearl et al, 2007 ; Wong et al, 2003 ; Nadal, 2009).

Dommages oxydatifs sur les acides nucléiques

L’ADN constitue la mémoire de composition biochimique de tous les êtres vivants, il s’agit d’une molécule très sensible à l’action des radicaux libres.
En effet, cinq classes principales de dommages oxydatifs, médiès par •OH, qui peuvent être générées. Parmi elles, les bases oxygénées, les sites abasiques, des adduits intra-caténaires, des cassures de brins et des pontages ADN-protéines, peuvent ainsi induire des effets mutagènes ou l’arrêt de la réplication.
Les bases qui composent l’ADN particulièrement la guanine sont sensibles à l’oxydation qui peut être directe engendrant un grand nombre de bases modifiées : 8- oxo- guanine, 8- nitro guanine foramidinopyridimine, 8- oxo-adénine, formimido uracile, 5 hydroxy cytosine, 5-hydroxy méthyl uracile.
L’action des radicaux libres peut altérer la synthèse et la réplication de l’ARN (Logani, 1980 ; Hoff, 1991 ; Favier, 2003).

Dommages oxydatifs sur les lipides

Les lipides constituent la matière grasse des êtres vivants et parmi les lipides les acides polyinsaturés présentent les cibles privilégiées du radical hydroxyle.
En effet, le radical hydroxyle est capable d’arracher un hydrogène sur les carbones situés entre deux doubles liaisons des acides gras polyinsaturés (AGPI) : c’est la phase d’initiation. Le radical lipidique réagit avec une molécule d’oxygène pour former un radical peroxyde (ROO.), suffisamment réactif pour arracher un H+ à un AGPI voisin, propageant ainsi la réaction.
Il en résulte une altération de la fluidité membranaire qui conduit inévitablement à la mort cellulaire. Les peroxydes générés seront neutralisés par la glutathion peroxydase ou continueront à s’oxyder et à se fragmenter en aldéhydes (malodialdéhyde, 4-hydroxynonenal) dont les activités pro-athérogènes sont bien connues. (Atkin M.A ; Favier. A, 2003 ; Lefèvre, 1998)
Des différents dommages peuvent être induits par les radicaux libres sur les substrats biologiques. (Figure 2)

Stress oxydatif

Définition

Dans les conditions physiologiques, le métabolisme obligatoire de l’oxygène conduit à la formation d’espèces oxygénées réactives qui sont contrebalancées par des systèmes de défense susceptibles de contrôler leur niveau.
C’est dans ce contexte que le stress oxydant peut se définir comme une situation de déséquilibre dans laquelle l’organisme ne contrôle plus la présence excessive des radicaux oxygénés toxiques.
Ce déséquilibre peut avoir diverses origines, telles que la surproduction endogène d’agent pro-oxydants d’origine inflammatoire, un déficit nutritionnel en antioxydants ou même une exposition environnementale à des facteurs pro-oxydants (tabac, alcool, médicaments rayons ultraviolets, herbicides, ozone ambiante, métaux toxiques.) (Favier, 1997 ; Delattre, 2007).
Le stress oxydant est potentiellement impliqué dans le développement du vieillissement et les maladies associées au vieillissement, (maladies cardiovasculaires, neurodégenératives, cancer, asthme, diabète, dégénérescence maculaire…) (Haleng, 2007).

