Les mécanismes de l’adaptation locale

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Les mécanismes de l’adaptation locale

Le potentiel d’adaptation

De nos jours, le potentiel d’adaptation* d’une population est estimé à travers l’étude de l’adaptation locale*. L’adaptation locale est définie comme un processus inter-populationnel dans lequel la répartition des génotypes est le fruit d’un gradient sélection et d’une réduction du flux de gènes entre populations. L’étude de celle-ci va se faire par la comparaison entre populations qui évoluent sous différentes conditions environnementales (Kawecki et Ebert, 2004). L’adaptation locale est donc un outil privilégié pour identifier les forces de sélection à l’œuvre au sein d’une espèce (Williams, 1993). De mon point de vue, le potentiel d’adaptation est la part du polymorphisme dans une population qui permettrait à celle-ci de s’adapter à de futures conditions environnementales. Identifier les gènes impliqués dans d’adaptation locale permettrait de définir l’étendue de cette « boite à outils » génétique.

Conditions pour la mise en place de l’adaptation locale

L’un des prérequis essentiels pour qu’une population s’adapte à de nouvelles conditions  environnementales est que le potentiel d’adaptation soit déjà présent dans cette population. L’adaptation locale peut néanmoins être entravée par deux phénomènes. Le premier phénomène est le flux de gènes (migration et dispersion). Celui-ci amène constamment de nouvelles variations génétiques dans une population par la migration d’individus provenant d’autres populations. Ceci a pour conséquence une homogénéisation du contenu génétique dans l’ensemble des populations connectées. Donc, pour qu’il y ait adaptation locale dans le cas d’un flux de gènes important, seule une pression de sélection forte contrant l’apport de nouvelles variations génétiques permettra l’augmentation de fréquence du génotype adaptatif (Sanford et Kelly, 2011). Le second est la dérive génétique qui provoque un échantillonnage aléatoire des génotypes d’une génération à l’autre et peut ainsi entraîner la perte d’un génotype qui pourrait être potentiellement adaptatif. Donc, une population de grande taille efficace* aura plus de chances de présenter un génotype adaptatif qu’une population de petite taille dans laquelle la dérive génétique est forte. C’est par exemple le cas d’une population ayant récemment subit un goulot d’étranglement, sa taille efficace étant réduite, le potentiel d’adaptation résultant sera faible.
En conclusion, le potentiel d’adaptation résulte d’un équilibre entre la sélection naturelle, favorisant la fixation de caractères adaptatifs, et les processus biologiques tels que le flux de gènes entre deux populations pouvant entraver cette adaptation locale en homogénéisant les contenus génétiques.

Les changements environnementaux

Les perturbations environnementales sont nombreuses et plusieurs d’entre elles ont aujourd’hui une origine essentiellement humaine. C’est le cas par exemple de l’eutrophisation* du milieu, la pollution des océans par les déchets ménagers et industriels, la réduction des stocks de pêche due à la surpêche, le tourisme et la minéralisation des côtes réduisant l’habitat disponible pour les espèces y vivant. Toutefois, parmi les nombreuses perturbations, le changement climatique est probablement le plus préoccupant car son impact a déjà aujourd’hui un effet à l’échelle de la planète.

Le changement climatique

Ces dernières années, les indices d’un changement climatique d’origine anthropique se font de plus en plus nombreuses et ses conséquences de plus en plus visibles à travers le monde (IPCC, 2013). Parmi les causes du changement climatique, l’augmentation de la teneur en gaz à effet de serre dans l’atmosphère est très certainement la problématique majeure (Hansen et al., 2006). Il a été prouvé que l’augmentation de la concentration de ces gaz dans l’atmosphère est à l’origine de la variation accrue du régime des pluies et des vents (Xie et al., 2010), de l’augmentation de la fréquence des tempêtes et des événements climatiques extrêmes (Vecchi et al., 2013), de l’augmentation du niveau moyen des mers (Vermeer et Rahmstorf, 2009) et de la variation de la température de surface des océans (Xie et al., 2010)). Ces perturbations ont un impact majeur sur tous les écosystèmes (Smith et al., 2009), et notamment les écosystèmes marins (Stenseth, 2002).
Parmi les nombreux gaz à effet de serre, le groupe d’experts intergouvernemental sur l’évolution du climat (GIEC ou IPCC en anglais) a défini que le dioxyde de carbone (CO2) était celui qui a le plus d’effet sur le changement climatique à la vue des quantités relarguées dans l’atmosphère quotidiennement (IPCC, 2013). Une partie du CO2 se retrouve dans l’atmosphère et, en synergie avec les autres gaz à effet de serre, provoque une augmentation de la température moyenne de l’air et des océans. De plus, les océans agissant comme une pompe à CO2, ceux-ci récupèrent l’autre partie du CO2 rejeté dans l’atmosphère (IPCC, 2013). L’accumulation de CO2 dans les océans a pour conséquence leur acidification. Le CO2 absorbé réagit avec l’eau et provoque une diminution du pH en changeant l’abondance relative des éléments de carbone inorganique dissous (DIC)2 présents naturellement et en équilibre dans les océans. La capacité des océans à jouer le rôle de pompe à CO2 n’étant pas infinie, la concentration du CO2 dans l’atmosphère continuera de s’accroître, intensifiant l’augmentation de la température des mers et des océans.
Le changement climatique a donc un impact direct sur la survie des populations car il entraîne une modification des paramètres physico-chimiques des océans pouvant avoir un effet sur un grand nombre de processus biologiques tels que la croissance, les défenses immunitaires, la disponibilité en nourriture, le succès reproductif, la phénologie,… et ainsi impacter la structure et la fonction des écosystèmes (IPCC, 2013; Parmesan, 2006). A l’heure actuelle, la température de surface moyenne des océans Indien, Atlantique et Pacifique a déjà augmenté de 0.65, 0.41 et 0.31°C respectivement entre 1950 et 2009 (IPCC, 2013) et, selon le GIEC, la température de surface des océans va continuer à croître entre 1.2 à 3.2°C pendant ce siècle (IPCC, 2013). Cette information est déduite de simulations qui permettent de prédire, à partir de données actuelles, l’évolution du climat pour le 21ème siècle. Toutefois, il existe de nombreuses simulations différentes qui dépendent notamment de la manière dont la concentration en CO2 va évoluer (figure 1.4). Par conséquent, ces simulations ne sont pas toutes en accord sur le futur du climat et donc l’impact que le changement climatique global aura sur nos écosystèmes.

