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Caractères bactériologiques
Morphologie
Les chlamydiae sont de minuscules bactéries mesurant entre 300 et 1000 nm de diamètre ayant de nombreux caractères avec les bactéries gram négatif.
Ce sont des microorganismes sphériques formés d’acide désoxyribonucléique (ADN) groupé en un filament génétique unique non limité et d’acide ribonucléique (ARN) réparti en formations ribosomales de différentes tailles dispersées dans une substance protoplasmique, elle-même limitée par une membrane à triple feuillet. Enfin, une paroi constituée de peptidoglycane pauvre en acide muramique confirme le caractère bactérien de ces organismes.
La caractéristique essentielle de ces bactéries est leur déficience énergétique qui empêche leur autonomie, et ceci fait que les chlamydiae sont des parasites cellulaires et explique également leur cycle de développement. Ce qui les donne un caractère unique dans la classification systématique des bactéries. [26]
Caractéristiques biologiques de la bactérie
La bactérie existe essentiellement sous deux formes, le corps élémentaire et le corps réticulé. Le corps élémentaire adapté au transit extracellulaire est incapable de se multiplier et constitue la forme infectieuse. Le corps réticulé, adapté au milieu intracellulaire, est non infectieux et constitue la forme métaboliquement active de la bactérie ; la forme réplicative.
De forme sphérique, le corps élémentaire est de petite taille (200 à 400 nm de diamètre), dense aux électrons, possède un nucléoïde excentré et une paroi rigide et épaisse. Les corps élémentaires sont limités par une membrane cytoplasmique et par une paroi proche de celle des bactéries à gram négatif,
composée d’une membrane interne et d’une membrane externe contenant du lipopolysaccharide (LPS) [60]. Cependant une caractéristique remarquable de la paroi de ces bactéries est l’absence de peptidoglycane. La membrane externe comprend plusieurs protéines riches en résidus cystéine : la MOMP. Ces protéines assurent la rigidité de la membrane par la présence de ponts disulfures intra et intermoléculaires et sont responsables de la remarquable résistance du corps élémentaire au stress mécanique et osmotique. La MOMP représente 60% du poids sec de la membrane externe. [21]
Cycle de développement
Les chlamydiae sont des bactéries à développement strictement intracellulaire.
Le corps élémentaire pénètre par phagocytose à l’intérieur de la cellule hôte.
Un constituant de la paroi bactérienne inhiberait la fusion phagosome-lysosome.
Le développement s’effectuera donc à l’intérieur d’une vacuole.
Quelques heures après la pénétration, le corps élémentaire se transforme en élément de plus grande taille à paroi souple, à acide désoxyribonucléique diffus, le corps réticulé, seul capable de se multiplier par fission binaire ; l’accumulation intra vacuolaire de ces différents éléments réalise l’inclusion qui grossit et présente vers la 36éme heure une population hétérogène comprenant des corps réticulés et par transformation de ceux-ci des corps élémentaires.
A la 72éme heure de l’infection, la cellule héberge une ou plusieurs inclusions intra cytoplasmiques dont l’évolution entraînera l’éclatement de la cellule parasitée avec libération de corps élémentaires capables d’infection de nouvelles cellules. Ainsi l’un des mécanismes du pouvoir pathogène est uniquement mécanique : cela explique la pauvreté des signes cliniques au début de l’infection chlamydienne.
L’existence de ce cycle complexe unique dans le monde microbien fait que toutes les bactéries le possédant sont groupées dans l’ordre des Chlamydiales avec une seule famille les Chlamydiaceae.
Entrée de la forme infectieuse par l’intermédiaire d’un corps d’inclusion, développement de la forme réplicative, puis sortie des formes réplicatives qui pourront infecter d’autres cellules. [72]
En résumé ; le cycle de développement peut être divisé en plusieurs étapes :
1. attachement initial du corps élémentaire à la cellule hôte ;
2. entrée dans la cellule hôte ;
3. différenciation des corps élémentaires en corps réticulés et multiplication des corps réticulés ;
4. différenciation des corps réticulés en corps élémentaires ;
5. relâchement des corps élémentaires.