Maladies associées au stress oxydant

Maladies cardiovasculaires et stress oxydant

Les maladies cardiovasculaires désignent un ensemble de maladies atteignant le cœur et les vaisseaux et affectent l’irrigation du cœur par les artères coronaires. En effet, plusieurs facteurs de risque cardiovasculaires (tabagisme, alcool, hypertension artérielle, obésité …) provoquent la production de radicaux libres par la paroi vasculaire. Ainsi, l’athérosclérose en est un exemple, il a comme origine l’oxydation ménagée des lipoprotéines de basse densité (LDL) qui passe la barrière endothéliale. Une faible quantité de ces LDL oxydée est capable d’être éliminée par les macrophages. A un niveau excessif, les LDL oxydés sont capables d’attirer les macrophages grâce à des signaux chimiques .Ces cellules phagocytent de plus en plus des LDL oxydées et finissent par s’accumuler dans les vaisseaux initiant ainsi l’athérogènése.
Le stress oxydant intervient largement dans les phénomènes de l’ischémie réperfusion. L’ischémie désigne une situation où un organe ou un tissu est insuffisamment irrigué en sang et la réperfusion suit l’ischémie et provoque une hypoxie c’est-à-dire une carence en oxygène.
Ce stress est responsable d’arythmies réperfusion et du phénomène de sidération myocardique (dysfonctionnement myocardique transitoire succédant l’ischémie après la reperfusion) (Heistad, 2006 ; Artigou, 1992 ; Favier .A 2003).

Cancer et stress oxydant

De nombreuses études montrent la place prépondérante du stress oxydant dans l’initiation et le développement du cancer. L’étape d’initiation semble résider dans l’oxydation des bases nucléiques. Ainsi les dégâts induits par les radicaux libres sont à l’origine de mutations et de cassures de l’ADN qui peuvent être réparées soit par excision de base soit par excision de nucléotides couplés ou non de la transcription. En revanche si les systèmes de réparation sont saturés ou déficients ceci aboutit à la carcinogenèse (Cadet, 2002).
En effet, des dérivés de l’oxydation de l’ADN signant un stress oxydant sont retrouvés dans le sang et des tissus des cancéreux (Malins et Haimanot, 1997).

Maladies neurodégénératives et stress oxydant

Ce sont des maladies caractérisées par la mort de plusieurs neurones, cependant la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer sont les plus rencontrées. Ces deux maladies citées ont une forte incidence dans la population âgée.
En effet, le tissu nerveux est très riche en lipides et mitochondries ce qui le rend sensible à la peroxydation et dans ces cas de troubles neurodégenératives, les radicaux libres sont en plus grande quantité et sont susceptibles de provoquer la mort des neurones.
Dans la maladie de Parkinson, une diminution de la quantité du glutathion réduit (GSH) et de l’activité du complexe I de la chaine mitochondriale a été rapportée. (Di Monte, 1992 ; Schapira, 1989)
Dans la maladie d’Alzheimer, la neurodégénérescence est causée par les dépôts de plaques dues à l’accumulation de peptides amyloïdes béta (Aβ). Ce peptide provient d’une protéine transmembranaire dite APP (amyloïde protein precuseur).
Ainsi, l’implication du stress oxydant est montrée par plusieurs auteurs avec une augmentation de la péroxydation lipidique et l’oxydation de l’ADN, et les radicaux libres peuvent également oxyder l’APP entrainant son dépôt et son agrégation (Smith, 1995 ; Mecocci ,1994).

Diabète et stress oxydant

Le diabète se traduit par une augmentation du glucose sanguin qui va entraîner l’activation de différentes voies dont la formation de produits de glycation avancés qui aboutissent à un stress oxydant à long terme. Les défenses antioxydantes sont diminuées et les réactions pro-oxydantes augmentées (production d’espèces réactives de l’oxygène, oxydation des lipides…). Cela va induire une destruction des cellules béta du pancréas, cellules sécrétrices d’insuline, ainsi qu’une altération de l’action de l’insuline qui vont provoquer une augmentation de glucose et donc du diabète (Bonnefont-Rousselot ,2004).