Les stratégies de réponse face au changement climatique

La première stratégie de réponse des organismes face aux perturbations environnementales est la migration. Perry et al. (2005) ont montré que plusieurs des espèces de poissons démersaux (exploités ou non-exploités), dont ils ont étudié la répartition géographique en Mer du Nord, ont migré vers le Nord vers des températures plus froides. La cause de ce décalage de distribution : une hausse de la température moyenne annuelle de l’eau de 1.05°C entre 1977 et 2001 en Mer du Nord. Toutefois cette stratégie pose deux problèmes majeurs. La première est que la migration de populations vers des latitudes plus élevées dépend de la possibilité à trouver un nouvel habitat approprié. La seconde est que la migration de populations entières est plus compliquée (i.e. inter-générationnelle) pour des espèces sessiles. Par conséquent, les stratégies favorisant l’acclimatation et/ou l’adaptation seront probablement plus efficaces.
Face à un changement rapide et fort de l’environnement, l’acclimatation est une solution avantageuse car la réponse face au changement environnemental ne dépend que de la plasticité phénotypique. Ceci implique donc uniquement un changement du phénotype de chaque individu dans la population, changement se passant à l’échelle individuelle et non pas générationnelle (c’est le même individu qui s’acclimate à son nouvel environnement). Toutefois, beaucoup d’espèces marines semblent déjà arriver aux limites de leurs tolérances thermiques possibles grâce à leur plasticité phénotypique (Stat et al., 2012; Sunday et al., 2015) et une acclimatation supplémentaire face à la température risque d’être limitée (Peck, 2016; Peck et al., 2009).
Enfin, la dernière stratégie est l’adaptation. Soit le variant génétique amenant une adaptation aux nouvelles conditions environnementales est déjà présent dans la population, soit celui-ci apparait à une échelle de temps similaire à l’échelle de temps à laquelle le changement climatique (ou environnemental) se passe, conduisant ainsi au maintien de la population. Dans tous les autres cas, le changement environnemental pourrait conduire à la disparition de la population (Billington et Pelham, 1991; Davis et al., 2005; Parmesan, 2006).
En conclusion, la réponse des organismes face à un changement de l’environnement résulte donc d’un mélange entre la migration, l’acclimatation et l’adaptation (Chevin et al., 2010; Davis et Shaw, 2001). La contribution relative de chaque phénomène ainsi que leur efficacité va essentiellement être dépendante de l’échelle de temps et d’espace du changement environnemental (García Molinos et al., 2015). Mais cela va dépendre aussi de l’organisme, de par son histoire de vie, la disponibilité en habitats et sa capacité de dispersion (Chevin et al., 2010; Gienapp et al., 2008; Parmesan et Yohe, 2003). De manière générale, la plasticité phénotypique permettrait aux populations de tolérer certaines variations environnementales rapides sur une courte échelle de temps et l’adaptation pourrait faire la même chose pour une échelle de temps plus longue (Dam, 2013).

L’adaptation locale comme outil pour l’estimation du potentiel d’adaptation dans le cadre du changement climatique

L’ensemble des populations d’une espèce recouvre une certaine variabilité environnementale. Par exemple, des populations de lagune subissent une plus forte variabilité des conditions environnementales telles que la température et/ou la salinité qu’une population de pleine mer. Eventuellement, ces conditions locales peuvent imiter les conditions prédites globalement dans le cadre du changement climatique. Comprendre comment ces populations font face à ces conditions locales peut permettre d’estimer le potentiel d’adaptation d’une espèce face au changement climatique (Bensoussan et al., 2010). Inversement, mesurer la réponse à un même stress environnemental de populations localement différenciées génétiquement (polymorphisme ancestral différent) peut également permettre cette estimation (Angilletta, 2009).

