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Les Métaux dans la Cellule / Le Cuivre et le Mercure
Les métalloprotéines
Les métaux jouent des rôles fondamentaux chez l’ensemble des êtres vivants où ils sont complexés à des molécules biologiques : le cobalt dans la cobalamine (vitamine B12) essentielle au métabolisme des acides nucléiques, le magnésium dans la chlorophylle des organismes photosynthétiques, le cuivre dans l’hémocyanine des mollusques et des arthropodes, le fer dans l’hémoglobine des mammifères etc.
Environ un tiers des protéines connues à ce jour contiennent un cofacteur métallique. La plupart d’entre elles sont des métalloenzymes indispensables à la survie de la cellule, telles que les complexes protéiques de la chaîne respiratoire de la mitochondrie où l’on trouve notamment de nombreux centres Fe-S, du fer associé à des hèmes, ainsi que du cuivre localisé dans la cytochome c oxydase par exemple. Malgré les rôles fondamentaux que peuvent remplir les métalloprotéines, les mécanismes moléculaires de leur biosynthèse et de leur structuration demeurent mal connus.
En effet, le repliement d’une métalloprotéine dans la cellule nécessite plusieurs étapes après la synthèse de la chaîne polypeptidique : séquestration du métal par un facteur cellulaire, reconnaissance de l’apoprotéine cible, dépliement de l’apoprotéine, insertion du métal au bon endroit dans la protéine, et enfin, renaturation de l’holoprotéine dans une conformation fonctionnelle et active. Le problème posé par la mise en œuvre in vivo de la succession de ces étapes n’est pas trivial. Il l’est d’autant moins quand une protéine comme la Cu,Zn-superoxyde dismutase (ou SOD1) nécessite deux ions métalliques, ou quand la NADH déshydrogénase du complexe I de la chaîne mitochondriale compte 8 à 10 centres Fe-S soit jusqu’à 24 atomes de fer.
En outre, les concentrations intracellulaires en métaux s’avèrent finement régulées. Le maintien de l’homéostasie cellulaire des métaux est un processus de régulation extrêmement contrôlé et complexe. Les mécanismes de régulation de l’homéostasie qui interviennent interfèrent entre eux. Bien que certains métaux soient essentiels (Fe, Cu, Co, Mo etc), ils se révèlent particulièrement toxiques lorsqu’ils sont en excès. La cellule doit également pouvoir se défendre contre les métaux lourds non physiologiques comme le mercure et le cadmium. Les métallothionéines sont ainsi utilisées pour séquestrer l’excès de cuivre ou de zinc, mais aussi pour la détoxication de métaux non physiologiques tels que le cadmium [Inouhe et al., 1989].
Le cuivre
Un élément essentiel
Le cuivre est indispensable pour les eucaryotes et les procaryotes. C’est le troisième élément de transition le plus abondant dans les cellules, après le fer et le zinc. Les fonctions remplies par le cuivre sont liées à ses deux états de valence : Cu(I) et Cu(II). Les enzymes qui utilisent le cuivre comme cofacteur mettent à profit ces propriétés rédox pour le transport d’électron(s). Les centres cuivre(I) des cuproenzymes sont enfouis car contrairement au Cu(II) qui est stable en solution aqueuse neutre, le Cu(I) ne peut être maintenu en solution qu’à des pH très acides ou sous forme complexée. Ces métalloenzymes couvrent un spectre assez large de réactions, depuis le transfert d’électron(s) (par la cytochrome c oxydase par exemple) ou de dioxygène par l’hémocyanine, à la modification de substrats dans des réactions enzymatiques diverses (comme l’oxydation du p-diphénol en p benzosemiquinone par la laccase, la désamination oxydative de la lysine en allysine par la lysyl oxydase, ou encore l’oxydation du β-d-glucose en d gluconolactone par l’hexose oxydase).
