Les métalloprotéases matricielles

Les métalloprotéases matricielles

Historique

En 1962, l’équipe de Gross et Lapierre isolait l’agent protéolytique responsable de la dégradation du collagène lors de la métamorphose de la queue du têtard et décrivait ainsi le premier membre d’une nouvelle famille de protéases, les métalloprotéases matricielles (MMP) . Depuis cette découverte historique, la famille s’est nettement agrandie et compte aujourd’hui 26 membres chez l’homme . Son nom provient de l’hypothèse, largement répandue, selon laquelle ces protéases sont capables de dégrader collectivement l’ensemble des composants protéiques de la matrice extracellulaire.

Les MMP sont ainsi décrites comme une large famille d’endopeptidases dépendantes du calcium et du zinc. Elles appartiennent à la sous famille des metzincines qui comprend également les astacines, les adamalysines (ADAM : A Disintegrin And Metalloproteinase et ADAMTS : A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs), les seralysines et les leishmanolysines . Les membres de cette famille se distinguent par une séquence signature HEXXHXXGXX(H/D) et la présence d’un atome de zinc catalytique. Cet atome de zinc est chélaté par les deux histidines mises en évidence dans la séquence signature. Un troisième chélatant peut se présenter sous la forme d’un aspartate ou d’une histidine selon les familles ; dans le cas des MMP, il s’agit d’une troisième histidine. Enfin, le glutamate de cette séquence signature participe à l’acte catalytique, l’hydrolyse d’une liaison peptidique, en jouant alternativement le rôle de base et d’acide général . Les metzincines sont elles-mêmes une sous famille de la famille des zincines .

La première classification historique des MMP tenait compte des substrats préférentiellement dégradés in vitro par chaque MMP, à mesure que celles-ci étaient découvertes. Dans cette classification originelle, la nomenclature reflétait alors le nombre d’années écoulées depuis l’identification du premier membre de cette famille . On distinguait quatre classes principales de MMP : les collagénases, les stromélysines, les matrylisines, et les gélatinases. Les MMP ne présentant pas de spécificité stricte pour la dégradation d’un substrat plutôt qu’un autre, cette dénomination, souvent basée sur l’identification d’un substrat principal, s’est vite retrouvée dépassée par l’élargissement du spectre des substrats dégradés. A cela s’ajoute une certaine redondance de l’activité protéolytique qui achève de rendre obsolète le modèle historique de classification des MMP. A titre d’exemple, le collagène est ainsi dégradé par les collagénases (MMP-1, 8, 13 et 18), mais aussi par les MMP-9 et 14.

Une recherche PubMED sur les termes « MMP » et « matrix metalloproteinase » permet de constater le formidable essor des travaux réalisés sur les MMP depuis le début des années 90. De nos jours, ce sont 3000 à 4000 articles en lien avec les MMP qui sont publiés chaque année et témoignent ainsi de l’intérêt toujours croissant de la communauté scientifique pour ces objets .

Architecture générale des MMP

Une structure modulaire 

D’un point de vue structural, les métalloprotéases peuvent être vues comme la succession de différents domaines et inserts. La démocratisation de la cristallographie à haute résolution et de la résonnance magnétique nucléaire (RMN) a permis d’obtenir la structure tridimensionnelle de douze des vingt-trois MMP connues chez l’homme. La structure du domaine catalytique de la MMP-1 a été résolue en premier par l’équipe de Lovejoy en 1994 . Pour les quatorze autres MMP, des structures modèles ont pu être obtenues grâce aux techniques de modélisation par homologie . La structure minimale commune à toutes les MMP s’articule autour d’un peptide signal (~ 20 résidus) permettant la secrétion des MMP, d’un pro-domaine (~ 80 résidus) obstruant l’accès au site actif de la protéase (et donc responsable de la forme latente inactive de la protéase) et enfin d’un domaine catalytique (~ 200 résidus) .

