Les matériels et les réactifs pour le prélèvement du donneur de sang 

Test de validation

Ces tests utilisent une technique d’immunotransfert. Les antigènes viraux, souvent identiques ou voisins des antigènes utilisés dans le test de détection correspondant sont mobilisés sur des bandelettes de nitrocellulose en bande parallèle après transfert à partir d’un gel de migration électrophorétique. Les bandelettes de nitrocellulose sont incubées avec les sérums ou plasma testés et des contrôles positifs et négatifs. Si des anticorps anti-VHC sont réellement présents, ils réagissent avec les antigènes fixés sur les bandelettes. La réaction est ensuite révélée par immunoenzymologie et l’intensité de la bande est proportionnelle à la quantité d’anticorps spécifique fixés à l’antigène recombinant.
Plusieurs tests sont disponibles sur le marché parmi lesquels : RIBA 3.0, HCV SIA (ortho diagnostic system), WESTERN BLOT HCV (Murex diagnostic), MUTIX HCV 3.0 (Abott diagnostic).

Le diagnostic direct

L’importance des hépatopathies NANB dans la pathologie virale hépatique et notamment post transfusionnelle a fortement stimulé la recherche de test de diagnostic sérologique et moléculaire afin de pouvoir les identifier et mieux comprendre leur évolution [14]. L’amplification génomique par PCR introduite en 1985 par les chercheurs de la firme « Cetus » [22] permettant d’obtenir des copies d’ADN spécifiques constitue à ce jour une véritable révolution dans ce diagnostic. Pour le VHC cette amplification nécessite une première étape dite transcriptase reverse qui consiste en une transformation de l’ARN viral en ADN grâce à une transcriptase reverse. L’amplification génomique par PCR comporte 3 étapes [22] :
? La première étape consiste en une dénaturation de l’ADN double brin par rupture des ponts d’hydrogène à température élevée aboutissant à la libération d’ADN simple brin.
? La deuxième étape réalisée à basse température permet le couplage aux deux brins d’ADN issus de l’étape précédente, de deux amorces oligonucléotidiques complémentaires ; l’une de la région 5’et l’autre de la région 3’ de la cible.
? Pendant la troisième étape, l’utilisation d’une polymérase permet la synthèse d’un brin complémentaire par extension à partir des amorces dans le sens 5’ – 3’.
Il en résulte un dédoublement de la séquence initiale puisque les deux brins issus de l’étape 1 sont copiés.
L’opération est ensuite recommencée avec pour chaque cycle :
? Un temps de dénaturation de l’acide nucléique à 95 °C pendant 1 mn ;
? Un temps d’hybridation avec les amorces à 37 °C pendant 1 mn ;
? Un temps d’extension des amorces à 72 °C pendant 2 mn.
L’amplification qui requiert environ 35 cycles est ensuite achevée par extension de 10 mn à 72 °C.

Diagnostic clinique

L’hépatite aiguë

Lorsque le virus est introduit par voie sanguine dans l’organisme, il va gagner le foie. Il provoque alors après une période d’incubation moyenne de 2 mois une hépatite aiguë. Il s’agit d’une période totalement silencieuse où la quantité du virus n’est pas suffisante pour provoquer des signes cliniques ou perturber les résultats des prises de sang.
Lorsque la quantité de virus devient suffisante, l’infection virale conduit à une destruction des cellules hépatiques et provoque une augmentation très importante des transaminases dans le sang qui peut atteindre 50 ou 100 fois plus que la limite supérieure des valeurs normales.
Neuf fois sur dix, il n’y a pas de signes cliniques (totalement asymptomatiques), une fois sur dix, on a :
? Syndrome grippal : fièvre, céphalées, douleurs musculaires, abdominales et articulaires, fatigue.
? Des signes digestifs : perte d’appétit (anorexie) nausées, diarrhées, douleurs dans la région du foie.
? Parfois éruption cutanée de type urticaire : ces signes peuvent être suivis par l’apparition d’un ictère. Ils mettent plusieurs semaines à disparaître.

