Les jonctions intercellulaires

Les jonctions intercellulaires

Matériel et méthodes

Immunobuvardage de type « Western Blot »

Immunobuvardage sur embryons de drosophile

Les mouches adultes ont été mises dans des cages où sont déposés des pétris rempli d’un milieu où, pour 30 pétris, on a autoclavé 30g/L d’agar, 700mL d’eau, 250 mL de jus de pomme concentré avec 10 mL de méthylparaben 10% ont été ajouté. Sur ce milieu, nous déposons de la levure humide afin de favoriser la ponte. Les embryons ont été récoltés après une ponte de 17 heures (O/N) à 25 C dans le but d’obtenir des embryons à tous les stades de l’embryogenèse. Alternativement, des collections plus courtes ont été effectuées dans le but d’obtenir des embryons à des stades spécifiques de l’embryogenèse : stades 11 à 13 (stades mi-embryogenèse) ou stades 15 à 17 (stades tardifs). Les embryons ont été déchorionnés 5 minutes dans de l’eau de javel (NaClO) diluée 1 :2, puis lysés dans du tampon de lyse au Triton froid (1% Triton X-100, 50 mM TRIS HCL pH 7,5, 5% Glycérol, 100 mM NaCl, 50 mM NaF, 5mM EDTA pH8, 40 mM β-glycérophosphate, 1mM PMSF, 0,5 μg/mL aprotinine, 0,7 μg/mL pepstatine, 0,5 μg/mL leupeptine et 0,1 mM orthovanadate). Le lysat a été centrifugé pendant 10 minutes à 13 000 rotations par minute (rpm) pour éliminer les débris cellulaires. Les échantillons ont été dosés par BCA (Fisher
# PI23223) selon le protocole du manufacturier, et du Laemmli (80% d’une solution de Tris-HCl 62.5 mM pH 6.8, 10% glycerol, 1% LDS et 0.005% Bromophenol Blue mélangée avec 20% beta-mercaptoéthanol) a été ajouté à 50 à 75 μg de lysat. Les échantillons ont été chauffés à 95 C pendant 5 minutes pour dénaturer les protéines, puis déposés sur gel SDS-PAGE à 6%, 7,5% ou 10% d’acrylamide. Le gel a migré pendant 13 à 14 heures à 10 mA à 4 C. Les protéines ont ensuite été transférées sur une membrane de nitrocellulose par transfert liquide à 260 mA pendant 5 heures dans du tampon de transfert (25 mM Tris, 192 mM glycine et 20 % méthanol). Les membranes ont été incubées pendant une heure dans une solution de blocage (lait 5% dans du PBS 1X (136.8 mM de NaCl, 2.7 mM de KCl, 8.1 mM de Na2HPO4 et 1.5 mM de KH2PO4) puis hybridées avec l’anticorps primaire O/N à 4 C suivi de lavages des membranes dans du PBS-Tween 0,05% et d’une hybridation d’une heure avec l’anticorps secondaire HRP. La révélation s’est faite avec une solution d’ECL (Tris 0,1 M, 0.5 % acide coumarique, 1 % luminol et 0,018
% de peroxyde d’hydrogène).

Immunobuvardage sur cellules S2

Les cellules ont été cultivées à 25 C dans du milieu « Schneider’s insect medium » (Wisent, Inc. numéro de catalogue 301-050-CL) complété avec 10% de FBS inactivé à la chaleur. Pour la transfection des cellules, du chlorure de calcium (CaCl2), de l’eau stérile et l’ADN recombinant ont été mélangés dans un tube. Après une incubation de 5 minutes, de l’HBS 2X (50 mM HEPES, 1.5 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl) au pH 7,04 a été ajouté. Le mélange a été déposé sur les cellules en culture. 48 heures après la transfection, les cellules ont été transférées dans un tube de 15 mL stérile, puis centrifugées à 0,9 rpm pendant 3 minutes. Le culot a été resuspendu avec du PBS 1X et les cellules ont été centrifugées une deuxième fois 3 minutes à 0,9 rpm. Le culot de cellules a été lysé avec du tampon de lyse Triton 1% (décrit dans la section 2.1). Le reste de la méthode est identique à celle employée pour l’immunobuvardage sur embryons de drosophile.