Diagnostic au laboratoire
Diagnostic direct
Technique du prélèvement
Comme pour tout examen bactériologique, l’objectif est de mettre en évidence l’agent pathogène dans les sécrétions cervicales.
Comme la plupart des micro-organismes, parasites intracellulaires, les Chlamydiae sont très fragiles en dehors de l’hôte habituel. Il est impératif donc de recueillir un échantillon contenant surtout des cellules infectées plutôt que les simples sécrétions.
Les milieux de transport qui sont mis à la disposition des praticiens ne servent en réalité qu’à préserver la survie d’une partie des particules libres et la quantité de particules viables est d’autant plus importante que le temps écoulé après le prélèvement est plus court. Les basses températures prolongent la survie. Aucun milieu de transport n’est parfait et ne peut assurer la survie de la totalité des particules infectieuses, seules capables de résister en dehors des cellules infectées.
Il faut en revanche tenir compte du nombre important de bactéries commensales qui risque d’altérer la structure des particules infectantes de Chlamydia trachomatis.
Les sécrétions cervicales contiennent du mucus riche en protéases qui risquent de modifier la morphologie des corps élémentaires, de diminuer leur pouvoir infectant et de mettre ainsi en défaut certaines techniques de détection (culture, méthodes immunologiques).
Il est donc indispensable d’établir un protocole rigoureux de prélèvement que l’on s’efforcera de suivre scrupuleusement.
En voici le détail ;
1. prélever à la phase aigue de la maladie ;
2. prélever en dehors de tout traitement ou au moins deux à trois semaines après l’arrêt d’un traitement antibiotique ;
3. recueillir dans un milieu de transport contenant des inhibiteurs de la prolifération bactérienne (culture) ou dans un liquide d’extraction appropriée (détection d’antigènes, hybridation avec ou sans amplification) ;
4. transporter l’échantillon le plus rapidement possible au laboratoire sans dépasser le délai maximum de 24 heures.
Il ne faut pas oublier que les basses températures évitent la prolifération des bactéries saprophytes qui, en revanche, se multiplient à la température ambiante.
La qualité du prélèvement conditionne les résultats à partir desquels le praticien adoptera la thérapeutique.
Le matériel utilisé pour recueillir les échantillons est constitué par des écouvillons en dacron dont la taille diffère selon qu’ils s’appliquent à l’homme ou à la femme.
Les écouvillons rigides en matière plastique ou Bactopick, conviennent pour tous les types de prélèvement et sont souvent mieux acceptés que les écouvillons en dacron.
Par ailleurs on peut diminuer la douleur due au grattage en trempant au préalable le « Bactopick » dans le milieu de transport avant de l’introduire dans l’urètre chez l’homme. Chez la femme, le recueil au niveau du col est généralement indolore.
Actuellement, la recherche chez l’homme doit se faire par des techniques d’hybridation après amplification génique sur un échantillon d’urines fraîchement émises.
La mini brosse (cytobrush) assure un grattage efficace ; en revanche elle a l’inconvénient de ramener une grande quantité de mucus qui, dans certaines techniques, risque de gêner la détection des particules (méthodes immunologiques, amplification génique, etc.)
Pour faire le prélèvement chez la femme, elle doit être couchée en position gynécologique sur la table d’examen. Un spéculum à usage unique, non lubrifié, est introduit puis ouvert afin de positionner l’orifice du col dans la partie médiane du vagin. Avant tout recueil, il est nécessaire d’éliminer la glaire cervicale à l’aide de un ou plusieurs écouvillons en coton.
Si un examen bactériologique complet est demandé, on introduira tout d’abord un écouvillon dans le canal endocervical pour la recherche de Neisseria gonorhoeae et ensuite, un « Bactopick » ou une « brosse » en lui imprimant un mouvement de rotation afin de balayer toute la surface de la muqueuse endocervicale (Figure 3).
Les méthodes de détection
De nombreuses techniques de très bonne sensibilité et d’une excellente spécificité sont aujourd’hui disponibles pour détecter les particules chlamydiennes dans les prélèvements des voies génitales basses.
La recherche directe par immunofluorescence
Cette technique simple et rapide nécessite un simple frottis sur lame à partir de l’écouvillon qui a servi à faire le prélèvement.