Le changement environnemental et les Cnidaires

Parmi les organismes vivants, les Cnidaires, et notamment les coraux constructeurs de récifs tropicaux sont visiblement impactés par le changement climatique (Alvarez-Filip et al., 2011; De’ath et al., 2012; Hoegh-Guldberg, 1999; Hoegh-Guldberg et al., 2007; Normile, 2016). Or, les récifs coralliens sont une ressource inestimable pour de nombreux peuples à travers le monde grâce notamment à la pêche et au tourisme (Lesser, 2004). Toutefois, la fréquence des événements climatiques extrêmes causés par le changement climatique associée à d’autres activités anthropiques telles que la surpêche et l’exploitation des côtes, le tout agissant en synergie (Coma et al., 2009), provoquent une réduction de la couverture corallienne mondiale (Alvarez-Filip et al., 2011; De’ath et al., 2012), au détriment de la diversité associée (Hoekstra et al., 2004) mais aussi des populations humaines dépendantes de ces ressources (Hoegh-Guldberg, 1999; Hoegh-Guldberg et al., 2007). Les chiffres du GIEC montrent que 7% des récifs ont subi au moins un état de stress dans la période 1985-1994 et ce pourcentage monte à 38% dans la période 1995-2004. Plus récemment, la dernière période El Niño a dévasté les coraux mondialement (Normile, 2016). D’un autre côté, dans les zones tempérées, des Cnidaires symbiotiques se développent sous des conditions environnementales très variables, qui seraient létales pour les récifs coralliens (Bensoussan et al., 2010). Par conséquent, comprendre l’origine de la différence de sensibilité/résistance permettrait de mieux estimer le potentiel d’adaptation de ces espèces.

Les Cnidaires

Les Cnidaires sont des organismes essentiellement marins répartis partout sur la planète ; ils sont présents à toutes les profondeurs. Pélagiques et/ou benthiques, leur taille varie de quelques millimètres pour les espèces coloniales à plus d’un mètre pour les formes solitaires. Ils comprennent les organismes comme les hydres, les méduses, les coraux, les gorgones et les anémones de mer.

L’Embranchement des Cnidaires

L’embranchement des Cnidaires (cnid- Gr. = ortie) compte plus de 13 000 espèces décrites à ce jour (Zhang, 2013). Ils sont tous caractérisés par la présence d’un type de cellules spéciales urticantes : les cnidocytes. Ce sont des organismes à symétrie radiaire et diploblastiques4 (diplo- Gr. = double, blast- Gr. = germe, pousse) c.à.d. qu’ils possèdent deux feuillets embryonnaires : l’ectoderme et l’endoderme. Leur cycle biologique est composé d’une alternance de générations (cycle vital dimorphe) entre le stade polype et le stade méduse.
De manière générale, les méduses sont nageuses et ont la forme d’une ombrelle. La bouche est orientée vers le bas et se prolonge par le manubrium. La cavité gastro-vasculaire est ramifiée dans l’ombrelle qui est bordée de tentacules. Les polypes ont un corps cylindrique et s’attachent au substrat par leur disque pédieux. La bouche est orientée vers le haut, et est entourée de plusieurs tentacules. Les différentes classes de Cnidaires se distinguent par l’importance relative du stade méduse et polype, soutenues aujourd’hui par des données phylogénétiques.
L’ancêtre commun aux Cnidaires serait apparu il y a environ 500 millions d’années (Cartwright et al., 2007). Aujourd’hui les Cnidaires sont divisés en deux Sous-Embranchements : les Medusozoa et les Anthozoa. Parmi les Medusozoa on retrouve quatre Classes : les Hydrozoa (hydr- Gr. = eau, zo- Gr. = animal), les Scyphozoa (scyph- Gr. = coupe, tasse, zo- Gr. = animal), les Cubozoa (cub- Gr. = cube, zo- Gr. = animal) et les Staurozoa. Le Sous-Embranchement des Anthozoa ne comprend qu’une seule Classe : les Anthozoa (anth- Gr. = fleur), eux-mêmes se divisant en deux Sous-Classes : les Hexacorallia (hexa- Gr. = six, coralli- Gr. = corail) et les Octocorallia (octo- Gr. = huit, coralli- Gr. = corail) (figure 1.6).
Chez les Hydrozoa, les deux formes corporelles sont généralement présentes et sont à peu près d’égale importance à l’exception de l’hydre d’eau douce Hydra vulgaris (Linnaeus, 1758). Chez les Scyphozoa, les Cubozoa et les Staurozoa, le stade méduse domine ; le stade polype étant très réduit. Enfin, chez les Anthozoa, c’est le stade polype qui domine, avec une absence totale du stade méduse. Dans le cadre de cette thèse, je me suis centré sur la Classe des Anthozoa.

Anemonia viridis (Forskål, 1775)

Dans le cadre de mon projet de thèse, je me suis intéressé à un Cnidaire symbiotique vivant dans un environnement tempéré, l’anémone de mer Anemonia viridis.