Immunoprécipitation

Immunoprécipitation sur embryons de drosophile

Les embryons sont récoltés aux stades indiqués, déchorionnés et lysés dans du tampon Triton 1%. Le lysat est centrifugé pour éliminer les débris et les protéines sont dosées au BCA (méthode décrite dans la section 2.1). Un minimum de 1 mg de lysat protéique a été incubé pendant une heure à 4 C avec 20 L de billes Protéine G Sepharose afin d’éliminer les protéines se liant non-spécifiquement aux billes. Ensuite, les échantillons ont été centrifugés pour éliminer les billes et incubés une heure à 4 C avec 2 μg de l’anticorps primaire indiqué ou avec l’équivalent en sérum pré-immun comme contrôle. Suite à cela, 20 L de billes Protéine G Sepharose (GE Healthcare) ont été ajoutées et les échantillons ont été incubés une autre heure à 4 C afin d’immunoprécipiter la protéine voulue et ses interacteurs. Ensuite, le surnageant a été aspiré et le culot de billes lavé 5 fois avec du tampon de lyse Triton 1%, puis les échantillons ont été préparés dans du Laemmli, dénaturés à 95 C et déposés sur gel d’acrylamide (méthode décrite dans la section 2.1).

 Immunoprécipitation sur cellules S2

Les cellules ont été lysées suivant la méthode décrite dans la section 2.1.2. Le lysat a été dosé au BCA et l’immunoprécipitation a été effectuée sur un minimum de 1 mg de protéines, suivant la même méthode d’immunoprécipitation que sur les embryons de drosophiles.

Essai phosphatase

Des embryons sauvages ou gir M/Z aux stades embryonnaires 11-13 et 15-17 ont été lysés soit dans du tampon de lyse au Triton (voir section 2.1. pour la composition du tampon) où la concentration d’orthovanadate a été augmentée à 10 mM afin de mieux inhiber les phosphatases, ou soit dans ce même tampon de lyse Triton mais auquel aucun inhibiteur de phosphatase n’a été ajouté (c’est-à-dire sans NaF, EDTA, β-glycérophosphate ni orthovanadate) et auquel une solution de 50 mM NaCl a été ajoutée pour remplacer les inhibiteurs de phosphatase. Du tampon PMP 10X et Mn 10X spécifiques à la lambda phosphatase (concentration finale : 50mM HEPES, 100mM NaCl, 2 mM DTT, 0.01 % Brij 35 et 1 mM MnCl2) ainsi que 200 U de Lambda Phosphatase (New England Biolabs) ont été ajoutés à 50 ou 75 μg de lysat d’embryons. Les échantillons ont ensuite été incubés 30 min à 30 C avec agitation, puis du Laemmli a été ajouté, les protéines ont été dénaturées à 95 C puis les échantillons ont été déposés sur gel d’acrylamide (méthode décrite dans la section 2.1).

Préparation de cuticule

Les pétris contenant les embryons ont été déposés dans un incubateur à 25 C pour un minimum de 20 heures afin de pouvoir bien distinguer les embryons morts (reconnaissables par leur couleur beige pâle à brun foncé) des embryons non-fécondés ou viables (blanc-transparent) qui ont à cette étape en majorité éclos. Avec une pince, les embryons morts ont été récoltés et déposés dans un panier pour ensuite être déchorionnés 5 minutes dans de l’eau de javel diluée 1 :2. Une fois déchorionnés, les embryons morts sont déposés sur une lame avec 97 μL de milieu de montage composé de 50% d’acide lactique et 50% de milieu Hoyer (0,6 g/mL de gomme arabique, 4 g/mL d’hydrate de chloral et 0,4 g/mL de glycérol), puis incubés 17h dans un four à 92 C.

