Les lipides et leur métabolisme

Les lipides et leur métabolisme

Généralité

Rôle et classification des lipides

Les lipides sont un des quatre piliers essentiels des biomolécules avec les protides, glucides et acides nucléiques. Ils regroupent la plupart des composés hydrophobes retrouvés dans le vivant, et possèdent de multiples rôles fondamentaux dans les organismes vivants. Ils sont notamment à la base des différentes membranes, caractéristique essentielle des cellules, et forment une source énergétique sous forme de graisses ou d’huiles pour le stockage d’énergie à long terme des organismes. La classification des lipides a été révisée en 2005 (Fahy et al. 2009, lipidmaps.org). Les lipides sont alors définis comme étant : « des petites molécules hydrophobes ou amphiphiles qui sont issues totalement ou partiellement de condensations de thioesters par un mécanisme de carbanions ou/et condensation d’unités isoprènes par un mécanisme de carbocation ». Cette définition se réfère au mécanisme de synthèse des lipides, qui sera développé par la suite. Les lipides peuvent être classés en huit catégories , dont deux sont issues de la condensation d’unité isoprènes, les stérols et les prénols. Les stérols sont des molécules à quatre cycles qui ont des rôles physiologiques importants comme la modulation de la fluidité membranaire (Dufourc 2008) ou synthèse d’hormones stéroïdiennes (Nomura et al. 1999). Les prénols sont des composés insaturés qui sont généralement des antioxydants, colorants ou composées aromatiques (Zhuang and Chappell 2015). Il peuvent également rentrer dans la composition des membranes des Archaea (Jain et al. 2014). Leur membrane cytoplasmique a une composition tout à fait particulière il s’agit de prénols liés par des liaisons éthers, et non pas d’acides gras liés par des liaisons esters. Les cinq autres catégories ont pour origine la condensation de thioesters et sont les acides gras, les glycérolipides, les glycérophospholipides, les sphingolipides, les saccharolipides et les polycétides. Les polycétides sont un groupe très divers de molécules (Mutka et al. 2006; Liu et al. 2019), qui sont généralement des métabolites secondaires pouvant avoir des effets variés. Les acides gras représentent une catégorie fondamentale dans cette classification puisqu’ils servent de briques élémentaires à la synthèse de quatre autres catégories de lipides plus complexes : les glycérolipides, les glycérophospholipides, les sphingolipides et les saccharolipides.

Les acides gras, des briques élémentaires diversifiées

Les acides gras sont formés d’une fonction acide carboxylique polaire liée à une chaîne linéaire de carbone apolaire. Dans la majorité des cas, la chaîne aliphatique est linéaire avec ou sans insaturation(s), mais des acides gras avec des chaînes ramifiées (Jung et al. 2017), cycliques ou fonctionnalisées existent également. Ces modifications confèrent des propriétés variées qui dépendent des fonctions chimiques présentes.

Deux paramètres principaux sont pris en compte pour organiser et classifier la grande diversité de la famille des acides gras. Le premier paramètre est la taille de la chaîne carbonée. Ainsi, on distingue les acides gras à courte chaîne (2 à 5 carbones, aussi appelés acides gras volatils), de ceux à chaîne moyenne (6 à 12 carbones), longue chaîne (13 à 21 carbones) ou très longue chaîne (plus de 22 carbones). La notation conventionnelle des acides gras est CX, où X correspond au nombre de carbones, par exemple C18 se réfère à tous les acides gras avec une chaîne de dix-huit carbones. Les acides gras avec un nombre pair de carbone sont les plus commun, en particulier ceux à 16 ou 18-carbones (longue chaîne) sont retrouvés dans toutes les cellules, ce sont les acides gras majoritaires composant les membranes biologiques (sauf exception comme chez les Archaea (Jain et al. 2014). Les autres acides gras (à plus courte ou plus longue chaîne) sont accumulés seulement par certains organismes et ils ont des propriétés biologiques souvent spécifiques pour leur hôte (phyto) hormones, antimicrobiens, structuraux…). Par exemple, les plantes ont besoin d’acides gras à très longue chaîne pour la synthèse de cires (Yeats and Rose 2013; Bernard and Joubès 2013; Miklaszewska et al. 2018; Yuan et al. 2019) pour leur cuticule. Les acides mycoliques de la paroi des Mycobacterium sont synthétisés à partir d’acides gras très longue chaîne (Barry et al. 1998), et les modifications qu’ils portent sont cruciales pour leur survie et pathogénicité (Dubnau et al. 2002; Barkan et al. 2012). Les acides gras volatils sont synthétisés par le microbiote intestinal, en particulier par la flore microbienne des ruminants pour qui ils forment la principale source de carbone et d’énergie (Nolan et al. 2014). Chez certaines plantes comme le cocotier, l’huile des graines contient une haute quantité d’acide gras à moyenne chaîne comme réserve d’énergie (Bezard et al. 1971) .