Le réactif est un anticorps de souris qui reconnaît spécifiquement un épitope de la structure de la membrane externe de Chlamydia trachomatis.
Certains réactifs utilisent des anticorps monoclonaux anti LPS, dans ce cas des réactions croisées peuvent survenir avec d’autres bactéries particulièrement des
bacilles à gram négatif et donner lieu à de « faux positifs ». Elles ont l’avantage de détecter toutes les espèces de Chlamydia.
Cette technique peut servir de technique de confirmation à partir du tube de milieu de transport utilisé pour la culture dans les cas litigieux ou discordants.
En revanche son utilisation requiert une habitude de l’immunofluorescence et un parfait réglage des microscopes.
Techniques EIA
Elles détectent l’antigène LPS lipopolysaccharide à l’aide d’un anticorps poly clonal ou monoclonal conjugué à une enzyme (par exemple PAL) qui agit sur un substrat approprié en donnant une réaction colorée dont l’intensité est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre.
L’inconvénient majeur de ces techniques est leur tendance à donner de faux positifs, par réactions croisées avec d’autres bactéries. Dés lors leur emploi est limité à des situations bien précises et, nécessitent parfois le recours à des techniques de neutralisation.
Techniques d’hybridation :
Elles ont l’avantage de la rapidité d’exécution et une grande sensibilité, essentiellement liées au conjugué luminescent.
Les réactifs sont constitués de sondes DNA séquentielles. Ces sondes sont capables de s’hybrider spécifiquement avec les séquences de RNA ribosomal des Chlamydiae. De ce fait, l’échantillon prélevé au niveau du col ou de l’urètre ou d’autres liquides de sécrétion doit être recueilli dans un tube contenant une solution d’extraction définie.
Les hybrides double brin sont stables et d’autant plus abondants que les séquences d’ARN présentes sont plus nombreuses. La quantité de photons libérés, dans le milieu de réaction, est comparée à un témoin négatif. Les techniques d’hybridation ont l’avantage de pouvoir être envoyées au laboratoire sans aucune astreinte de milieu, de température, de conservation et offrent une plus grande souplesse de délai à température ambiante. Les sensibilité et spécificité sont comparables à celle de la culture.
Techniques d’amplification :
Il existe à ce jour plusieurs techniques d’amplification qui permettent de mettre en évidence le matériel génétique en très faible quantité, dans un échantillon d’urine par exemple.
Toutes ces techniques d’amplification utilisent pour ce faire des séquences oligonucléotidiques spécifiques des séquences de DNA-cible ou de RNA-cible qui dans des conditions bien définies permettent une réplication, à volonté, des séquences nucléotidiques spécifiques du plasmide que portent les souches de Chlamydia trachomatis.
Une amplification préalable de la cible à détecter améliore considérablement la sensibilité de détection et permet de l’appliquer à des échantillons contenant peu de bactéries, même non viables et, dans des échantillons où d’autres techniques seraient vouées à l’échec. C’est, par exemple, le cas pour les urines où la quantité de particules libres se trouve considérablement diluée. En revanche le recueil d’urines constitue un geste simple, non traumatisant, qui peut s’appliquer à tous sans discernement de sexe.
Chez l’homme, le recueil d’urines remplace avantageusement le prélèvement urétral, traumatisant et unanimement mal supporté.
Le recueil des urines ne doit pas exempter de réaliser un prélèvement au niveau du col, chez la femme, car c’est le site de prédilection de l’infection génitale à Chlamydia, la localisation urétrale étant inconstante.
A l’heure actuelle, plusieurs techniques d’amplification sont commercialisées :
PCR, TMA, LCR, SDA, etc.
– La PCR (Amplicor Roche)
C’est une amplification DNA du plasmide cryptique en présence de Taq polymérase et de déoxynucléotides triphosphates dans une série de cycles où les variations de température permettent des réplications successives de la même séquence (amplicons).
Des sondes oligonucléotidiques fixées sur plaque de microtitration permettent de capter et d’immobiliser les amplicons préalablement biotinylés. Ils seront révélés à l’aide d’un conjugué avidine-peroxydase.
La caractéristique de ce réactif est l’utilisation de désoxyuridine à la place de thymidine et à l’introduction, au départ de l’amplification d’Ampérase (Uracile N Glycolase) capable de détruire les amplicons résiduels (contaminants). De cette façon on peut éviter les contaminations provenant d’une amplification préalable.