Avantages du modèle

Pour mieux comprendre l’origine de la sensibilité/résistance aux variations climatiques des Cnidaires, il est intéressant d’étudier le potentiel adaptatif d’un Cnidaire symbiotique vivant en milieu tempéré. La répartition géographique d’A. viridis fait qu’elle subit des gammes de températures qui seraient létales pour les récifs coralliens.
On la retrouve beaucoup en Méditerranée, mais aussi tout le long de la côte Atlantique, et ainsi jusqu’aux côtes anglaises de la Manche. Récemment, des naturalistes l’ont retrouvée localement aux Pays-Bas. En plus de sa répartition géographique, A. viridis est présente en surface mais aussi jusqu’à 30m de profondeur, en mer mais aussi dans des lagunes ou des cuvettes créées par les marées dans la Manche.
Par ailleurs, c’est un organisme déjà très étudié dans sa réponse aux stress. Richier et al. (2005) ont montré une résistance accrue face à un stress oxydatif comparé à des anémones non symbiotiques. Ganot et al. (2011) et Moya et al. (2012) ont mis en évidence une série de gènes ou gènes « Kern »5 dont l’expression est modifiée en fonction de différents stress comme les UV, la température et/ou l’absence de symbiotes, travaux rendus possibles grâce à une banque d’EST (Sabourault et al., 2009). Ventura et al. (2016) ont montré que l’acidification du milieu n’entrainait aucune variation dans le taux de photosynthèse net. Toutes ces données indiquent clairement une capacité d’acclimatation de l’organisme face à son environnement.
De plus, la nature des échanges moléculaires entre les partenaires de cette symbiose commence à être explorée. (Revel et al. 2016) ont mis en évidence le transfert du symbiote vers l’hôte de certains précurseurs d’acides gras. Dani et al. (2017) ont identifié la protéine NPC1 comme marqueur potentiel de la membrane périsymbiotique chez A. viridis.
Ces différents travaux ont été facilités par la séparation des différents tissus que sont l’épiderme, le gastroderme et les symbiotes (Bénazet-Tambutté et al., 1996), ce qui est possible chez A. viridis mais pas chez la majorité des coraux tropicaux.
Enfin, A. viridis présente 5 morphes (Wiedenmann et al., 1999) qui se distinguent sur base de leur morphologie (taille du polype, nombre de tentacules, couleur du corps et de la pointe des tentacules), leur mode de reproduction et leur composition en protéines fluorescentes GFP-like (figure 1.10). L’intérêt de cette diversité de forme est qu’elle pourrait être une réponse plastique de l’anémone face à l’environnement, pourrait venir d’une adaptation à des conditions environnementales ou même pourrait représenter des lignées génétiques indépendantes divergeant les unes par rapport aux autres par des phénomènes de spéciation.

Les marqueurs RADseq

Même si les techniques NGS se sont fortement développées ces dernières années, on ne peut toujours pas séquencer des génomes entiers dans le cadre d’une étude populationnelle. Il faut encore avoir recours à des méthodes de réduction de la complexité du génome et mesurer la diversité génétique sur une portion réduite du génome. C’est ce que permettent les marqueurs de type « Restriction-site Associated DNA sequencing » (RADseq) qui ciblent les séquences flanquant les sites de restriction d’une endonucléase donnée. Cette technique a premièrement été utilisée pour détecter des SNP altérant un site de restriction ou des variations de longueurs entre deux sites de restrictions due à la présence d’indels (Miller et al., 2007), de la même manière que des méthodes plus anciennes comme les AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) et RFLP (Restriction-site Fragment Length Polymorphism). Baird et al. (2008) ont développé la première méthode sensu stricto de RADseq en couplant une approche de type AFLP à des techniques NGS de séquençage de masse. L’intérêt pour les méthodes de séquençage de masse (NGS) de type RADseq ne fait que croitre depuis quelques années (Andrews et al., 2016). Ceci est dû aux nombreuses applications de ce type de méthodes (Andrews et al., 2016; Seehausen et al., 2014) dont notamment pour des questions phylogénétiques (Cariou et al., 2013; Eaton et Ree, 2013; Lemmon et Lemmon, 2013; McCormack et al., 2013; Ree et Hipp, 2015; Rubin et al., 2012; Suchan et al., 2017; Wagner et al., 2013; Warner et al., 2015) et de détection de l’adaptation locale (Hoban et al., 2016; Lamichhaney et al., 2012; Picq et al., 2016; Savolainen et al., 2013; Sork et al., 2013; Tiffin et Ross-Ibarra, 2014).
Un schéma de la méthode RADseq est présenté en figure 2.2. Le génome de chacun des individus est digéré individuellement par un enzyme de restriction, formant des fragments de longueurs variables dépendant de l’enzyme de restriction utilisée et de sa fréquence de coupe au sein du génome (figure 2.2 A). On ajoute à chaque fragment un « barcode » unique de quelques paires de bases, spécifique à l’individu ainsi qu’un adaptateur spécifique à la technique de séquençage utilisée, qui permettra l’amplification et le séquençage en masse (figure 2.2 B). Les produits de digestion de chaque individu sont alors regroupés dans une banque. Le nombre d’individus rassemblés par banque dépend de la couverture de séquençage souhaitée (dépendant du rendement de la technique de séquençage utilisée et du nombre de sites de restriction par individu). Les banques sont ensuite fragmentées aléatoirement en plus petits morceaux par sonication et une sélection de taille (300-600pb) des fragments est effectuée sur chaque banque. Un second adaptateur est ajouté à l’autre extrémité ainsi créée sur chaque fragment et on procède finalement à une PCR qui permet d’enrichir la banque en séquences flanquées par ces adaptateurs (figure 2.2 C) (Baird et al., 2008; Davey et Blaxter, 2010).
La seconde partie de la méthode est le séquençage à proprement parler. Dans le cadre de ma thèse, j’ai utilisé un séquençage de type Illumina HiSeq 2000 en passant par la plateforme de séquençage de l’institut Pasteur de Lille. Le séquençage Illumina peut être résumé en trois étapes : ajout de la banque sur une section (= « lane ») de la flow cell (membrane possédant des millions de sites complémentaires aux adaptateurs utilisés), amplification locale par « ponts » de chaque fragment d’ADN fixé sur la membrane et enfin séquençage par insertion des nucléotides sur la membrane. L’intérêt de cette technique est que, chaque nucléotide, quand celui-ci est inséré dans le fragment fixé, émet un photon qui sera reconnu par une caméra. En procédant à une insertion successive des quatre nucléotides, il est possible de déterminer la séquence de chacun des fragments situés sur la flow cell. L’amplification locale par « ponts » avant séquençage permet d’amplifier le signal lumineux, qui sera alors mieux détecté par la caméra. Le séquençage peut se faire de deux manières : en single-end (séquençage à partir du premier adaptateur) ou en paired-end (séquençage à partir de chacun des deux adaptateurs). Dans le cadre de cette thèse, j’ai obtenu, par séquençage single-end, des fragments d’environ 100pb (figure 2.2 D).
L’étape suivante est de reconstruire les loci par des outils bio-informatique (figure 2.2 E), comme détaillé dans le paragraphe 2.2.2.b ci-dessous et l’Article 2 du Chapitre 3).
L’intérêt principal de la méthode RADseq comme présenté ci-dessus réside dans la quantité de loci obtenus après séquençage NGS. En effet, suivant le type d’enzyme de restriction utilisé, l’ADN d’un individu sera coupé plus ou moins fréquemment et de manière aléatoire sur l’ensemble du génome, que ce soit au niveau des zones codantes comme au niveau des zones non-codantes. En comparant les séquences provenant des sites de coupures entre individus, on obtient une image globale de la diversité génétique. Toutefois, les sites de coupure étant répartis aléatoirement, déterminer l’origine des loci RAD est difficile sans un génome de référence ou toute autre base de données génétique.

