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Cibles biologiques du stress oxydatif
Effets sur les lipides
Les molécules les plus susceptibles de subir une oxydation sont les lipides. Les acides gras polyinsaturés peuvent facilement subir une attaque par le radical hydroxyle OH°, capable d’arracher un hydrogène sur les carbones situés entre deux doubles liaisons pour former un radical diène conjugué, oxydé en radical peroxyle. Cette réaction appelée peroxydation lipidique forme une réaction en chaîne car le radical peroxyle formé se transforme en peroxyde au contact d’un autre acide gras, qui forme alors un nouveau radial diène conjugué. La peroxydation des acides gras insaturés comme l’acide arachidonique, mène à la formation d’isoprostanes, dont le niveau dans le plasma ou les urines est utilisé pour évaluer l’état de stress oxydatif d’un organisme (Cracowski, 2004). L’attaque oxydative des lipides entraine aussi la formation de dérivés aldéhydes, tel que le 4-hydroxynonenal, capables de s’attacher aux protéines et d’altérer leur fonction (Pisoschi and Pop, 2015).
L’attaque des lipides concerne à la fois les lipides circulants et les phospholipides membranaires. L’attaque des lipides circulants aboutit à la formation de LDL (Low-Density Lipoproteins) oxydées qui participeront à la formation du dépôt lipidique de la plaque d’athérome impliquée dans les maladies cardiovasculaires. L’attaque des phospholipides membranaires quant à elle perturbe la fluidité de la membrane, altérant le fonctionnement de multiples récepteurs et transporteurs, et donc la transduction de signaux cellulaires (Palipoch and Koomhin, 2015; Liguori et al., 2018).
Effets sur les protéines
Les ERO sont capables d’oxyder le squelette des protéines, ainsi que leurs chaines latérales, ce qui peut fragmenter les protéines ou entrainer des défauts de repliement, menant à une perte d’activité. Tous les acides aminés sont susceptibles d’être oxydés, en particulier les cystéines et les méthionines (Headlam and Davies, 2004). La plupart de ces oxydations sont réversibles sous l’action d’oxydoréductases, telles que la glutathion réductase. Certaines oxydations peuvent cependant être irréversibles, comme la formation de S-carboxyméthylcystéine ou la S-(2-Succinyl)cystéine, ces réactions impliquant la formation de liaison covalentes (Alderson et al., 2006). Les acides aminés aromatiques sont aussi susceptibles d’être oxydés. Le radical hydroxyle peut par exemple oxyder la tyrosine, formant ainsi une dityrosine, ce qui génère en même temps une espèce réactive de l’azote, la 3-nitrotyrosine (Pisoschi and Pop, 2015).
Effets sur l’ADN
L’attaque radicalaire de l’ADN est quotidienne puisque le nombre de lésions se formant chaque jour dans une cellule est estimé à 104, que ce soit au cours du métabolisme cellulaire normal ou par des réactions chimiques spontanées (Lindahl, 1993). Cinq principaux types de dommages peuvent être induits par les ERO : des modifications de bases, des sites abasiques, des adduits intra-caténaires, des pontages ADN-protéines et des cassures de brins de l’ADN (Figure I.4) (Cadet et al., 1999). Les bases de l’ADN sont particulièrement sensibles à l’oxydation, entrainant par exemple la formation de 8-oxoguanine, de Thymine gycol ou de 5-hydroxy-methyl-uracile (Figure I.4, Tableau I.1). Le stress oxydatif peut aussi attaquer la liaison entre le sucre et le désoxyribose, créant un site abasique, ou cibler le sucre lui-même, produisant une coupure de chaine simple brin. Les protéines pouvant aussi être modifiées, celles-ci forment des pontages lorsqu’elles entrent en contact avec l’ADN. Enfin la peroxydation des lipides génère des aldéhydes qui forment des adduits sur les bases de l’ADN. Les conséquences de ces modifications peuvent alors être des mutations ponctuelles ou des modifications globales du caryotype (délétion, insertion, translocation). Ces dommages peuvent être à l’origine de problèmes au niveau de la réplication, de la transcription et générer une instabilité génétique (Tableau I.1). La plupart de ces modifications sont donc impliquées dans les phénomènes de carcinogenèse, de vieillissement, et dans le développement de maladies cardiovasculaires, neurodégénératives ou auto-immunes (Palipoch and Koomhin, 2015).