Antioxydants

Définition

Un antioxydant est une substance qui, à faible concentration, prévient ou retarde significativement l’oxydation d’un substrat. Ils ont pour rôle d’empêcher la formation de radicaux libres, de permettre leur élimination ou bien de réparer les dégâts causés par les radicaux libres (Halliwell, 1990).
Il existe différentes sortes d’antioxydants : des enzymes, des facteurs de transcription, des composés de bas poids moléculaire piégeant les radicaux libres. Parmi ces derniers, sont retrouvés le glutathion, les vitamines (A, C, E), les polyphénols, les oligo-éléments comme le sélénium (Se), le zinc (Zn) ou le cuivre (Cu) mais aussi des protéines transportant le fer (la transferrine) ou le mettant en réserve (la ferritine) (Halliwell ,1990 ; Pietta, 2000).
Ainsi, l’organisme dispose de différents systèmes de protection :
 Des systèmes de protection endogènes comprenant les systèmes enzymatiques et non enzymatiques.
 Des systèmes de protection exogènes.

Antioxydants endogènes enzymatiques

Catalase

La catalase (CAT) est une enzyme héminique, c’est-à-dire qu’elle possède un atome de fer qui participe à la fabrication de l’hème. Elle est majoritairement retrouvée dans les hépatocytes, les érythrocytes et les cellules rénales
Cette enzyme, localisée dans les peroxysomes, catalyse la dismutation de H2O2 en eau et en oxygène moléculaire (Valko A. et al 2006 ; Bah F. 2012) 2H2O2 Catalase 2H2O + O2

Superoxydes dismutases (SOD)

Ce sont des métallo-enzymes qui catalysent la dismutation de l’anion .- superoxyde en deux produits : l’oxygène moléculaire et le peroxyde d’hydrogène : 2H+ +2O2SOD H2O2 + O2
Elles sont présentes dans la majorité des organismes vivants et chez les eucaryotes, ce sont des enzymes ubiquitaires.
Il existe plusieurs superoxydes dismutases (SOD) qui diffèrent par leur cofacteur (manganèse, cuivre ou zinc), leur structure et leur localisation cellulaire (Valko, 2006 ; Mc Cord J. 2000 ; Redler, 2012).

La Glutathion peroxydase

C’est une enzyme qui constitue l’un des plus importants systèmes enzymatiques de protection car elle permet non seulement de détoxifier le peroxyde d’hydrogène, mais d’autres hydoxyperoxydes résultant de l’oxydation des acides gras.
La glutathion peroxydase se trouve dans le cytoplasme et dans les mitochondries, elle nécessite la présence de deux co- facteurs importants: le glutathion réduit et le sélénium.
En présence de deux molécules de glutathion sous forme réduites le glutathion peroxydase catalyse la transformation de peroxyde d’hydrogène en deux molécules d’eau (Valko A. 2006 ; Jacques B. 2004).
ROOH + GPx-Se- + H+ ROH + GPx-SeOH
GPx-SeOH + GSH GPx-Se-SG + H2O
GPx-Se-SG + GSH GPx-Se- + GSSG + H+
ROOH + 2 GSH GSSG + ROH + H2O

Antioxydants exogènes

Vitamines

Vitamine A

Ce terme regroupe les rétinoïdes et les provitamines A aussi appelées caroténoïdes. Ces derniers sont majoritairement connus comme étant des précurseurs de la vitamine A tels que le β-carotène. Les caroténoïdes sont de puissants agents anti radicalaires qui neutralisent tant des espèces électroniquement que chimiquement actives. Ils ont également un rôle de protection vis-à-vis des réactions de photosensibilisation. En fonction de la concentration en caroténoïdes, leurs effets sont différents : à faible concentration, ils ont une action antioxydante alors qu’à plus forte concentration, ils se comportent comme des agents pro-oxydants (Valko et al. 2006).

Vitamine C

La vitamine C ou acide ascorbique est hydrosoluble et considérée comme étant l’anti- oxydant naturel le plus puissant. Les aliments ayant la plus grande teneur en vitamine C sont les agrumes, les kiwis et les légumes.
Présente sous sa forme ascorbate, elle piège les radicaux peroxyles en phase aqueuse avant qu’ils initient la réaction de peroxydation lipidique protégeant ainsi les membranes et les lipoprotéines.
La vitamine C peut avoir un effet pro-oxydant et ainsi se lier avec des ions métalliques dont Fe3+ pour le réduire en Fe2+ qui pourra ensuite catalyser différentes réactions dont celle de Fenton : + Fe2+→ OH• + Fe3++ . OH générant ainsi de nouvelles ERO (Gulcin 2012 Valko, 2006).