Stratégie expérimentale pour la délimitation des espèces chez Anemonia viridis

Un des premiers objectifs de mon travail de thèse consistait dans la délimitation d’espèces chez Anemonia viridis dont les résultats sont décrits dans le chapitre 3. Nous avons notamment testé si la différenciation génétique des individus pouvait se faire selon leur origine géographique ou selon leur morphologie. Une stratégie d’échantillonnage ad hoc, couplée à des méthodes de délimitation d’espèces (SpedeSTEM, BPP et SVDQuartet), a permis de révéler la présence ou l’absence de lignées génétiques indépendantes au sein de l’espèce étudiée.

Stratégie d’échantillonnage

Nous avons procédé à un échantillonnage hiérarchisé. Deux régions géographiques indépendantes ont été choisies : la Mer Méditerranée et la Manche. Pour chacune de ces régions, plusieurs sites contenant deux morphes différents au minimum ont été échantillonnés. L’approche « EPIC Sanger » (voir 2.2.2.a) et l’approche RADseq (voir 2.2.2.b) ont été réalisées sur des échantillons hiérarchisés différents (figure 2.3 et table 2.1 pour les « EPIC Sanger » et figure 2.4 et table 2.2 pour le RADseq).

Les loci RADseq par la technologie Illumina

Les marqueurs RADseq ont été construits sur des regroupements d’individus allant de 32 à 44 individus par banque, en utilisant l’enzyme PstI-HF (New England Biolabs), donnant ainsi un nombre de lectures moyen par individu de 4 086 151 (±3 834 869 SD). Ces lectures sont par la suite démultiplexés (reconnaissance des barcodes et attribution de chaque lecture à un individu), filtrés et clusterisés (regroupement des lectures en évitant le plus possible le regroupement de loci paralogues et en limitant la proportion de données manquantes) formant ainsi un nombre de loci pour chaque individu. De ces loci, il a été ensuite possible d’extraire les SNP di-alléliques.
Pour contrôler l’effet de la qualité d’ADN et de la contamination en zooxanthelles, il a été nécessaire de construire deux banques test. La première était composée d’extraits d’ADN de bonne qualité appauvries en zooxanthelles parce que tirés du tissu épidermique non symbiotique et la seconde était constituée d’extraits d’ADN de moins bonne qualité avec une contamination forte en zooxanthelles (extraction sur l’ensemble des tissus). Dans l’ensemble, nous n’avons pas vu d’effet de la présence de symbiotes lors du séquençage. Par contre, la qualité de l’ADN a grandement contribué à la quantitéde loci reconstruits après séquençage, notamment chez les individus provenant de Vulcano. C’est pour cela que nous n’avons pas considéré les individus avec moins de 4000 loci dans l’analyse de la délimitation des morphes.

Diversité symbiotique par l’ITS2

Afin d’inférer la diversité génétique des symbiotes intra et inter morphes, un locus spécifique amplifiant une partie de l’ADN ribosomal (ITS2) a été séquencé par NGS (séquençage d’amplicons) sur l’ensemble des individus analysés en RADseq. Ce locus a été choisi car c’est un marqueur classiquement utilisé pour l’étude de la diversité génétique au sein de Symbiodinium sp. (Stat et al., 2012). Après amplification spécifique par PCR de l’ITS2 au sein de chacun des individus, les amplicons ont été séquencés avec une technologie NGS : le séquençage Illumina sur plateforme MiSeq. Il existe deux différences majeures avec la technologie HiSeq. La première est la taille des amplicons séquencés, qui est d’environ 250pb pour le MiSeq contre 100pb pour le HiSeq. La seconde est que le nombre de fragments séquencés par flowcell (nombre de lectures total) est 100 fois moindre pour le MiSeq (environ 20 millions de lectures).
Le modèle d’étude pose malgré tout un problème dans le cadre de l’identification des séquences ITS2. En effet, une anémone peut posséder plusieurs millions de Symbiodinium sp. par mg de protéines (Ventura et al., 2016; Zamoum et Furla, 2012). Il peut donc y avoir une diversité de séquences ITS2 à l’intérieur de chaque anémone, ce qui pose problème pour les méthodes classiques d’identification des loci après séquençage en masse par NGS. Ce travail a été effectué au sein du laboratoire dans la cadre du travail doctoral de Barbara Porro et les résultats sont présentés dans la publication 2 (Chapitre 3).