Figure I.4 : Différents types de lésions provoquées par les espèces réactives de l’oxygène (Favier, 2003).
Tableau I.1 : Types de lésions endogènes retrouvées dans l’ADN. Les conséquences potentielles et le nombre de lésions formées sont donnés pour chaque lésion. CDB : cassure double brin (Adapté d’après Abbotts and Wilson, 2017).
Certaines oxydations de base n’empêchent pas la réplication, mais elles peuvent cependant induire des erreurs lors de la réplication et générer des mutations ponctuelles. Par exemple, la cytosine est spontanément désaminée en uracile, et les ERO peuvent désaminer la cytosine en 5-hydroxyuracile (5-OHU). L’uracile et la 5-OHU s’apparient préférentiellement avec une adénine pendant la réplication, entrainant une mutation de GC → AT. De façon similaire, la guanine oxydée en 8-oxoG peut donner naissance à une mutation par transversion GC → TA (Shibutani et al., 1991). Des mutations de ce type sont retrouvées dans plusieurs types de cancer, attestant du rôle essentiel du BER (voie de réparation décrite dans le chapitre suivant) dans la réparation des dommages oxydatifs de l’ADN. L’ARN peut également être oxydé. On trouve par exemple la présence de 8-hydroxyguanosine dans l’ARN. Des oxydations de l’ARN sont retrouvées dans de nombreuses pathologies, particulièrement dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer. Le dosage de 8-oxoguanosine est également utilisé dans le diagnostic du diabète de type 2 (Poulsen et al., 2012).
Pathologies liées au stress oxydatif
Les effets nocifs d’un stress oxydatif pouvant toucher tous les types de composants cellulaires, les pathologies associées à ce stress sont nombreuses. Le système nerveux est le siège d’une forte phosphorylation oxydative et contient peu d’anti-oxydants endogènes. Ces paramètres font donc de cet organe une cible privilégiée des dommages oxydatifs. Le stress oxydatif est notamment impliqué dans le développement de maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson (Uttara et al., 2009). Des études chez l’homme ont par exemple montré que la protéine β-amyloïde, le principal constituant des plaques amyloïdes caractéristiques de la maladie d’Alzheimer, pouvait altérer les complexes I et IV de la chaine respiratoire mitochondriale. Ces complexes étant impliqués dans la régulation des ERO et la production d’ATP, leur altération favorise la production d’ERO et une diminution de production d’énergie dans la cellule (Bobba et al., 2013). La maladie de Parkinson est caractérisée par une perte progressive des neurones dopaminergiques dans la substance grise. Une autre caractéristique est la diminution de la concentration en acides gras polyinsaturés, ainsi qu’une augmentation des marqueurs de peroxydation lipidique et d’oxydation des protéines (Pisoschi and Pop, 2015). De plus, une augmentation des taux de 8-oxoG urinaires a été mise en évidence chez des patients atteints de la maladie, attestant de la production de dommages oxydatifs dans l’ADN (Seet et al., 2010). Plusieurs maladies cardiovasculaires résultent de complications dues à la formation de plaques d’athérosclérose. L’athérosclérose peut toucher n’importe quelle artère du corps, que ce soit au niveau du coeur, du cerveau ou des reins, entrainant une diminution potentielle du flux sanguin (Palipoch and Koomhin, 2015). Comme vu précédemment, l’oxydation des lipides est au centre de la formation de l’athérosclérose. L’oxydation des LDL permet d’initier leur absorption par les macrophages, et donc la formation de cellules spumeuses (ou macrophages spumeux) à l’origine de la plaque d’athérosclérose (Witztum and Steinberg, 1991).