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : Synthèse bibliographique
Chapitre I : radicaux libres et stress oxydant
I. Généralités sur les radicaux libres
I.1 Définition des radicaux libres
I.2 Nature et origines des radicaux libres
I.3 Origine des radicaux libres
I.4 Rôle physiologique des radicaux libres
I.5 Toxicité des radicaux libres sur l’organisme
I.5.1 Dommages oxydatifs sur les protéines et acides aminés
I.5.2 Dommages oxydatifs sur les acides nucléiques
I.5.3 Dommages oxydatifs sur les lipides
II Stress oxydatif
II. 1 Définition
II.2 Maladies associées au stress oxydant
II.2.1 Maladies cardiovasculaires et stress oxydant
II.2.2 Cancer et stress oxydant
II.2.3 Maladies neurodégénératives et stress oxydant
II.2.4 Diabète et stress oxydant
Chapitre II : Antioxydants
I. Définition
I. Antioxydants endogènes enzymatiques
II.1 Catalase
II. 2 Superoxydes dismutases (SOD)
II.3 La Glutathion peroxydase
III. Antioxydants exogènes
III.1.Vitamines
III.1.1 Vitamine A
III.1.2 Vitamine C
III.1.3 Vitamine E
III.2 Oligo-éléments
III.2 .1 Cuivre
III.2.2 Sélénium
III.2.3 Zinc
III.2.4 Phénols
Chapitre III : Etude du Mangifera indica
I .Etude botanique du Mangifera indica
I.1 Classification
I.2Variétés de mangue
I.3 Répartition géographique
I.4 Description Botanique
II. Composition chimique de la mangue
III. Donnés pharmacologiques et utilisations de la mangue
Chapitre IV : Les méthodes d’évaluation de l’activité antioxydante
1. La méthode du DPPH.
1I.1 Principe
2. La méthode de l’ABTS (acide 2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonique)
Deuxième partie : Travail expérimental
I. Cadre de l’étude
II. Matériel
II.1 Matériel expérimental
II.2 Réactifs
II.3 Matériel végétal
III. Méthodes
III.1 Extraction
III.2 Screening phytochimique
III.2.1 Caractérisations des phénols
III.2.2 Caractérisation des tanins catéchiques ou condensés
III.2.3 Caractérisation des tanins hydrolysables
III.2.4 Caractérisation des flavonoïdes
III.2.5 Caractérisation des alcaloïdes
III.2.6 Caractérisation des saponosides
III.2.7 Caractérisation par chromatographie sur couche mince (CCM)
III.2.7.1 Caractérisation des flavonoïdes
III.2. 7.2 Caractérisation des alcaloïdes
III.3. Dosage des composés phénoliques totaux (PPT)
III.4 Evaluation de l’activité antioxydante
III.4.1 Méthode spectrophotométrique au DPPH
III.4.1.2 Expression des résultats
III.4.2 Méthode spectrophotométrique à l’ABTS+.
III.4.2.1 Protocole
III.4.2.2 Expression des résultats
IV. Résultats
IV.1 Extraction
IV.2. Screening phytochimique
IV.2.1 Caractérisation des phénols
IV.2.2 Caractérisation des tanins condensés ou catéchiques
IV.2.3 Caractérisation des tanins hydrolysables
IV.2.4 Caractérisation des flavonoïdes
IV.2.5 Caractérisation des alcaloïdes
IV.3 Dosage des composés phénoliques totaux
IV.4. Evaluation de l’activité antioxydant
IV.4.1 Evaluation de l’activité antioxydante par la méthode du DPPH
IV.4.2 Evaluation de l’activité antioxydante par la méthode de l’ABTS
V. Discussion
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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