Le déroulement de l’infection aiguë

? Apparition de l’ARN du VHC premier marqueur, dans le sérum 7 à 21 jours après la contamination.
? Augmentation des transaminases sériques au delà du 15ème jour, souvent au delà de 4 semaines après la contamination.
Les symptômes cliniques, en particulier l’ictère, dans 10 % des cas 2 à 12 semaines après la contamination et disparaissent rapidement. Les anticorps anti-VHC apparaissent dans le sérum 20 à 150 jours après la contamination.
L’évolution habituelle de l’hépatite aiguë est la guérison car les cellules de défense détruisent toutes les cellules hépatiques infectées ce qui permet d’éliminer le virus. Les transaminases redeviennent normales, les cellules détruites se régénèrent et le foie redevient normal.

L’hépatite chronique

L’évolution vers la chronicité est désormais bien démontrée [35]. Par définition, on parle d’hépatite chronique lorsqu’une hépatite aiguë n’a pas guéri après 6 mois d’évolution. Les cellules de défense de l’organisme se révèlent incapables d’éliminer toutes les cellules infectées et le virus persiste au long cours dans le foie.
Comme dans l’hépatite aiguë, les cellules détruites régénèrent. Toutefois, chez certaines personnes, se développe progressivement une fibrose, qui est un tissu cicatriciel irréversible. La fibrose délimitera progressivement des nodules : on parle alors de cirrhose. Lorsque la cirrhose est constituée, il n’y a pas obligatoirement de troubles, il peut même n’y avoir aucun signe.
Toute fois, lorsque la fibrose progresse, elle finit par étouffer les cellules hépatiques normales, et entraîner des manifestations qui peuvent être graves.
La cirrhose peut survenir au terme de 20 années d’évolution dans environ 30 % des cas.
Par la suite cette cirrhose peut se compliquer en provoquant un cancer du foie survenant chaque année pour 4 à 5 % des cas de cirrhose. Certains facteurs accélèrent l’évolution de la maladie :
? Age élevé au moment de la contamination (40-50 ans) ;
? Sexe masculin ;
? Alcool (consommation quotidienne supérieure à 40 – 50 g) ;
? Poids élevé ;
? Co-infection par le VIH ou le VHB ;
? Tabagisme ;
? Poly toxicomanie (Benzodiazépines, ecstasy, médicaments, …)

Le Cancer du foie

Les malades atteints de cirrhose ont un risque de développer un cancer du foie.
Généralement, les cancers du foie de petite taille peuvent être guéris alors que ceux évolués sont malheureusement peu accessibles au traitement et peuvent conduire au coma et à la mort (dans de nombreux cas, le diagnostic est tardif).

L’insuffisance hépatique

Elle traduit une destruction importante du tissu hépatique fonctionnel. Le foie ne peut plus alors effectuer son travail et épurer les toxines de l’organisme. Les troubles sont constants et associent souvent une fatigue importante, une jaunisse, un amaigrissement.
L’importance de l’atteinte du tissu hépatique fonctionnel est appréciée par le TP ou taux de prothrombine.

L’hypertension portale

Le foie est traversé par une grosse veine au débit important : la veine porte, qui draine le sang en provenance du tube digestif.
En cas de cirrhose, le sang ne peut pas traverser le foie en raison des transformations tissulaires consécutives à la fibrose. La pression dans les veines portes augmente. Le sang emprunte alors les itinéraires secondaires pour « court – circuiter » le foie.
Il passe par des veines situées dans la paroi de l’oesophage. Ces veines se dilatent et se transforment en véritables varices.
L’hypertension portale peut par ailleurs être responsable de l’accumulation de liquide dans la cavité abdominale : « l’ascite » qui nécessite parfois des ponctions.

Le traitement et la prophylaxie

Le traitement

Quand une hépatite C chronique est suspectée, on procède à une ponction biopsie hépatique (PBH). La décision de traiter repose sur les résultats de cette biopsie. La PBH à pour objectifs :
? Déterminer le stade précis d’évolution de la maladie ;
? D’aider à la décision pour le traitement ;
? De permettre de clarifier les atteintes multifactorielles.
En plus de la PBH, une nouvelle technique d’évaluation du degré de fibrose a été mise en place. Il s’agit du fibrotest c’est à dire d’un dosage sanguin de cinq marqueurs biochimiques de fibrose (Gamma GT, Bilirubine, Haptoglobine, Apoliprotéïnes , Alpha 2 macro globulines).
Ce fibrotest permettra d’éviter la PBH une fois sur 2. Le traitement a pour but d’éliminer le virus et d’améliorer l’état du foie ; il repose bien sure, sur des traitements spécifiques mais il est essentiel d’insister sur le mode de vie.