Les ERO pouvant réagir avec l’ADN et le modifier chimiquement, un fort potentiel mutagène/carcinogène leur est souvent associé. En effet de nombreux dommages peuvent entrainer un arrêt de la transcription, induire des erreurs de réplication, ou générer une instabilité génétique. Or tous ces évènements sont associés au phénomène de tumorigenèse. Parmi les produits oxydés de l’ADN, la 8-oxoG est considérée comme un biomarqueur de carcinogenèse (Khansari et al., 2009). Le risque de cancer augmente généralement avec l’âge. L’accumulation de mutations non réparées au cours du temps pourrait être une explication à ce phénomène. En effet, une augmentation progressive et significative du taux de 8-oxoG est observée au cours du temps (Khansari et al., 2009). Les ERO peuvent enfin activer le facteur de transcription NFκB (Nuclear Factor kappa B), induisant l’expression de gènes impliqués dans la prolifération cellulaire ou l’apoptose, ainsi que des facteurs de transcription (tels que c-fos ou c-jun) impliqués dans la transformation néoplasique et l’angiogenèse (Liguori et al., 2018).
Ces exemples de pathologies liées au stress oxydatif ne constituent pas une liste exhaustive. D’autres phénotypes tels que le diabète, le vieillissement, les maladies chroniques du rein ou la dégénérescence maculaire sont également concernés (Liguori et al., 2018). Le stress oxydatif peut donc avoir de nombreuses conséquences, et son contrôle par la cellule est primordial. Lorsque les défenses anti-oxydantes ne suffisent pas, d’autres mécanismes peuvent cependant se mettre en place pour prendre en charge les dommages cellulaires. Concernant l’ADN, plusieurs voies de réparation existent, chacune étant spécifique du type de dommage. Le chapitre suivant est dédié à la description de ces voies de réparation, avec un intérêt particulier porté au mécanisme de réparation par excision de base (BER), mécanisme étudié dans ce projet de recherche.
Pour faire face aux dommages de l’ADN, la cellule possède différents mécanismes de réparation. Les modifications de bases de l’ADN peuvent être réparées par deux voies principales : la voie du BER (Base Excision Repair) et la voie du NER (Nucleotide Excision Repair). Le BER est chargé de prendre en charge les lésions non volumineuses de l’ADN, tandis que le NER devra réparer les lésions encombrantes, capables de déformer la molécule d’ADN (Dizdaroglu, 2012). Les deux voies sont décrites dans ce chapitre. Cependant la voie du BER, et plus spécifiquement son étape d’initiation, est au coeur de notre étude. C’est pourquoi le BER sera davantage décrit que le NER. Les voies de réparation des cassures simple et double brin seront également abordées, ce type de lésions étant particulièrement délétères pour la cellule.
La réparation par excision de base
Mécanisme global du BER
Le BER, découvert par Tomas Lindahl (Lindahl, 1974), reconnait et répare les lésions non encombrantes de l’ADN, n’entrainant pas de distorsion importante de la double hélice d’ADN. Ces lésions peuvent être le résultat d’une oxydation, d’une alkylation ou d’une méthylation des bases de l’ADN. La réparation s’effectue grâce à quatre étapes principales : 1) la reconnaissance et l’excision de la base modifiée par une ADN glycosylase, 2) l’incision en 5’ du site abasique résultant par une endonucléase, 3) la synthèse réparatrice de l’ADN par une polymérase, 4) la ligature des deux extrémités du brin d’ADN par une ligase (Figure II.1) (Meas et al., 2017).