Chez l’homme, c’est un oligoélement essentiel [Peña et al., 1999]. Des déséquilibres dans le métabolisme du cuivre conduisent à la maladie de Wilson ou au syndrome de Menkes [Vulpe et al., 1993, Bull et al., 1993, Bull et Cox, 1994]. Il est aussi impliqué dans des pathologies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique familiale, la maladie d’Alzheimer ou les encéphalopathies à prion [Waggoner et al., 1999]. Grâce à ses propriétés rédox, il intervient notamment dans la respiration cellulaire, l’homéostasie du fer, la protection contre le stress oxydant, la synthèse de pigments et de neurotransmetteurs, et la formation du tissu conjonctif [Bartnikas et Gitlin, 2001].
Un élément essentiel, mais toxique
Quand l’homéostasie cellulaire du cuivre est perturbée, du cuivre se retrouve libre dans le cytoplasme. Le terme «libre» signifie que le cuivre (ion Cu(I) ou Cu(II)) est à l’état de complexes aquo, où les seuls ligands sont les molécules H2O (aucune coordination par d’autres types de molécules). Ses propriétés rédox exploitées par la cellule deviennent alors la source de sa toxicité.
Le glutathion (GSH) est le principal thiol anti-oxydant d’origine non protéique dans les cellules eucaryotes et les procaryotes (sa concentration cytosolique est de l’ordre de 5 mM), sauf chez la plupart des bactéries Gram-positives qui utilisent d’autres thiols [Fahey et al., 1978]. Par exemple, le mycothiol a été identifié chez Mycobacterium bovis [Spies et Steenkamp, 1994], l’ovothiol A chez Leishmania donovani et Crithidia fasciculata [Steenkamp et Spies, 1994, Spies et Steenkamp, 1994], et l’U17 chez Streptomyces clavuligerus [Newton et al., 1995]. Ces molécules contiennent toutes une cystéine ou un dérivé thiolé. Le glutathion est un tripeptide (l-γ-glutamyll-cystéinylglycine) qui, lorsqu’il est oxydé, forme un pont cystine avec une seconde molécule de glutathion . C’est un ligand naturel du cuivre de la cellule qui participe à son transport, à sa distribution et à sa détoxication lorsqu’il est en excès. Dans ce cas, le glutathion transfère le cuivre aux métallothionéines (MT) [Freedman et al., 1989, Steinebach et Wolterbeek, 1994]. Chez la levure, l’expression des métallothionéines Cup1 et Crs5 est activée en réponse à des concentrations élevées de cuivre(I) [Labbé et al., 1997]. Cup1 et Crs5 séquestrent les ions Cu(I) jusqu’à ce que la cellule ait pu réguler leur concentration intracellulaire. L’espace intermembranaire des mitochondries permettrait également d’absorber une partie de l’excès de cuivre où il existe une fraction non négligeable du Cu(I) cellulaire, mais sous une forme indéterminée (non protéique et non liée au glutathion) [Cobine et al., 2004].
Un élément essentiel, mais jamais libre
In vitro, la plupart des métalloprotéines à cuivre peuvent facilement intégrer leur métal dans le milieu sans l’aide d’un facteur auxiliaire. Par exemple, SOD1 lie le cuivre in vitro avec une affinité très forte (KD ≈ 10⁻¹⁵ M). Néanmoins, in vivo, tandis que la concentration intracellulaire en cuivre est micromolaire (≈ 70 µM), SOD1 recquiert un facteur externe pour lier son ion Cu(I) [Rae et al., 1999, Lippard, 1999].
Rae et al. ont montré que dans une cellule de Saccharomyces cerevisiae, la concentration en cuivre libre est inférieure à 10⁻¹⁸ M, soit moins d’un atome de cuivre libre par cellule [Rae et al., 1999]. De plus, au cours de la vie d’une cellule, moins de 0.01% de la quantité totale de cuivre devient libre dans le cytoplasme [Rae et al., 1999]. Cette absence de cuivre libre peut s’expliquer par la présence d’une grande variété de sites de complexation du métal dans la cellule au sein de molécules cytosoliques (complexation faible ou forte, spécifique ou non spécifique). Aussitôt après son entrée dans la cellule, le cuivre(I) se lierait au glutathion puis serait transféré aux métallothionéines pour le stockage si nécessaire [Freedman et al., 1989].