Le second paramètre pour classer les acides gras est la présence de modifications chimiques sur la chaîne de carbone, en particulier le type de modification, leur position et orientation stéréochimique. Les acides gras saturés ne portent aucune modification et ils servent généralement de substrats pour la β-oxydation ou à synthèse d’acides gras modifiés (Legrand and Rioux 2015). La modification la plus commune et présente chez tous les êtres vivants est l’intégration de doubles liaisons (ou insaturations) dans la chaîne carbonée, qui donne des acides gras mono-insaturés ou poly-insaturés selon qu’il y en ait une ou plusieurs . La conformation cis, ou Z, est de loin la plus courante mais certains organismes synthétisent des acides gras possédant une double liaison trans, comme c’est le cas par exemple de la flore ruménique qui modifie la composition des lipides des ruminants (Wilczek et al. 2017; Gamarra et al. 2018). L’hydrogénation partielle des huiles végétales riches en acides gras poly-insaturés conduisent aussi à la formation d’acides gras trans (Wilczek et al. 2017; Zhao et al. 2018). La nomenclature associée est CX:Y, où Y est le nombre d’insaturations de l’acide gras. Pour préciser d’avantage la position de la ou des doubles liaisons, il est possible d’utiliser la notation ΔZ , où Z est le numéro du carbone où commence la double liaison. Par exemple, C18:1 Δ9cis correspond à l’acide octadéc-9cis énoïque, couramment appelé acide oléique . La présence d’une ou plusieurs insaturations dans la chaîne carbonée, ainsi que leur placement et stéréochimie, modifie profondément les propriétés des acides gras(Shanklin and Cahoon 1998).

Les insaturations sont aussi responsables du phénomène de rancissement, c’est-à-dire de l’oxydation des doubles liaisons, ce qui conduit à la formation d’hydropéroxydes (Kaneko et al. 1996; Evans et al. 1998) puis, si l’oxydation continue, divers produits de plus courtes chaîne comme des aldéhydes sont formés (Frankel 1988). Plus il y a d’insaturations présentes, plus la sensibilité à l’oxydation est forte (Evans et al. 1998; Zhang et al. 2015). Cela peut dégrader les propriétés initiales du produit, en particulier dans le domaine alimentaire car ces composés ont généralement des odeurs ou saveurs désagréables. Mais certaines applications sont basées sur cette propriété, comme dans les huiles siccatives de peinture qui, grâce à leurs hautes teneur en acide gras poly-insaturés, peuvent de réticuler et former un polymère protecteur (Stenberg et al. 2005; Sharmin et al. 2007). Techniquement, une huile siccative doit contenir une moyenne de 2,2 groupement R-CH=CH-CH2-CH=CH-R’ (bis-allylique) par triglycéride (Samuelsson and Johansson 2001). L’une des huiles les plus utilisée dans ce domaine est l’huile de lin, car elle peut se réticuler dans les conditions ambiantes. Cette huile est très riche en acide linoléique (C18:2 Δ9c,12c) et α-linolénique (C18:3 Δ9c,12c,15c).

Dans le domaine alimentaire, les acides gras poly-insaturés sont particulièrement intéressants car ils ont des effets bénéfiques sur la santé comparés aux acides gras trans ou saturés. Les acides eicosapentaénoïque (C20:5 Δ5c,8c,11c,14c,17c ) et docosahexaénoïque (C22:6 Δ 4c,7c,10c,13c,16c,19c), trouvés par exemple dans les huiles de poissons, de micro-algues ou de crustacées, permettent ainsi par exemple une diminution du risque cardio-vasculaire, la prévention du diabète de type 2 et la réduction des inflammations chroniques (Nakamura and Nara 2003; Jiao et al. 2015). À l’inverse, plusieurs études ont montré que les acides gras trans (hors acide gras conjugué) ont des effets néfastes pour la santé sur de nombreux critères, en particulier les risques cardiovasculaires (Wilczek et al. 2017; Zhao et al. 2018).

Il est à noter que lorsque la fonction carboxylique est remplacée par une autre, comme une fonction hydroxyle ou aldéhyde, on parle alors respectivement d’alcool gras et d’aldéhyde gras. Ces molécules ont également un intérêt pour l’industrie. Par exemple l’octanal est utilisé en parfumerie et agroalimentaire pour son parfum de fleurs et fruits et le dodécanol sert comme précurseur au sodium-dodécyl sulfate, un tensioactif . Ces composés peuvent être obtenus par synthèse pétrochimiques ou ils peuvent être biosourcés, par exemple à partir d’huiles, de graisses ou de cires (par extraction directe ou après modification chimique (réduction) à partir des acides gras). Or certaines enzymes, comme les acyl Coenzyme A (acylCoA) réductases (par exemple Tyto alba FAR1) sont capable d’effectuer la réduction des acylCoA directement en alcools gras. Des productions ont déjà été obtenues chez Escherichia coli (Liu et al. 2013; Liu et al. 2014), Saccharomyces cerevisiae (Yu et al. 2017; Hu et al. 2018) ou Yarrowia lipolytica (Wang et al. 2016).