L’initiation du BER commence donc par l’identification et l’excision de la lésion par une ADN glycosylase. Nous verrons par la suite que chaque lésion est reconnue par une ADN glycosylase spécifique. Cette première étape crée un site abasique apurinique ou apyrimidique (site AP) (Figure II.1A), clivé dans une seconde étape par l’endonucléase APE1 (AP-Endonuclease 1), générant ainsi des extrémités 3’OH et 5’phosphate désoxyribose (dRP) (Meas et al., 2017). A ce stade, la réparation peut en réalité évoluer vers deux voies distinctes : la voie à brèche courte ou la voie à brèche longue du BER. La voie dite à brèche courte du BER, aussi identifiée comme la voie de réparation d’un nucléotide simple, nécessite l’enzyme Pol β. Grâce à son activité lyase, la Pol β élimine l’extrémité 5’dRP, ce qui crée une brèche d’un nucléotide, ainsi qu’une extrémité 5’ phosphate correcte. La brèche est alors comblée par l’incorporation d’un nucléotide, toujours par la Pol β, et les deux extrémités du brin d’ADN sont ligaturées par la ligase III (Figure II.1B) (Hegde et al., 2008). La voie de réparation dite à brèche longue remplace à l’inverse entre 2 et 12 nucléotides (Sattler et al., 2003). Cette voie est initiée par différentes polymérases en fonction de la nature de l’extrémité 5’ : les Pol β, δ et/ou ε. Ces polymérases déplacent le brin d’ADN qui contient l’extrémité 5’dRP. Le fragment contenant l’extrémité dRP est ensuite clivé par l’endonucléase FEN-1 (5’-Flap Endonuclease 1), ce qui laisse des extrémités 3’OH et 5’P. L’intégrité du brin d’ADN réparé est enfin assurée par la ligase I (Figure II.1C). L’action et le recrutement de FEN-1 et de la ligase I sont facilités par le cofacteur PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), qui agit comme une pince coulissante. Le choix entre ces deux voies pourrait dépendre du type d’ADN glycosylase utilisée pour l’initiation (Bauer et al., 2015), ou de l’état du cycle cellulaire dans lequel la réparation a lieu (Mjelle et al., 2015). Dans tous les cas, la voie dite à brèche longue est nécessaire lorsque le site AP est oxydé par les ERO, générant ainsi des extrémités bloquantes en 5’ après le clivage par APE1, incapables d’être prises en charge par la Pol β (Hegde et al., 2008).
Figure II.1 : Mécanismes de réparation par excision de base. A. La base modifiée de l’ADN est reconnue et excisée par une ADN glycosylase qui clive la liaison N-glycosidique de la base. Cette étape crée un site abasique (site AP), incisé par APE1 en 5’. Ce substrat peut être pris en charge par la voie à brèche courte ou brèche longue longue du BER. B. La voie à brèche courte nécessite l’action de la polymérase β et de la ligase III pour réparer un nucléotide simple. C. La voie à brèche longue à l’inverse implique différentes polymérases (β/δ/ε) qui permettent de synthétiser entre 2 et 12 nucléotides. L’ADN déplacé est clivé par FEN-1, et l’intégrité du brin nouvellement synthétisé est assurée par la ligase I. Ces deux dernières étapes sont coordonnées par PCNA. BER : Base Excision Repair ; dRP : deoxyribose phosphate ; nt : nucléotide (Adapté d’après Meas et al., 2017).
2. Initiation de la réparation : pour chaque lésion une ADN glycosylase spécifique leur activité. Les ADN glycosylases sont classées en trois catégories, en fonction du type de lésions qu’elles réparent : 1) les ADN glycosylases qui prennent en charge un uracile, 2) les ADN glycosylases qui réparent les bases alkylées, 3) les ADN glycosylases spécifiques des bases oxydées (Tableau II.1). Ces enzymes se distinguent également par leur capacité ou non à inciser le brin d’ADN sur lequel elles ont excisé la lésion. On distingue alors les enzymes monofonctionnelles, incapables de cliver le brin d’ADN, et les enzymes bifonctionnelles, qui possèdent en plus de leur activité ADN glycosylase une activité AP-lyase (Hegde et al., 2008).
La première ADN glycosylase découverte chez E.Coli fut UDG (Lindahl, 1974), chargée de reconnaitre un uracile apparié dans l’ADN avec une guanine, cet uracile provenant de la désamination d’une cytosine. D’autres enzymes capables de prendre en charge un uracile ont ensuite été découvertes : SMUG1 (Haushalter et al., 1999), TDG (Hardeland et al., 2003) et UNG2 (Kavli et al., 2002). Les bases purines peuvent également être méthylées, générant des produits tels que 3-méthylA, 3-méthylG et 7-méthylA. Ces lésions sont prises en charge par l’enzyme MPG (AlkA chez E.Coli) (Labahn et al., 1996).