Fixation de cellules S2, embryons et ovaires de drosophile

Fixation d’embryons de drosophile à la chaleur

Les mouches adultes ont été laissées dans une cage pour pondre pendant 17 heures à 25 C, puis les embryons ont été récoltés, déchorionnés 5 minutes dans de l’eau de javel 1 :2 et déposés dans des vials à scintillation contenant 5 mL de tampon E-wash (7% NaCl, 0.5% Triton X-100) à 80 C. Les embryons ont été refroidis immédiatement en introduisant le vial dans de la glace et en le remplissant de tampon E-wash à 4 C. Les embryons ont été lavés 3 fois avec du PBS 1X. 5 mL d’heptane ainsi que 1 mL de méthanol ont été ajoutés dans le vial, puis les embryons ont été dévitellinisés par agitation à 425 rpm pendant 30 secondes et incubés dans du méthanol pendant une heure à température pièce. Ils ont été ensuite entreposés à -20 C dans de l’éthanol 100% pour permettre une bonne conservation des embryons fixés.

Fixation d’embryons de drosophile au formaldéhyde

Une fois déchorionnés, les embryons ont été déposés dans un vial à scintillation contenant 3 mL de tampon PEM (50 mM EGTA, 2 mM MgSO4 et 100 mM PIPES) à pH 7.0, 2 mL de solution formaldéhyde 37% et 5 mL d’heptane. Ils ont été incubés dans ce mélange pendant 8 minutes à température pièce avec agitation. Suite à cela, la phase aqueuse a été extraite du vial, 1 mL de méthanol a été ajouté et les embryons ont été dévitellinisés par agitation à 425 rpm pendant 30 secondes. Ils ont été incubés dans du méthanol pendant 20 minutes et entreposés à -20 C dans de l’éthanol 100% pour conservation.

Fixation d’ovaires de drosophiles

Les femelles adultes ont été laissées à 25 C pendant 2 jours dans une bouteille contenant de la levure afin d’augmenter la taille des ovaires pour favoriser la dissection. Les ovaires ont été disséqués dans du PBS 1X en prenant soin de rompre la membrane pour la perméabiliser. Les ovaires ont été fixés suivant la méthode de fixation à la chaleur utilisée pour les embryons. L’immunofluorescence a été effectuée le même jour que la dissection et la fixation des ovaires.

 Fixation de cellules S2

Des lamelles ont été préalablement stérilisées avec de l’éthanol 100% et incubée avec 0,5 mg/mL de Concanavalin A (ConA) (Sigma-Aldrich, numéro de catalogue C5275-5MG). Les cellules ont été transfectées (méthode décrite dans la section 2.1.2) puis, 24 à 48h post-transfection, transférées sur les lamelles couvertes de ConA et incubées pendant 45-60 minutes pour que les cellules adhèrent complètement aux lamelles. Les cellules ont ensuite été rincées avec du PBS 1X, puis incubées 15 minutes dans une solution de PFA 4% diluée dans du PBS.

Immunofluorescence sur cellules S2, embryons et ovaires de drosophile

Immunofluorescence sur embryons ou ovaires de drosophiles

Les embryons ou ovaires ont d’abords été lavés, puis bloqués pendant une heure dans une solution NGT 5 % (5 % de sérum de chèvre normalisé (NGS) dilué dans du PBT 0,3 % (PBS 1X avec 0,3 % de Triton X-100)). Ils ont ensuite été incubés O/N à 4 C avec les anticorps primaires indiqués. Les embryons/ovaires ont été lavés et incubés 1 heure à température pièce avec les anticorps secondaires couplés au fluorochrome Alexa Fluor 488 ou Cyanine3 correspondant à l’espèce de l’anticorps primaire utilisé. Les embryons/ovaires ont été lavés puis déposés sur lame dans 65 L de milieu Vectashield (Vector Labs). Les lavages sont toujours effectués avec du PBT 0,3 %.