Table des matières

Introduction générale
Chapitre I. Étude bibliographique
1. Les lipides et leur métabolisme
Généralité
a. Rôle et classification des lipides
b. Les acides gras, des briques élémentaires diversifiées
c. Les lipides complexes dérivés des acides gras
Les glycérolipides
Les glycérophospholipides
Les sphingolipides et saccharolipides
d. Métabolisme des lipides
Synthèse des acides gras par le complexe acide gras synthase
Allongement des chaînes d’acides gras par les élongases
Modification des acides gras par l’ajout d’insaturations
Acylation des acides gras par les acyltransférases : triacylglycérols,
phospholipides et stéryl-ester
Dégradation via β-oxydation
Hydrolyse des lipides
Les acides gras inhabituels et leurs usages
a. Rôles physiologiques et intérêt biotechnologique
Acides gras possédant des doubles liaisons conjugués
Acides gras possédant une ou plusieurs triples liaisons
Acides gras possédant une ou plusieurs fonction(s) époxyde(s)
Acides gras possédant une ou plusieurs fonction(s) hydroxyle(s)
Conclusion
b. Panel des enzymes responsables des modifications inhabituelles des acides gras
c. Les rôles des transférases et d’autres enzymes dans l’accumulation des acides gras inhabituels
2. Les enzymes de la famille des désaturases
Les désaturases solubles
a. Caractéristiques générales
b. Les bases de leur régiospécificité
Les désaturases membranaires
a. Généralités
b. Classement des désaturases membranaires
c. Les premières structures des désaturases membranaires
Mécanisme catalytique
Activités inhabituelles et ingénierie des désaturases pour moduler leur spécificité
a. Les conjugases et acétylénases
Les conjugases
Les acétylénases
b. Les hydroxylases et époxydases
Les hydroxylases
Les époxydases
3. Utilisation de la levure oléagineuse Yarrowia lipolytica pour la production d’acides gras inhabituels
Généralités
a. Classement phylogénétique et caractéristiques micro- et macroscopiques
b. Espèces du genre Yarrowia
c. Caractéristiques physiologiques et physico-chimique
d. Outils génétiques
e. Applications industrielles
Agroalimentaire
Valorisation de la biomasse (protéines et lipides)
Acides organiques et polyalcools
Lipides à haute valeur ajoutée et dérivés de lipides
Souche OléoX et production d’acide ricinoléique
Chapitre II. Matériels et Méthodes
1. Souches
Souches bactériennes
Souches châssis de Yarrowia lipolytica
a. Souche OléoX
b. Souche OléoX zêta
c. Souche OléoX ΔPAH1
d. Conservation des souches châssis et témoins de Y. lipolytica
2. Milieux de cultures
Milieux pour Escherichia coli
Milieux de culture pour Yarrowia lipolytica
3. Biologie moléculaire
Description des plasmides
a. Plasmides pour l’amplification des cassettes d’expression chez Y. lipolytica
Plasmide Jmp62
Les séquences hétérologues et endogènes (sur)exprimées
b. Plasmides réplicatifs pour la délétion CRISPR-Cas9
c. Plasmide pour construire les cassettes de délétion
Extraction d’ADN plasmidique
Purification de produits PCR et de fragments d’ADN
Extraction de l’ADN génomique de Y. lipolytica pour son amplification
a. Procédure Miniprep
b. Procédure PCR sur colonie
c. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
Mutagénèse dirigée
Électrophorèse de l’ADN
Séquençage
Transformations des souches
a. Souches Escherichia coli
Souches compétentes XL1-Blue
Souches commerciales Stellar
b. Souches Yarrowia lipolytica
Délétion du gène PAH1 chez Yarrowia lipolytica
4. Suivi des cultures
5. Analyse des lipides
Transméthylation des culots cellulaires
Silylation de la phase décane
Analyse de la composition en acide gras par chromatographie en phase gazeuse
6. Bio-informatique
Alignements et détermination des structures secondaires
Modélisation
Chapitre III. Résultats
Partie 1. Produire de l’acide ricinoléique de façon robuste et reproductible : optimisation du système de production
Développement d’un système de culture et d’analyse reproductible de type
« fermentation extractive »
a. S’affranchir de la variabilité due au milieu de culture hétérogène
b. Un constat : l’acide ricinoléique est délétère pour la souche OléoX
c. Un mode de culture de type « fermentation extractive » pour limiter la toxicité de l’acide ricinoléique
d. Effet du nouveau mode de culture sur la croissance et l’état physiologique des cellules
e. L’analyse des acides gras des cultures en présence de phase décane
Nouvelles méthodes d’analyse et d’extraction
Localisation des acides gras
Effet sur la quantité d’acides gras produite et variabilité
f. Amélioration du milieu de culture
Source de carbone et ratio carbone/azote
Effet d’une supplémentation en fer sur la production d’acide ricinoléique
g. Conclusion et Perspectives
La conservation des souches productrices d’acide ricinoléique et leur stabilité
a. Récapitulatif des modifications déjà apportées à la souche châssis OléoX
b. La nécessité d’utiliser des souches fraichement transformées pour avoir une production reproductible d’acide ricinoléique
Amélioration de la souche châssis capable d’une expression reproductible
a. L’ajout d’une plateforme d’intégration dans la souche OléoX pour améliorer la reproductibilité de l’expression
b. Construction de la souche
c. Validation de la souche
d. Discussion
Conclusion générale

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