La troisième catégorie d’enzymes est constituée des ADN glycosylases qui réparent les bases oxydées (Tableau II.1). Toutes ces enzymes (excepté MYH, dont le fonctionnement sera décrit dans la section suivante) sont bifonctionnelles. L’activité AP-lyase de ces enzymes permet de cliver le site abasique, ce qui forme néanmoins une extrémité 3’ bloquante qui doit être prise en charge par APE1. Une fois que les extrémités correctes 3’OH et 5’P sont générées, les étapes suivantes peuvent alors avoir lieu (actions de la Pol β et de la ligase III). Ces enzymes sont réparties en deux sous-catégories, en fonction de leur structure tertiaire et des caractéristiques de leur site actif (McCullough et al., 1999) : la famille Nth (Endonucléase III) ou la famille Fpg(MutM)/Nei(Endonucléase VII). L’activité catalytique utilise un résidu lysine ou proline, dans la famille Nth ou Ffp/Nei respectivement (Hegde et al., 2008). Les homologues fonctionnels ont ensuite été découverts chez l’homme : NTH1 et OGG1 appartiennent à la famile Nth, tandis que NEIL1 et NEIL2 correspondent à la famille Fpg/Nei. NTH1 répare les pyrimidines oxydées (Ikeda et al., 1998) et OGG1 est chargée d’éliminer les formes 8-oxoG et Fapy-G (Formamidopyrimidine-Guanine) (Krokan et al., 2000). Les NEILs éliminent les formes thymine glycol (Tg), Fapy-G et Fapy-A et 5-OHU/5-OHC (5-hydroxyuracile/5-hydroxycytosine) (Hazra et al., 2002). Il a également été montré que NEIL1 peut contribuer à l’élimination de la 8-oxoG, suggérant une voie de backup (ou voie de secours) dans la réparation de cette lésion (Morland et al., 2002). Dans cette même étude une troisième enzyme est décrite, nommée NEIL3. Cette protéine possède une activité particulière pour l’excision des Tg présentes dans les télomères (Zhou et al., 2013).
Il a été proposé que les ADN glycosylases se lient aléatoirement sur l’ADN, et « glissent » le long de l’ADN jusqu’à ce qu’elles reconnaissent la lésion (Prakash et al., 2012). La base contenant la lésion est alors délogée pour se retrouver dans le site actif de la glycosylase. Ceci permet à l’enzyme d’hydrolyser la liaison N-glycosidique de la base, créant ainsi un site AP (Drohat and Maiti, 2014).
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Table des matières
INTRODUCTION
Chapitre I – Le stress oxydatif
I. Définition et origine du stress oxydatif
1. Sources endogènes
a. L’anion superoxyde O2°-
b. Le peroxyde d’hydrogène H2O2
c. Le radical hydroxyle OH°
2. Sources exogènes
II. Les défenses anti-oxydantes
1. Défenses anti-oxydantes enzymatiques
2. Défenses anti-oxydantes non enzymatiques
III. Cibles biologiques du stress oxydatif
1. Effets sur les lipides
2. Effets sur les protéines
3. Effets sur l’ADN
IV. Pathologies liées au stress oxydatif
Chapitre II : Les mécanismes de réparation de l’ADN
I. La réparation par excision de base
1. Mécanisme global du BER
2. Initiation de la réparation : pour chaque lésion une ADN glycosylase spécifique
3. Mécanismes de réparation de la 8-oxoguanine
a. La 8-oxoguanine, une lésion particulière
b. Découverte, structure et mécanisme d’action d’OGG1
c. Modifications post-traductionnelles d’OGG1
d. Pathologies associées à la réparation de la 8-oxoguanine
4. Clivage du site abasique
5. La protéine plateforme XRCC1
II. La réparation des cassures simple brin de l’ADN
III. La réparation par excision de nucléotides
IV. La réparation des cassures double brin de l’ADN
V. Conclusion générale du chapitre II
Chapitre III – Organisation nucléaire
I. Organisation de l’ADN
1. Les degrés de compaction de l’ADN
2. Les histones
a. Structure des histones
b. Variants d’histones
c. Modifications post-traductionnelles des histones
d. Dynamique des histones et réparation
i. Historique des modèles de remodelage de la chromatine
ii. Mobilité des histones et réparation
iii. Remodeleurs de la chromatine et réparation
3. Organisation du noyau en domaines d’hétérochromatine et d’euchromatine
a. Notions d’hétérochromatine et d’euchromatine
b. Organisation chromatinienne de la réparation de l’ADN
II. Organisation du noyau en domaines sub-nucléaires
