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LES RADICAUX LIBRES
Les radicaux libres sont des atomes ou des molécules portant un électron non apparié. Cette propriété rend ces éléments très réactifs du fait de la tendance de cet électron à se réapparier, déstabilisant ainsi d’autres molécules. Les molécules ainsi transformées deviennent à leur tour d’autres radicaux libres et initient ainsi une réaction en chaîne. L’oxydation des acides gras constitutifs des phospholipides membranaires est l’une des éventualités apparaissant au cours de telles réactions.
Les principaux radicaux libres rencontrés en biologie sont :
– l’anion superoxyde O2 ˉ
– le radical hydroxyle ˙OH
– oxygène singlet ¹O₂
– le monoxyde d’azote NO
– le peroxyde d’hydrogène H2O2
– le nitroxyde NOO
– le peroxynitrite ONOO
– le radical peroxy ROO
Des radicaux libres sont produits par un grand nombre de mécanismes tant endogènes qu’exogènes. Certaines de ces productions sont volontairement programmées par l’organisme à des fins de défense ou d’envoi des signaux. Les sources de radicaux libres sont :
a) La mitochondrie : elle est la source de production majeure d’O2 ˉ dans la cellule intacte.
Dans les conditions physiologiques, la formation de ce radical est liée à l’activité physique et par lá même à l’intensité d’oxygénation. Cette production peut également s’intensifier lorsque interviennent des désordres mitochondriaux, génétiques, inflammatoires (effet du TNF-a) ou nutritionnels (carence en ubiquinone).
b) L’inflammation : elle est une source importante de radicaux oxygénés produits directement par le complexe enzymatique NADPH oxydase des cellules phagocytaires activées.
Ce mécanisme lorsqu’il est contrôlé est capital dans la lutte anti- infectieuse car il permet la phagocytose des bactéries et corps étrangers. De plus les cellules inflammatoires et immunes peuvent produire des cytokines comme le TNF-α qui est capable de faire produire des radicaux libres par les mitochondries des cellules cibles.
c) Plusieurs autres systèmes enzymatiques produisent des radicaux libres au cours de réactions biochimiques (xanthine oxydase, hème oxygénase, cytochrome P450…). Une autre espèce radicalaire le monoxyde d’azote (ou NO˙) est elle aussi produite par des systèmes enzymatiques que sont les différentes NO Synthétases (ou NOS) à des fins de médiation cellulaire. Rappelons que la production concomitante dans un même site de NO et de superoxyde s’avère très dommageable en donnant naissance au radical peroxynitrite.
d) les mécanismes de cycles rédox : ils sont produits dans l’organisme par l’oxydation de molécules comme les quinones. Ces différentes molécules endogènes ou exogènes (ascorbate, glutathion réduit, adrénaline, flavines) réagissent spontanément avec l’O2 et sont ainsi oxydées conduisant à la formation de O2 ¯. Ce mécanisme est souvent mis en cause pour expliquer la toxicité de l’alcool, des résidus de la fumée de cigarette, ou de certains médicaments (chloroquine, adriamycine, acetaminophène), mais il existe aussi pour des composés endogènes comme le lévulinate et surtout les catécholamines. Ce dernier mécanisme amplifié par les métaux, fait l’objet de recherches actuelles sur l’origine de la maladie de Parkinson. Les O2 ˉ sont également produits lors de la formation de méthémoglobine à partir d’oxyhémoglobine.
e) Les métaux toxiques (chrome, vanadium, cuivre) et le fer libre (existant lors de surcharges générales ou localisées) : ils génèrent en présence de peroxyde d’hydrogène (H2O2) des radicaux hydroxyles très réactifs par une réaction appelée réaction de Fenton. Les particules inhalées telles que l’amiante et ou la silice sont aussi des sources de radicaux par la phagocytose exacerbée qu’ elles déclenchent et aussi car elles sont recouvertes de sels de fer en surface.
f) Les rayonnements sont par différents mécanismes des sources de radicaux, qu’il s’agisse des rayons ionisants X ou gamma, ou des rayons ultraviolets capables de produire des anions superoxydes ou de l’oxygène singulet après activation de photosensibilisants (Favier A., 2003).