La nécessité de chaperones à cuivre
La cellule se retrouve donc face à un problème de disponibilité du cuivre : d’une part, de nombreuses métalloprotéines nécessite du cuivre pour acquérir leur fonction, avec des localisations cellulaires variées (cytosol, mitochondries, membrane plasmique etc) ; d’autre part, il n’y a pas de cuivre libre car il est cytotoxique et facilement complexé par de nombreux agents cellulaires. Par conséquent, il existe des voies intracellulaires spécifiques au convoyage et à la compartimentation du cuivre jusqu’à ses protéines cibles.
Plusieurs études ont révélé chez S. cerevisiae et chez l’homme, la présence de diverses protéines solubles, cytosoliques, nécessaires à l’acheminement des ions Cu(I) vers les protéines cibles à travers la cellule [Pufahl et al., 1997, Valentine et Gralla, 1997, Portnoy et al., 1999]. Ces protéines délivrent le Cu(I) par des interactions de type protéine–protéine [O’Halloran et Culotta, 2000]. O’Halloran a nommé ces transporteurs métallochaperones [O’Halloran et Culotta, 2000]. Une métallochaperone diffère d’une chaperone moléculaire : une métallochaperone protège l’ion qu’elle transporte d’agents complexants cellulaires et elle le délivre à une protéine cible cuivre-dépendante, tandis qu’une chaperone moléculaire facilite le repliement d’une protéine [Rosenzweig, 2001].
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Table des matières
Introduction
1 Les Métaux dans la Cellule
1.1 Les métalloprotéines
1.2 Le cuivre
1.2.1 Un élément essentiel
1.2.2 Un élément essentiel, mais toxique
1.2.3 Un élément essentiel, mais jamais libre
1.2.4 La nécessité de chaperones à cuivre
1.2.5 Les métallochaperones dans Saccharomyces cerevisiae
1.2.5.1 Importation du cuivre dans la cellule
1.2.5.2 Acheminement du cuivre
1.2.6 Les métallochaperones à cuivre chez les autres organismes
1.3 Le mercure
1.3.1 Mécanismes de résistance dépendants de l’opéron mer
1.3.2 Mécanismes de résistance indépendants de l’opéron mer
1.4 Des métallochaperones pour d’autres métaux ?
2 Les Métallochaperones de la Famille d’Atx1
2.1 Des structures homologues
2.2 Des séquences homologues
2.3 Environnement du métal
2.3.1 Coordination du cuivre(I)
2.3.1.1 Coordination par Atx1
2.3.1.2 Coordination par CopZ chez Enterococcus hirae
2.3.1.3 Coordination par CopZ chez Bacillus subtilis
2.3.1.4 Coordination par Hah1
2.3.1.5 Coordination par ScAtx1
2.3.2 Coordination du mercure(II)
2.3.3 Quelle(s) coordination(s) in vivo ?
2.4 Les ATPases partenaires
2.5 Interaction(s) avec les ATPases
2.6 Modèle de transfert du métal de la métallochaperone à l’ATPase cible
3 Sélectivité de la Complexation des Métaux par les Métallochaperones
3.1 Bases de la sélectivité
3.2 Une sélectivité relative in vitro
3.2.1 Une protéine, différents métaux, différentes géométries
3.2.2 Une protéine, différents métaux, des géométries proches
3.2.3 Des protéines différentes, un métal, des géométries proches
3.3 Les déterminants de la sélectivité
3.3.1 Les ligands protéiques
3.3.2 La protéine
3.3.3 Le milieu intracellulaire : rôle dans la sélectivité
4 Objectifs de la Thèse
Conclusion