Lors de la phase aiguë

Le traitement par interféron gamma permet de multiplier par 10 la réponse complète prolongée. Actuellement, l’hépatite aiguë doit être traitée lorsque l’ARN du virus C devient positive au décours d’un accident d’exposition au virus C. L’intérêt d’un traitement préventif n’a pas été démontré. Le traitement par interféron : 3 millions d’unités administrés 3 fois par semaine pendant 3 mois permet d’obtenir une réponse prolongée dans 41 % des cas [37]. Pour augmenter la réponse, certains auteurs insistent sur l’intérêt d’un traitement à forte dose d’interféron (10 millions d’unités par jour pendant 1 mois en moyenne permettent d’augmenter cette réponse de 90 %).
─ Lors de la phase chronique
Le traitement combiné interféron et ribavirine doit être proposé ; s’il n’y a pas de contre indication car une réponse prolongée est obtenue chez plus de 40 % de patients après 12 mois de traitement combiné contre seulement 20 % après 12 mois de traitement l’interféron seul. Ce traitement associe l’interféron 3 millions d’unités 3 fois par semaine et la ribavirine 1 000 à 1 200 mg par jour. Une réponse virale prolongée est définie par la disposition de l’ARN viral C qui ne devient plus détectable au-delà d’un an après traitement, le risque de rechute à long terme est pratiquement nul. La durée du traitement dépend du génotype et du niveau de la charge virale.
La transplantation hépatique est indiquée chez les malades ayant une cirrhose décompensée ou compliquée par un cancer de petite taille sans extension autre que le foie. Il existe un risque de réinfections du greffon par le virus C après la transplantation mais le risque de récidive d’une cirrhose est faible (moins de 10 % à 5 ans).

La prophylaxie

A côté du traitement antiviral, d’autres précautions sont fondamentales. Il s’agit de l’hygiène de vie et des précautions à prendre pour éviter la contamination et les complications.

Le régime alimentaire

L’existence du virus associé à une consommation régulière d’alcool majore de façon nette, les lésions au niveau du foie.
En cas de surpoids ou d’obésité, un régime amaigrissant peut être conseillé car ceci est un facteur de sensibilité hépatique. Par contre, il n’y a aucune restriction alimentaire et tous les aliments ( y compris les oeufs, le chocolat, les sauces contenant du vin …) sont autorisés.

Les précautions

Qu’un sujet soit malade ou porteur asymptomatique, il est indispensable de respecter certaines précautions. La transmission se fait par contact sanguin ; il faut donc éviter de partager des objets de toilette potentiellement contaminant comme les rasoirs, les brosses à dents, les coupe-ongles, le matériel d’épilation etc. En cas de blessure, il est nécessaire de bien désinfecter la plaie à l’aide d’antiseptique et de la protéger d’un pansement.
Aucune trace de sang ne doit persister. Il faut nettoyer les outils de travail à l’eau de javel diluée au ½ ou ¼ à partir de la bouteille d’1 litre. Le virus est peu transmissible par voie sexuelle mais en cas de partenaires multiples, l’usage de préservatifs est recommandé de façon systématique ainsi que pendant les périodes de règles et en cas de lésions génitales pour un couple stable.
Il n’existe aucune contre-indication à vivre en collectivité.

Le vaccin

Il n’y a pas à ce jour de vaccin disponible. Les difficultés rencontrées pour la mise au point d’un vaccin protégeant de façon efficace sont importantes.
En effet, il n’existe pas d’expérimentation possible chez l’animal en dehors du chimpanzé qui seul, avec l’homme peut développer la maladie. De plus, le virus est très variable et développe rapidement des mutations qui le rendent résistant à la protection immunitaire.
Il peut par contre être conseillé de se protéger contre le virus des hépatites A et B pour lesquels un vaccin est disponible.