LES METHODES D’ETUDES DE L’ACTIVITE ANTI-OXYDANTE
Il existe différentes méthodes pour déterminer le potentiel antioxydant de produits alimentaires, actifs, ingrédients, etc. Quatre types d’analyses peuvent être proposés : le test TEAC (Trolox Equivalent Antioxydant Capacity) ⁄ ABTS+Decolorization Assay, le test DPPH (1,1 diphenyl-2-picryl hydrazyl), le test FRAP (Ferric réduccing antioxydant power) et le test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). Les antioxydants peuvent réduire les radicaux primaires par deux mécanismes : par transfert d’électron singulet ou par transfert d’atome d’hydrogène. Les méthodes ABTS+Decolorization Assay (ou TEAC) et DPPH jouent sur le transfert d’électron singulet, alors que la méthode ORAC joue sur le transfert d’un atome d’hydrogène.
Les méthodes ABTS et DPPH sont couramment utilisés pour analyser les extraits de plantes et de fruits. Ce sont des méthodes anciennes qui, une fois standardisées, permettent des comparaisons de résultats. La méthode ORAC est plus récente et est applicable sur quasiment toutes les matrices (extraits végétaux, aliments, plasma sanguin etc.), aussi bien sur des composés hydrophiles que lipophiles. Le test ORAC propose une mesure largement standardisée.
Test du DPPH
Le DPPH (1 ,1 diphényl -picryl-hydrazine) est un radical libre qui absorbe à 517 nm. En présence d’une substance antiradicalaire (anti-oxydante), les électrons non appariés sont capturés pour donner un produit qui absorbe à 470 nm, ce qui provoque une baisse de l’absorption à 517 nm (Kansci et al., 2003). La mesure de la décroissance de la coloration violette au cours du temps permet de déterminer la CE50, la concentration avec laquelle 50% de la coloration du DPPH est perdue.
Test ABTS
L’activité anti-radicalaire est basée sur décoloration (mesurée à 734 nm) d’un cation radiculaire stable, ABTS˙⁺ (2,2’-azinobis-[acide 3-ethylenzothiazoline-6- sulfonique]) de coloration bleu-verte en le transformant en ABTS⁺ incolore, par piégeage d’un proton par l’antioxydant. Une comparaison est faite avec la capacité du Trolox (analogue structural hydrosoluble de la vitamine E) à capturer ABTS⁺. La décroissance de l’absorbance causée par l’antioxydant reflète la capacité de capture du radical libre. La capacité antioxydante, exprimée en équivalent Trolox (TEAC) correspond donc à une concentration de Trolox ayant la même activité que la substance à tester à une concentration donnée. La méthode standardisée, avec un temps fixe d’incubation, peut dans certains cas, engendrer une sous estimation de la valeur obtenue. On parle alors de capacité antioxydante relative. Dans ce cas, on peut envisager de laisser se dérouler la réaction jusqu’au bout et recalculer la valeur TEAC (Leong et Shui, 2002).
Test FRAP
La méthode de FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) est basée sur la capacité des extraits à réduire l’ion ferrique (Fe³⁺) en ion ferreux(Fe²⁺) (Thaipong et al., 2006).
Test ORAC
Cette méthode est basée sur la décroissance de fluorescence de la fluoresceine en présence d’un oxydant chimique l’AAPH (un radical peroxyl libre stable). Le produit à tester peut être capable de protéger la fluoresceine et réduire la vitesse de dégradation de la fluorescence. Il possède alors un pouvoir antioxydant. La méthode est réalisée en microplaques dans lesquelles nous mesurons, en parallèle, le déclin de la fluoresceine au cour du temps en présence de concentrations croissantes de Trolox (une molécule de référence, analogue structural hydrosoluble de la vitamine E), et des échantillons à tester à différentes concentrations. Le but est d’obtenir une réponse comparable à celle de la gamme (Thaipong et al., 2006).