Les MMP se différencient par la présence (ou non) de domaines additionnels :
– un domaine hémopexine en position C-terminale. Connecté au domaine catalytique par une région charnière (H), il permet de moduler l’interaction entre les MMP et leurs inhibiteurs naturels, les TIMPS (Tissue Inhibitor pf Metalloproteinases), certaines molécules exprimées à la surface des cellules, mais aussi certains substrats. Le domaine hémopexine n’est rien de plus que la quadruple répétition d’un même motif protéique dont les première et dernière occurrences sont reliées par un pont disulfure,
– un domaine fibronectine (Fi) présent en triple exemplaire dans la séquence du domaine catalytique des gélatinases (MMP-2 et 9) et venant s’insérer dans le domaine catalytique,
– un motif de reconnaissance (Fu) des protéases à sérine « furin like » qui permet l’activation intracellulaire de ces MMP par les furines. Ce motif est situé entre le prodomaine et le domaine catalytique,
– un domaine transmembranaire (TM) de type I prolongé d’un très court domaine cytoplasmique (Cy),
– un domaine glycosylphosphatidylinositol (GPI) remplace chez les MMP-17 et 25 le groupement transmembranaire et leur permet de s’arrimer à la membrane (côté extracellulaire),
– un insert vitronectine,
– un domaine transmembranaire de type II (motif immunoglobulin-like, Ig-like) caractéristique de la MMP-23.

La combinaison de ces différents domaines permet de distinguer huit classes structurales de taille hétérogène :
– les MMP possédant seulement la structure minimale peptide signal / prodomaine / domaine catalytique : MMP-7 et 26,
– les MMP possédant en plus de la structure minimale, un domaine hémopexine : MMP-1, 3, 8, 10, 12, 13, 18, 19, 20, 22 et 27,
– les MMP qui présentent la structure minimale, un domaine hémopexine et un motif fibronectine : MMP-2 et 9,
– les MMP avec structure minimale, domaine hémopexine et domaine transmembranaire de type I : MMP- 14, 15, 16 et 24,
– les MMP qui en plus de la structure minimale possèdent un domaine hemopexine et un domaine de fixation à la membrane de type GPI : MMP-17 et 25,
– les MMP qui présentent un motif de reconnaissance à la furine en plus de la structure minimale et d’un domaine hémopexine : MMP-11 et 28,
– la MMP-21 qui possède un insert vitronectine,
– la MMP-23 avec son domaine transmembranaire de type II.

Eléments de structure des domaines catalytiques des MMP

Dans le contexte actuel de course au développement d’inhibiteurs à visée thérapeutique, il est essentiel de connaître finement la structure des sites actifs des MMP considérées. Ce n’est donc pas un hasard si la résolution de la première structure de MMP a été rapportée par une équipe du groupe pharmaceutique Merck et concernait un domaine catalytique (celui de la MMP-1). Désormais, ce sont plus de 160 structures de domaines catalytiques de MMP en complexe avec différents ligands qui sont disponibles dans la PDB (Octobre 2015).

Malgré une homologie de séquence parfois assez faible, la topologie globale des domaines catalytiques des différentes MMP est extrêmement bien conservée, comme en atteste la superposition de leurs structures tridimensionnelles . La seule entorse à cette règle générale concerne une boucle délimitant la partie basse du site actif : la boucle S1’ .

Du reste, le domaine catalytique se présente sous la forme d’un monomère globulaire d’environ 35 Å de diamètre et constitué de cinq feuillets β (un anti-parallèle et quatre parallèles) et trois hélices α, éléments de structure secondaire connectés par différentes boucles . Trois atomes de calcium et un atome de zinc stabilisent la structure et assurent son bon repliement. Un deuxième atome de zinc se situe dans le site actif et participe à l’acte catalytique. Il est chélaté par trois histidines , et, dans la protéine libre, par une molécule d’eau. A l’état de zymogène (pro-MMP), le zinc est également chélaté par la fonction thiol d’une cystéine du prodomaine qui prend ainsi la place de cette molécule d’eau . Un résidu glutamate participe à la réaction d’hydrolyse du substrat et surplombe le zinc catalytique. Cet acide aminé est supporté par l’hélice α délimitant le fond du site actif. Les substrats peptidiques des MMP se fixent aux MMP par le biais d’une gorge peu profonde traversant le domaine catalytique d’est en ouest (en jaune, nomenclature de Bode). Dans le complexe MMP/substrat, le zinc catalytique est alors situé en face de la liaison scissile prête à être hydrolysée. Les chaînes latérales des résidus s’insèrent de part et d’autre dans les différents sous-sites de liaison . A l’ouest du zinc catalytique, les sites sont dits « non primes » et désignés par la séquence S1, S2, …, Sn. A l’est, on parle des sous-sites « primes » S1’, S2’,…, Sn’. De la même manière, les groupements fonctionnels du substrat ou de l’inhibiteur sont répertoriés de P1 à Pn et de P1’ à Pn .