Clefs d’analyse

Une fois la base de données acquise, il faut encore interpréter ces données. Dans le cas de la distinction des morphes, j’ai pris le parti d’utiliser la théorie de la coalescence pour reconstruire des arbres d’espèces (Fujita et al., 2012) par une approche multi-locus (Dupuis et al., 2012). En effet, cette approche coalescente est devenue un standard dans les problématiques de délimitation d’espèces (Carstens et al., 2013). La coalescence* est un processus décrivant la rencontre de deux lignées en un même ancêtre lorsque l’on parcourt en sens inverse du temps la généalogie d’un échantillon de gènes dans une population (Kingman, 2000). En d’autres termes, si l’on prend deux individus qui possèdent chacun une copie différente d’un gène, on va remonter jusqu’à l’ancêtre commun des deux copies de gènes, ce qu’on appelle, le point de coalescence. A partir de cela, il est possible de construire un arbre de gènes qui va des copies présentes dans l’échantillon d’individus jusqu’à l’ancêtre commun de toutes ces copies de gènes.
Jusqu’à récemment, la construction d’arbres de gènes était utilisée comme proxy pour l’arbre d’espèces (Degnan et Rosenberg, 2009). Toutefois, l’utilisation de plusieurs arbres de gènes pose problème. En effet, chaque arbre de gène reflète une histoire évolutive différente, liée à l’histoire des espèces mais qui peut être significativement différente d’un gène à l’autre (figure 2.5) (Szöllősi et Daubin, 2012). Par ailleurs, la coalescence ne permet pas de prendre en compte plusieurs facteurs pouvant influencer l’évolution de gènes entre espèces. C’est notamment le cas des phénomènes de duplication, des transferts horizontaux, et de la perte d’un gène (Szöllősi et al., 2015).
Figure 2.5 : Différents arbres de gènes au sein d’un même arbre d’espèces. Le gène A et B n’ont pas les mêmes histoires de coalescence au sein d’une même généalogie d’espèces. Les points de coalescences dépendent de l’apparition aléatoire de mutations et non des spéciations. De la même manière, la perte d’un variant allélique au sein d’une lignée dépend de la dérive génétique, elle aussi aléatoire. A partir de différents arbres de gènes, il est possible de reconstruire un arbre d’espèce le plus compatible avec ces différentes histoires de coalescence (d’après Fujita et al., 2012).
Par conséquent, l’utilisation d’arbres de gènes comme proxy pour délimiter les espèces sera fortement compromise par l’incongruence qu’il peut y avoir entre arbre de gènes et arbre d’espèces (Maddison, 1997; Rosenberg, 2002).
Les méthodes actuelles de reconstruction d’arbres d’espèces combinent les données de tous les arbres de gènes disponibles pour émettre l’hypothèse la plus probable d’arbre d’espèce. Ceci peut se faire par l’estimation par coalescence de l’arbre d’espèce le plus probable ou par la construction d’un « supergène » par concaténation (Degnan et Rosenberg, 2009). D’après Edwards et al. (2007), la concaténation ne fonctionne pas correctement à partir du moment où il y a 5 ou plus taxons car celle-ci ne permet pas d’hétérogénéité de réponse entre arbres de gènes. Par conséquent, les méthodes utilisées dans cette thèse sont toutes basées sur la coalescence pour inférer l’arbre d’espèce le plus probable d’après l’ensemble des arbres de gènes, ce qui a été fait sur A. viridis avec les marqueurs de gènes de stress (approche EPIC par Sanger) par l’approche SpedeSTEM (Ence et Carstens, 2011) et BPP (Yang, 2015) (Article 1, chapitre 3).
Un reproche pouvant être fait dans l’utilisation de gènes de stress pour délimiter les espèces est que ces gènes pourraient ne pas être assez variables car soumis à sélection conservatrice. Cependant, Bensch et al. (2002) et Garvin et al. (2010) avancent que ces gènes pourraient justement être des bons marqueurs de divergence. Afin de vérifier que nos marqueurs de gènes de stress sont des marqueurs appropriés dans le cadre de la délimitation d’espèces, j’ai mené, en parallèle, une approche RADseq sur un nombre d’individus plus important pour vérifier que le statut taxonomique des morphes d’A. viridis avait été correctement identifié par les marqueurs de gènes de stress. Dans cette approche, la délimitation d’espèces a été faite à partir des SNP di-alléliques en utilisant SVDQuartets (Chifman et Kubatko, 2014) (Article 2, chapitre 3).