On peut aussi, après traitement des données, calculer l’équivalent Trolox. La méthode faisant intervenir une cinétique, la mesure de la capacité se fait par l’intermédiaire du calcul des aires sous la courbe. C’est la seule méthode qui combine à la fois le pourcentage d’inhibition de la réaction d’oxydation et la longueur dans le temps de cette inhibition en une seule mesure. Elle mesure d’une globale de la capacité antioxydante. L’avantage majeur du test ORAC est de proposer une mesure standardisée et largement acceptée. Remarque : il existe souvent des différences de valeur entre les méthodes, selon que les sources de radicaux libres sont différentes, et que les antioxydants répondent différemment aux méthodes de mesures. Selon les matrices testées, l’une ou l’autre méthode est applicable. Par exemple, pour les extraits végétaux, les 4 tests sont applicables. En revanche, pour du plasma sanguin, la méthode ORAC est la plus couramment rencontrée dans le corps humain. La valeur en est de fait plus sigificative.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE :ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I : LES ANTI-OXYDANTS
I.1. Les moyens de défense endogènes
I.1.1. Les systèmes enzymatiques
I.1.2. Les systèmes non enzymatiques
I.2. Les moyens de défense exogènes
CHAPITRE II : LES RADICAUX LIBRES
CHAPITRE III : LES METHODES D’ETUDES DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE
III.1. Test du DPPH
III.2. Test ABTS
III.3. Test FRAP
III.4. Test ORAC
CHAPITRE IV : PRESENTATION DES PLANTES A ETUDIER
IV.1. Combretum micranthum G.Don. (Combretaceae)
IV.1.1 Classification et description botanique
IV.1.1.1. Synonymes et noms vernaculaires
IV.1.1.2. Description botanique
IV.1.2. Répartition géographique
IV.1.3. Chimie de la plante
IV.1.4. Pharmacologie et usages
IV.2. Combretum glutinosum Perr.ex DC
IV.2.1. Classification et description botanique
IV.2.1.1. Synonymes et noms vernaculaires
IV.2.1.2 Description botanique
IV.2.2. Répartition géographique
IV.2.3. Chimie de la plante
IV.2.4. Pharmacologie et usage
IV.3 Combretum aculeatum Vent
IV.3.1.Classification et description botanique
IV.3.1.1. Synonymes et noms vernaculaires
IV.3.1.2 Description botanique
IV.3.2. Répartition géographique
IV.3.3. Chimie de la plante
IV.3.4. Pharmacologie et usage
IV.4. Guiera senegalensis J.F.Gmel
IV.4.1. Classification et description botanique
IV.4.1.1.Synonymes et noms vernaculaires
IV.4.1.2. Description botanique
IV.4.2. Répartition géographique
IV.4.3. Chimie de plante
IV.4.4. Pharmacologie
IV.4.5 Toxicité
DEUXIEME PARTIE : ETUDE DE L’ACTVITE ANTIOXYDANTE
CHAPITRE I : MATERIELS ET METHODES
I.1. Matériels et réactifs
I.1.1. Matériel végétal
I.1.2. Matériel de laboratoire
I.1.3. Réactifs
I.2. Méthodes d’études
I.2.1. Extraction
I.2.2. Activité anti-oxydante
I.2.2.1. Protocole expérimental
I.2.2.2. Expression des résultats et analyses statistiques
CHAPITRE II : RESULTATS
II.1. Rendements d’extraction
II.2. Dosage de l’activité antioxydante
II.2.1. Combrethum micranthum
II.2.2 Combretum glutinosum
II.2.3 Guiera senegalensis
II.2.4. Combretum aculeatum
II.2.5. Acide ascorbique
CHAPITRE III : DISCUSSION
III.1. Rendement d’extraction
III.2. Activité antioxydante
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