MATERIELS ET METHODES

Lieu d’étude

Cette étude a été initiée par le Centre National de Transfusion Sanguine de Bamako (CNTS), centre de référence pour la collecte et la dispensation des produits sanguins et apparentés. Cette étude a été menée dans différents établissements situés à Bamako, Koulikoro et Sikasso. Nous avons voulu comparer les scolaires de Bamako par rapport aux scolaires de Koulikoro et de Sikasso du point de vue de la séroprévalence du VHC.
? Dans le district de Bamako les établissements suivants étaient concernés :
? La FMPOS (Faculté de Médecine, de Pharmacie et d’Odonto-Stomatologie) est située sur la colline du point G à côté de l’hôpital. Elle comportait au cours de l’année académique 2004 – 2005 5 335 étudiants dont 4 588 étudiants en médecine générale et 747 étudiants en pharmacie. Dans cette Faculté il y avait 4 087 garçons contre 1 248 filles.
? Le LDS : Lycée Doniba Samouka est situé en commune V à Baco Djicoroni. Il a été crée en octobre 1999. Il y avait 510 élèves dont 215 garçons contre 295 filles, répartis en 15 classes avec 54 enseignants.
? Le LSK : Lycée Soundiata KEÏTA est situé en commune V à Baco Djicoroni. Il a été crée en octobre 1999, comportait 726 élèves dont 448 garçons contre 278 filles avec 35 enseignants.
? INTEC : l’Institut des Nouvelles Technologies est situé en commune V à Baco Djicoroni. Il a été crée en mars 2000, comportait 450 élèves avec 30 enseignants.
? Le LMDB : Lycée Massamakan Diabaté est situé en commune V à Baco Djicoroni. Il a été crée en septembre 1996, comportait 3 483 élèves dont 2 461 garçons contre 1 022 filles avec 112 enseignants.
? Samaya est une zone périe – urbaine, situé à l’ouest, à quelques kilomètres de Bamako
? Dans la région de Koulikoro les établissements suivants étaient concernés :
? Le LDDK : Lycée Dioba DIARRA de Koulikoro est situé dans la ville de Koulikoro. Distant de 60 Kms de Bamako, il a été crée en Octobre 1997. il comportait 1 003 élèves dont 685 garçons contre 318 filles, repartis en 28 classes dont 4 laboratoires de Biologie avec 39 enseignants.
? Le LFCK : Lycée Famolo COULIBALY de Kolokani. Kolokani est un cercle de Koulikoro situé à 140 Kms de Bamako. Le LFCK a été crée en Octobre 1999, il comportait 468 élèves dont 380 garçons contre 88 filles avec 20 enseignants.
? Dans la région de Sikasso les établissements suivants étaient concernés :
? LIEEMA : Ligue des Elèves et Etudiants du Mali de Sikasso. Sikasso est la troisième région du Mali située à 380 Kms de Bamako.
? Le LKFB : Lycée Kalilou FOFANA de Bougouni. Bougouni est un cercle de Sikasso, situé à 160 Kms de Bamako. Le LKFB a été crée en Octobre 1980, il comportait 1 236 élèves dont 912 garçons contre 324 filles avec 44 enseignants, répartis en 23 classes dont 2 laboratoires de biologie et science physique.
Tous ces établissements cités ci-dessus sont publics à part LSK, INTEC et LDS qui sont des établissements privés. Ce choix se justifie par la proximité de ces établissements mais et surtout par rapport aux objectifs de la thèse.

La création et la mission du CNTS

Le CNTS a été crée par l’ordonnance N° 90 -38/P-RM du 5 Juin 1990.
L’ordonnance 041/P-RM du 20 Septembre 2000 lui confère le statut d’Etablissement Public à caractère Scientifique, Technologique, et Culturel (EPSTC) avec autonomie de gestion et le décret N°587/P-RM du 23 Novembre 2000 réglemente son fonctionnement.

La situation géographique

Le CNTS est situé en commune II du district de Bamako dans le quartier de Quinzambougou sur la rue ACHKABAD. Elle est contiguë au CFTQ (Centre de Formation Technique de Quinzambougou) sur la voie qui mène au Commissariat du 3ème arrondissement de Bamako.