1. Le nucléole
2. Les corps de Cajal
3. Les corps PML
4. Les speckles et paraspeckles
5. Autres corps nucléaires
III. Conclusion générale du chapitre III
Chapitre IV – Le complexe des cohésines
I. Les complexes SMC
1. Historique de la découverte des complexes SMC
2. Architecture des complexes SMC
a. Le complexe des cohésines
b. Les complexes des condensines
c. Le complexe SMC5-6
3. Distinction entre cohésines et condensines
II. Régulation des cohésines
1. Capture de l’ADN et dissociation des cohésines
a. Cycle de chargement et de dissociation des cohésines en phase G1
b. Etablissement de la cohésion
c. Mécanismes de dissolution de la cohésion
2. Translocation des complexes
III. Rôles physiologiques des complexes SMC
1. Le rôle des cohésines dans la méiose
2. Cohésines et régulation de l’expression de gènes
a. Les cohésines facilitent l’activation de la transcription
b. Cohésines et CTCF
3. Cohésines et intégrité du génome
a. La réplication
b. La réparation des cassures double brin de l’ADN
IV. Pathologies humaines
1. Cohésinopathies
2. Autres syndromes multi-systèmes
3. Anomalies chromosomiques et fertilité
4. Cohésines et cancer
V. Conclusion générale du chapitre IV
Chapitre V – Le Médiateur de la transcription
I. La transcription
1. Les acteurs de la transcription
a. Le promoteur et les séquences régulatrices
b. L’ARN polymérase II
c. Les facteurs généraux
d. Les facteurs spécifiques de la transcription
e. Les co-activateurs de la transcription
2. Formation du complexe de pré-initiation
3. Régulation de l’élongation
II. Le Médiateur de la transcription
1. Composition et structure
a. Structure globale du Médiateur
b. Le module CDK8
c. Le Médiateur: une structure dynamique
2. Fonctions du Médiateur
a. Le Médiateur et la transcription
i. Médiateur et assemblage du complexe de pré-initiation
ii. Médiateur et initiation de la transcription par l’ARN Pol II
iii. Médiateur et élongation de la transcription par l’ARN Pol II
iv. Le rôle particulier du module CDK
b. Autres fonctions du Médiateur
i. Médiateur et architecture de la chromatine
ii. Médiateur et réparation
3. Le Médiateur et les voies de signalisation
III. Pathologies humaines liées au Médiateur
IV. Conclusion générale du chapitre V
Objectifs
RESULTATS
I. Historique du projet de recherche
II. Quelles protéines influencent le recrutement d’OGG1 ?
III. Peut-on généraliser les effets observés ?
1. Rôles du Médiateur suite à un stress oxydatif induit par H2O2
2. Rôle du Médiateur et des cohésines sur la relocalisation d’autres enzymes du BER
a. Rôle du Médiateur et des cohésines sur la relocalisation d’autres ADN glycosylases
b. Rôle du Médiateur et des cohésines sur le recrutement de XRCC1
IV. Le rôle des cohésines et du Médiateur est-il dépendant du cycle cellulaire ?
V. Quels sont les effets de l’absence du Médiateur sur l’excision de la 8oxo-G ?
1. Cinétique de réparation de la 8-oxoG
2. Rôle du Médiateur sur la cinétique de réparation de la 8-oxoG
VI. Quelle est la dynamique des complexes Médiateur et cohésines en réponse au stress oxydant?
1. Dynamique d’OGG1 et des complexes Médiateur et cohésines en fonction du stress
2. Dynamique de CTCF en fonction du stress oxydatif
3. Rôles du Médiateur et des cohésines sur la dynamique des sous-unités du module CDK 130
4. Association d’OGG1 avec les complexes Médiateur et cohésines induite par le stress oxydatif
5. Rôle et dynamique des sous-unités paralogues du module CDK du Médiateur
6. Rôle de l’activité kinase sur le recrutement d’OGG1/CDK8 et la réparation de la 8-oxoG 138
VII. Résultats complémentaires
1. Dynamique d’OGG1 et de CDK8 après micro-irradiation laser
2. Modification post-traductionnelle des cohésines après induction de dommages oxydatifs
3. Suivi de la transcription globale après exposition au stress oxydatif
4. Recherche de nouveaux acteurs impliqués dans le recrutement d’OGG1
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Matériel et méthodes
Annexes
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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