Stratégie expérimentale pour la détection de l’adaptation locale chez Anemonia viridis

Le but de l’objectif 2 était de détecter des phénomènes d’adaptation locale pour estimer le potentiel d’adaptation d’Anemonia viridis ; les résultats sont décrits dans le chapitre 4. La manière la plus efficace de répondre à cet objectif était de rechercher des sites où un gradient de sélection par rapport aux conditions environnementales pouvait s’exercer. En appliquant des méthodes de détection de loci outlier, ici BAYESCAN (Foll et Gaggiotti, 2008) et PCAdapt (Luu et al., 2017), c.à.d. dont la distribution des fréquences alléliques le long du gradient était significativement différente de celle de l’ensemble des loci, il est possible de mettre en évidence des gènes potentiellement impliqués dans l’adaptation locale. De plus, le sous-objectif supplémentaire de cette partie était de tester si les gènes de réponse au stress étaient impliqués dans l’adaptation locale.

Stratégie d’échantillonnage

De manière similaire à la stratégie expérimentale utilisée pour les morphes, un échantillonnage hiérarchisé a été effectué. Premièrement, cinq sites déconnectés géographiquement ont été choisis. Dans chacun de ces sites, deux populations a priori du même pool génique ont été choisies de telle sorte qu’il y ait un gradient de sélection possible entre les deux populations (i.e. pouvant ainsi conduire à l’adaptation locale). Deux types de gradients environnementaux ont été sélectionnés :
• la modalité surface/profondeur dans laquelle la quantité de lumière reçue varie avec la profondeur et où la température en surface peut subir des variations quotidiennes plus importantes ;
• la modalité lagune/mer, où la salinité et la température au niveau de la lagune sont plus variables que du côté mer.
Les cinq sites sélectionnés avec les 2 populations dans chacun des sites ainsi que les modalités écologiques sont décrites dans la table 2.4 et la figure 2.6.

Espèces cryptiques

Historiquement, les espèces étaient définies selon des critères morphologiques. Toutefois, cela ne fonctionne pas dans le cas des espèces cryptiques. Celles-ci sont relativement fréquentes dans le règne vivant (Pfenninger et Schwenk, 2007). Des espèces seront décrites comme cryptiques lorsque les caractères morphologiques ne sont pas suffisants pour les différencier, alors que des différences génétiques existent entre elles (Bickford et al., 2007). De ce fait, une adaptation potentielle à une variable environnementale pourrait en fait provenir d’une divergence génétique inter-espèce non encore reconnue. Par conséquent, des espèces cryptiques, génétiquement différenciées même si morphologiquement identiques, peuvent répondre différemment à un stress environnemental. Se limiter à des critères morphologiques pour décrire une espèce n’est donc pas suffisant. Le cas décrit chez les phylogénétique a mis en évidence un complexe de quatre espèces cryptiques en Amérique du Nord au sein de l’espèce Cletocamptus deitersi (Richards, 1897) (Gómez et al., 2004; Rocha-Olivares et al., 2001). Parmi ce complexe d’espèces cryptiques, deux d’entre elles, C. fourchensis et C. stimpsoni, indissociables morphologiquement, ont été exposées à des métaux lourds. Les deux espèces ont montré une tolérance différente aux contaminants (Rocha-Olivares et al., 2004). Ces deux espèces, ont donc une réponse différente face à une variable environnementale. De même, la définition de l’espèce Ciona intestinalis (Linnaeus, 1767) a été récemment bousculée. Cette ascidie, couramment utilisé en biologie développementale et l’un des premiers animaux à voir son génome entièrement séquencé (Dehal, 2002), semble en fait être composée de 4 espèces cryptiques (Caputi et al., 2007; Nydam et Harrison, 2007; Suzuki et al., 2005; Zhan et al., 2010) dont deux de ces espèces ont divergé depuis 3 à 4 millions d’années (Roux et al., 2013).
Chez les Cnidaires, les complexes d’espèces cryptiques sont fréquents, le cas d’Acropora décrit plus haut en est un exemple (Richards et al., 2016). Ces espèces cryptiques peuvent aussi varier entre elles sur le mode de reproduction (Baums et al., 2006) et exhiber différentes interactions écologiques, comme lors de la réponse au stress (Boulay et al., 2014). Ne pas reconnaitre des espèces cryptiques pourrait amener à une sous-estimation de la diversité génétique, une surestimation des intervalles écologiques et physiologiques des espèces (par exemple une espèce généraliste à la place de plusieurs spécialistes) et ainsi mener à une estimation erronée du potentiel d’acclimatation et d’adaptation (Prada et al., 2014).

Variation morphologique sans spéciation

Inversement, des espèces distinctes morphologiquement peuvent n’être en réalité qu’une seule espèce à plasticité phénotypique forte, causant cette variation morphologique. Cette plasticité phénotypique a été à l’origine de nombreuses confusions taxonomiques (Fukami et al., 2004; Schwaninger, 1999). C’est notamment le cas chez les coraux, dont différentes espèces décrites sur la base de la morphologie générale de l’architecture squelettique des colonies (Todd, 2008), se sont révélées êtres des espèces capables de se croiser et donc interfécondes, comme c’est le cas par exemple au sein du genre Stylophora (Flot et al., 2011; Stefani et al., 2011). Par conséquent, comprendre le rôle et l’étendue de la variabilité morphologique est crucial pour identifier une espèce, estimer correctement sa diversité génétique et donc déterminer son potentiel évolutif (Paz-García et al., 2015a, 2015b).
Toutefois, la plasticité phénotypique induite par l’environnement, la variabilité intraspécifique causée par différents génotypes et le brassage génétique causé par d’éventuelles introgressions entre espèces, provoquent un chevauchement de la variabilité morphologique intra et interspécifique (Combosch et Vollmer, 2015; Richards et Hobbs, 2015; Todd, 2008) montrant clairement la nécessité d’utiliser de nouvelles méthodes pour surmonter les limitations dues à la morphologie (Arrigoni et al., 2016; Pante et al., 2015).