 Immunofluorescence sur cellules S2

Suite à la fixation, les cellules ont été lavées avec du PBT 0,3 % puis bloquées dans du NGT 5% pendant 1 heure à température pièce. Ensuite, les anticorps primaires indiqués ont été déposés sur un film de paraffine pour pouvoir y superposer les lamelles contenant les cellules et incuber le tout dans une chambre humide O/N à 4 C. Les cellules ont été lavées avec du PBT 0,3% puis incubées 1 heure à température pièce avec les anticorps secondaires couplés au fluorochrome Alexa Fluor 488 ou Cyanine3 correspondant à l’espèce de l’anticorps primaire utilisé. Les lamelles de 40 x 22mm ont été montées dans 13 L de milieu Vectashield (Vector Labs).

Table des matières

Chapitre 1 – Introduction
1.1 Présentation du modèle d’étude : Drosophila melanogaster
1.1.1 Le cycle de vie
1.1.2 Embryogenèse
1.1.3 Système UAS-GAL4
1.2 Les épithéliums
1.3 Les jonctions intercellulaires
1.4 La polarité apicobasale
1.4.1 Le domaine apical
1.4.1.1 Le module Par
1.4.1.2 Le module Crb
1.4.2 Le domaine basolatéral
1.4.2.1 Le module Scrib
1.4.2.2 Le groupe Yrt
1.4.3 Relation entre les déterminants apicaux et basolatéraux
1.5 La protéine Girdin
1.5.1 Présentation de la famille Girdin
1.5.2 Structure des protéines de la famille Girdin
1.5.3 Fonctions de Girdin
1.5.3.1 Liaison aux protéines G
1.5.3.2 Girdin et les voies de signalisation
1.5.3.3 Remodelage du cytosquelette d’actine
1.5.3.4 Régulation des microtubules
1.5.3.5 Régulation du transport vésiculaire
1.5.3.6 Girdin et les jonctions intercellulaires
1.5.3.7 Girdin et la polarité épithéliale
1.6 Polarité épithéliale et le cancer
1.6.1 Dérégulation de la polarité et TEM
1.6.2 Rôles des déterminants de la polarité dans le cancer
1.6.2.1 Les déterminants du domaine apical et la progression tumorale
1.6.2.2 Les déterminants du domaine basolatéral et la progression tumorale
1.6.3 Girdin et progression tumorale
1.7 Hypothèse et objectifs
Chapitre 2 – Matériel et méthodes
2.1 Immunobuvardage de type « Western Blot »
2.2 Immunoprécipitation
2.3 Essai phosphatase
2.4 Préparation de cuticule
2.5 Fixation de cellules S2, embryons et ovaires de drosophile
2.6 Immunofluorescence sur cellules S2, embryons et ovaires de drosophile
2.7 Microscopie, imagerie cellulaire et traitement des images
2.8 Génétique des drosophiles
2.9 Extraction d’ADNg de drosophiles
2.10 Anticorps
Chapitre 3 – Exploration de la relation fonctionnelle entre girdin et les principaux déterminants du domaine basolatéral
3.1 girdin et lgl
3.2 Girdin et Yrt
Chapitre 4 – Précision des mécanismes par lesquels Girdin régule le domaine basolatéral
4.1 Girdin et les JA : un rôle commun dans la polarité épithéliale?
4.2 Girdin et aPKC
4.3 Girdin et Crb
4.4 Girdin et Baz
Chapitre 5 – Discussion et conclusion
5.1 Discussion
5.1.1 Girdin et les déterminants basolatéraux
5.1.2 La polarité, Girdin et les JA
5.1.3 Girdin et les déterminants apicaux
5.2 Perspectives
5.3 Conclusion
Bibliographie

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