Les locaux du CNTS

Le bâtiment est composé :
? D’un bloc administratif ;
? D’un bloc pour les laboratoires (Typage érythrocytaire, Immuno-sérologie, hémato-biochimie, traitement des prélèvements sanguins) ;
? D’une chambre froide ;
? D’un magasin de stockage de matériels ;
? D’une salle de garde ;
? De deux salles de consultations et suivi des donneurs ;
? Une salle de séparation.
En outre le centre dispose d’une salle de restauration pour les donneurs bénévoles de sang, d’un incinérateur de déchets biomédicaux, d’un groupe électrogène et d’un logement pour le gardien.

Le fonctionnement du CNTS

Les prestations assurées par le CNTS sont :
? La collecte du sang des donneurs en cabine close ou en équipe mobile ;
? La sensibilisation de la population au don de sang volontaire ;
? Les analyses de sécurité transfusionnelle afin de valider les produits sanguins selon les normes de l’OMS ;
? Le fractionnement des produits sanguins ;
? Les analyses dites « divers » concernent les prélèvements des non – donneurs ;
? La formation initiale et continue des étudiants et stagiaires dans le domaine de la transfusion sanguine ;
? La mise en oeuvre des projets de recherche par l’encadrement des étudiants en années de thèse.

Variables

Les aspects socio – démographiques (Age, Sexe, Statut matrimonial, Domicile, Notion de séjour) et biologiques (sérologie de l’infection par le VHC) ont été étudiés.

Déroulement de l’enquête

Nous avons commencé par chercher les autorisations au niveau des différentes académies d’enseignement et les centres d’animation pédagogiques (CAP) des établissements concernés. Nous avons ensuite contacté les responsables scolaires de chaque établissement dans le but d’obtenir leur adhésion et la mobilisation de leurs élèves et étudiants.
Avant de débuter l’enquête proprement dite, nous avons procédé à une rencontre avec les personnels d’encadrement des établissements afin de leur expliquer les objectifs et les bienfaits de l’étude, tout en insistant sur la confidentialité des résultats de cette enquête qui constituait une inquiétude pour certains d’entre eux.
De commun accord avec la direction et le personnel enseignant des établissements, une salle a été aménagée à chaque fois pour servir de lieu de prélèvement et d’interview pour certains et d’autres faisaient l’auto remplissage de la fiche d’enquête.
Durant toute la période de l’enquête, aucun problème majeur n’a été relevé ni du côté du personnel ni du côté des enquêtés.

Conception de la fiche d’enquête

Les fiches d’enquête ont été conçues et élaborées par nous mêmes sur la base de nos objectifs. Elles ont fait l’objet de discussions et de corrections d’une part lors des staffs par l’ensemble des Internes, des Assistants et par le Directeur de thèse et d’autre part par les épidémiologistes ainsi que tous les chercheurs dont l’intervention était nécessaire pour ce travail.

Collecte des données

Pour les besoins de cette étude, nous avons élaboré des questionnaires individuels comportant deux parties, chacune correspondant à un des objectifs de la thèse et qui ont été administrés aux enquêtés. Ce qui nous a permis ainsi de collecter les données (voir fiche en annexe).

Méthode d’études

Cette étude est une enquête prospective basée sur la collecte des fiches individuelles d’information biologiques et sociodémographiques des jeunes scolaires à Bamako,

Prélèvement et transport des échantillons de sang

Les prélèvements étaient réalisés dans des tubes secs numérotés qui étaient bouchonnés ensuite placés dans un portoir .Le transport au laboratoire était réalisé dans la même journée environ 4 heures après le prélèvement. Les échantillons étaient conservés à + 4°C en chambre froide.

Technique de prélèvement sur tube des enquêtés

Les scolaires sont prélevés par ponction veineuse franche. Nous attachons un garrot sur le bras, désinfectons le pli du coude, introduisons l’aiguille dans la veine et recueillons la quantité de sang nécessaire aux analyses sérologiques dans un tube sec. L’échantillon de sang était directement acheminé au CNTS.