Délimitation d’espèces

Une morphologie uniforme peut cacher de la diversité cryptique et une plasticité phénotypique peut créer différents morphotypes au sein d’une seule et même espèce. Tout ceci peut rendre difficile la délimitation d’une espèce qui elle-même est un préalable indispensable à l’étude du potentiel évolutif des organismes. Quelle est la meilleure manière de délimiter une espèce ?
L’idée générale derrière la définition de l’USC (De Queiroz, 2007) va être de multiplier les critères diagnostiques afin d’appuyer une hypothèse de délimitation d’espèces. Délimiter une espèce revient alors à rechercher de tels critères qui vont regrouper les individus étudiés sous différentes entités. La zone grise, décrite par de De Queiroz (2007) définit une zone de conflit dans laquelle les espèces ne sont pas entièrement séparées, correspondant à la zone de spéciation, jusqu’à ce qu’il y ait un isolement reproducteur total entre les deux espèces naissantes. Dans cette zone grise, le nombre de critères permettant de mettre en évidence la divergence croissante entre populations et la séparation en deux lignées va augmenter, d’où l’intérêt de multiplier ces critères dans le but de trouver lequel ou lesquels sera/seront diagnostique(s) pour déterminer l’état de spéciation entre ces lignées.
La difficulté de l’application de l’USC et de la délimitation d’espèce réside dans le problème du choix de critères fiables pour distinguer les lignées (Gélin et al., 2017). Notamment pour contrer cette difficulté, Pante et al. (2015) proposent d’associer la taxonomie intégrative au concept de zone grise. La taxonomie intégrative est définie comme une approche de recherche taxonomique qui vise à incorporer différents types de données et méthodes utilisées classiquement en systématique dans le but de documenter la biodiversité et les processus évolutifs promouvant la divergence (Fujita et al., 2012). La figure 3.1 montre l’utilisation de la taxonomie intégrative pour la délimitation d’espèces. La première étape est de définir une hypothèse d’espèces primaire (« PHE ») qui sera testée par différents critères (la morphologie et/ou des marqueurs moléculaires) pour arriver à une première délimitation d’espèces. Ensuite, cette hypothèse sera confrontée à d’autres types de critères d’ordres phénétiques, phylogénétiques et biologiques (Samadi et Barberousse, 2015), ce qui amènera une nouvelle délimitation d’espèces (affirmant ou réfutant la PHE) et au concept d’hypothèse d’espèces secondaire (« SHE »).

Table des matières

 Chapitre 1 Introduction
1.1 Stratégies de réponse aux stress
1.2 Les mécanismes de l’adaptation locale
1.2.1 Le potentiel d’adaptation
1.2.2 Conditions pour la mise en place de l’adaptation locale
1.3 Les changements environnementaux
1.3.1 Le changement climatique
1.3.2 Les stratégies de réponse face au changement climatique
1.3.3 L’adaptation locale comme outil pour l’estimation du potentiel d’adaptation dans le cadre du changement climatique
1.3.4 Le changement environnemental et les Cnidaires
1.4.1 L’Embranchement des Cnidaire
1.4.2 La Classe des Anthozoaires
1.4.3 La symbiose
1.4.4 Anemonia viridis (Forskål, 1775)
1.5 Objectifs de la thèse
Chapitre 2 Stratégies expérimentales 
2.1 Détection des variations génétiques et marqueurs moléculaires choisis
2.1.1 Les marqueurs EPIC
2.1.2 Les marqueurs RADseq
2.2 Stratégie expérimentale pour la délimitation des espèces chez Anemonia viridis
2.2.1 Stratégie d’échantillonnage
2.2.2 Marqueurs moléculaires
2.2.3 Clefs d’analyse
2.3 Stratégie expérimentale pour la détection de l’adaptation locale chez Anemonia viridis
2.3.1 Stratégie d’échantillonnage
2.3.2 Marqueurs moléculaires
2.3.3 Clefs d’analys
Chapitre 3 Délimitation d’espèces au sein d’Anemonia viridis
3.1 Le concept d’espèce 
3.1.1 Espèces cryptiques
3.1.2 Variation morphologique sans spéciation
3.1.3 Délimitation d’espèces
3.1.4 Mécanismes de spéciation
3.2 Le cas d’Anemonia viridis
3.2.1 Classification des Actiniaires
3.2.2 Les morphes d’Anemonia viridis
3.3 Analyse du statut taxonomique des morphes d’A. viridis
3.3.1 Article 1
3.3.2 Article 2
3.3.3 Résultats majeurs et conclusion synthétique
Chapitre 4 Adaptation locale chez Anemonia viridis 
4.1 Introduction
4.2 Results and discussion
4.3 Conclusion
Chapitre 5 Conclusions et Perspectives
5.1 L’origine des morphes d’Anemonia viridis
5.2 Adaptation locale et plasticité phénotypique chez Anemonia viridis
Annexe A : Protocole de mise au point des EPICs
Annexe B : Protocole de mise au point des banques RAD
Annexe C Local adaptation in A. viridis: material and methods
Annexe D : Ensemble des individus du RADsequencing
Glossaire

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