Table des matières

Introduction
Fin de chapitre
Chapitre I. Synthèse bibliographique
I. Les métalloprotéases matricielles
I. A. Historique
I. B. Architecture générale des MMP
Une structure modulaire
Eléments de structure des domaines catalytiques des MMP
I. C. Rôle fonctionnel et intérêt thérapeutique
Rôle physiologique
Mécanisme d’action
Intérêts et défis thérapeutiques
I. D. La métalloélastase du macrophage (MMP-12)
Historique
Implications pathologiques
II. Régulation de l’activité protéolytique des MMP
II. A. Activation et régulation in vivo des MMP
II. B. Inhibiteurs naturels
II. C. Inhibiteurs synthétiques
Historique
Une première génération puissante mais peu sélective
Une seconde génération qui s’affranchit des résidus peptidiques
Une troisième génération d’inhibiteur où l’on sort du paradigme de l’hydroxamate
III. Importance des effets de protonation lors de l’interaction protéine-ligand
III. A. Origines des effets de protonation
Perturbations électrostatiques
Changements conformationnels
III. B. Mise en évidence expérimentale
Méthodes atomistiques
La Calorimétrie à Titration Isotherme depuis le prisme du formalisme de Baker et Murphy
III. C. Calorimétrie, mesure de pKa et quantification énergétique : exemples dans la littérature
IV. L’interaction MMP-12/RXP470.1
IV. A. Vers l’identification du RXP470.1, un inhibiteur sélectif de la MMP-12
IV. B. Efficacité in vivo du RXP470.1
IV. C. Mise en évidence d’un phénomène de protonation84
Identification du résidu protoné lors de la liaison du RXP470.1
Protonation d’un deuxième résidu à pH basique
Chapitre II. Objectifs
Fin chapitre
Chapitre III. Résultats
I. La lysine 241 : un résidu protonable à pH basique
I. A. Identification du résidu protonable à pH basique
Hypothèses de travail
Validation du rôle de la Lys241
I. B. Discussion et conclusion
II. Implications énergétiques de la liaison RXP470.1/ MMP-12h F171D K2421A
II. A. Mise en évidence d’un shift de pKa significatif
II. B. Détermination et dissection du profil thermodynamique de la liaison du RXP470.1
Effet du pH sur les profils thermodynamiques de la liaison du RXP470.1
Coût enthalpique de la protonation du Glu219
II. C. Détermination des paramètres intrinsèques de liaison
II. D. Discussion
II. E. Conclusion
III. Effet du groupement chélatant du Zinc
III. A. Effet sur l’affinité vis à vis de la MMP-12h
III. B. Effet sur les profils thermodynamiques
III. C. Etude des structures cristallines
III. D. Effets sur les profils de sélectivité
III. E. Discussion
Fin de chapitre
Chapitre IV. Discussion générale
Fin de chapitre
Chapitre V. Matériel et Méthodes
I. Synthèse des inhibiteurs de MMP
II. Production et Purification de la MMP-12
II. A. Production
Constructions utilisées – mutagenèse dirigée
Amplification de vecteur
Vérification de la séquence
Expression
II. B. Purification et repliement
III. Caractérisation de l’activité enzymatique
III. A. Principe général
III. B. Test d’activité
III. C. Dosage de protéine active
III. D. Constante d’inhibition (Ki)
IV. Calorimétrie à Titration Isotherme
IV. A. Introduction
Champ d’utilisation
Principe de fonctionnement
IV. B. Déroulement d’une mesure d’interaction
Détermination des concentrations
Préparation des solutions
Titration
Analyse
IV. C. Effets environnementaux : tampon, pH et température
Effet tampon
Effet pH
V. Cristallographie aux rayons X
V. A. Cristallogenèse
Formation et croissance d’un cristal
Méthodes de cristallisation
Paramètres utilisés
V. B. Congélation des cristaux
V. C. Récolte des données
Principe général de la diffraction
Montage expérimental
V. D. Résolution des structures
Traitement des données brutes de diffraction
Construction
Bibliographie
Fin de chapitre
Annexes

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