La collecte des échantillons

Les tubes pour les analyses sérologiques étaient centrifugés à 1 500 tours par minute pendant 10 minutes et les sérums étaient conservés à 2-8°C avant d’être analysé.

Techniques utilisées

La démarche était la suivante :
Tout tube étiqueté VHC positif par une première technique subit un deuxième test différent du premier pour confirmer la sérologie VHC positif.

Table des matières

I INTRODUCTION
II OBJECTIF 
III GENERALITES
1. Rappels sur les hépatites virales
2. Le virus de l’hépatite C : VHC
2.1. Historique
2.2. Les caractéristiques du virus
2.3. L’organisation génomique
2.4. Classification des génotypes du VHC
3. L’histoire Naturelle de l’infection virale C
4. Répartition géographique
5. Les modes de contamination
5.1. Les produits sanguins
5.2. La toxicomanie
5.3. Les autres modes de transmission
5.3.1- La transmission sexuelle
5.3.2- La transmission mère – enfant
5.3.3- Le cas particulier des malades co-infectés par le VHC et par le VIH
5.3.4- La transmission nosocomiale
5.3.5- La transmission intrafamiliale
5.3.6- La contamination professionnelle
6. Le Diagnostic biologique
6.1. Le diagnostic indirect
6.2. Le diagnostic direct
7. Clinique
7.1. L’hépatite aiguë
7.2. L’hépatite chronique
7.3. Le Cancer du foie
7.4. L’insuffisance hépatique
7.5. L’hypertension portale
7.6. Les manifestations extra hépatiques :
8. Le traitement et la prophylaxie
8.1. Le traitement
8.2. La prophylaxie
IV MATERIELS ET METHODES
1. Lieu d’étude
1.1. La création et la mission du CNTS
1.2. La situation géographique
1.3. Le personnel du CNTS
1.4. Les locaux du CNTS
1.5. Le fonctionnement du CNTS
2. Type et période d’études
3. Population d’étude
4. Echantillonnage
4.1. Critères d’inclusion
4.2. Critères de non inclusion
4.3. Variables
5. Déroulement de l’enquête
5.1. Conception de la fiche d’enquête
5.2. Collecte des données
6. Méthode d’études
6.1. Prélèvement des donneurs de sang et collecte des échantillons
6.1.1. Technique de prélèvement sur tube des enquêtés
6.1.2. Les matériels et les réactifs pour le prélèvement du donneur de sang
6.2. La collecte des échantillons
6.3. Techniques utilisées
6.3.1. Dépistage sérologique du VHC
a.) Principe du test
b.) Composition de la trousse
c.) Matériels nécessaires mais non fournis
d.) Préparation des réactifs
e.) Mode opératoire
f.) Validation de l’essai et interprétation des résultats
6.3.2. Deuxième Test
a.) Domaine d’application
b.) Principe de la méthode
c.) Composition de la trousse
d.) Matériels nécessaires mais non fournis
e.) Préparation des réactifs
f.) Mode opératoire
g.) Validation et interprétation des résultats
7. Considérations éthiques
8. Traitement et analyse des données :
9. Moyen humain et matériel :
V RESULTATS DE L’ANALYSE
I. Aspects socio-demographiques des populations étudiées
II. Sérologie du VHC chez les populations étudiées
VI COMMENTAIRES ET DISCUSSIONS 
I. Aspect sociodémographiques des scolaires à Bamako, Koulikoro et Sikasso
1. Distribution des scolaires en fonction des établissements
2. Répartition des scolaires selon la classe d’âge
3. Répartition des scolaires selon le sexe
4. Répartition des scolaires selon le statut matrimonial
II. La sérologie du VHC chez les scolaires à Bamako, Koulikoro et Sikasso
1. La fréquence des anticorps anti-VHC chez les scolaires en fonction des établissements
2. La fréquence des anticorps anti-VHC chez les scolaires selon la classe d’âge
3. La fréquence des anticorps anti-VHC chez les scolaires selon le sexe
4. La fréquence des anticorps anti-VHC chez les scolaires selon le statut matrimonial
5. La séroprévalence du VHC chez les scolaires dans les trois localités :
VII CONCLUSION ET RECOMMENDATIONS
VIII REFERENCE BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE

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