– La TMA (Transcription Mediated Amplification : Bio Mérieux)
La cible amplifiée est un brin RNA qui, en présence de Transcriptase Reserve, formera un modèle DNA. Les cibles RNA amplifiées constituent les amplicons qui seront détectés à l’aide de sondes ADN simple brin, marquées avec un ester d’acridinium.
En présence d’eau oxygénée en milieu alcalin, il se produit une dégradation qui libère des photons dont la quantité est proportionnelle au nombre d’hybrides formés. Cette lumière émise est mesurée dans une photo luminométre et le calcul se fait automatiquement par rapport à la valeur seuil.
– La LCR ou Ligase Chain Reaction
Ce système d’amplification met en œuvre deux paires de sondes oligonucléotidiques qui reconnaissent deux séquences proches l’une de l’autre dans la cible ADN, laissant ainsi après leur fixation un espace libre entre elles qui sera comblé par une ligase.
La séquence toute entière sert ainsi de matrice pour le cycle suivant.
Bien que basée sur un principe un peu différent, ce type d’amplification va aboutir à la multiplication de séquences d’ADN contenues dans la cible. Il s’agit d’amplicons de nature ADN ce qui obligera à respecter les règles élémentaires de manipulation afin de ne pas contaminer les échantillons suivants avec un positif éventuellement amplifié.
– La SDA (Strand Displacement Amplification) [70]
Cette principe utilise comme cible d’amplification l’ADN plasmidique et met en œuvre une paire de sondes oligonucléotidiques. L’enzyme dans ce cas est l’ADN polymérase.
L’isolement sur culture cellulaire
C’est par définition la technique de référence car elle seule permet de détecter une infection évolutive, les particules infectantes ou corps élémentaires, viables, étant seuls capables d’infecter des cellules sensibles [17, 24, 26, 31, 70]
La culture cellulaire est venue remplacer l’inoculation à l’œuf de poule embryonné par voie intravitelline, il y’a une quinzaine d’années. [7]
Beaucoup de cellules de lignée continue peuvent être infectées par Chlamydia trachomatis mais les plus utilisées à l’heure actuelle sont des cellules Hep-2 qui proviennent de cellules d’un cancer du larynx humain. La résistance de ces cellules est grande et elles peuvent être dupliquées indéfiniment sans problème.
Le principe est simple et consiste à obtenir, sur un support inerte, traité pour la culture de tissus, une monocouche cellulaire qui forme un tapis uniforme. L’échantillon est recueilli au niveau du col à l’aide d’un écouvillon inerte (backtopick, dacron, cytobrush). Un prélèvement additionnel au niveau de l’urètre augmente la sensibilité de 23% [41]. L’échantillon est déchargé dans un millilitre d’un milieu liquide de préservation (milieu 2SP), puis mis en contact avec la couche cellulaire et centrifugé une heure à 2000 tours|min, dans une centrifugeuse équipée de nacelles.
Afin de favoriser la multiplication des bactéries, on bloque la multiplication des cellules en rajoutant au milieu de la cyclohéximide. Après 48 heures d’incubation on obtient la formation de colonies chlamydiennes appelées « inclusions » détectables à l’intérieur des cellules par simple coloration (Figure 5).
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Table des matières
NTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : Revue de la littérature
1. Les chlamydiae
1.1. Définition
1.2. Taxonomie
1.3. Caractères bactériologiques
1.3.1. Morphologie
1.3.2 Cycle de développement
1.4. Diagnostic au laboratoire
1.4.1. Diagnostic direct
1.4.1.1. Technique du prélèvement
1.4.1.2. Méthodes de détection
a. la recherche directe par immunofluorescence
b. techniques EIA
c. techniques d’hybridation
d. techniques d’amplification
e. l’isolement sur culture cellulaire
1.4.2. Diagnostic indirect : la sérologie
2. Les infections génitales à Chlamydia trachomatis
2.1. Historique
2.2. Epidémiologie
2.3. Physio pathogénie
2.4. Manifestations cliniques
2.4.1. Chez la femme
2.4.1.1. Infections génitales basses
a. Cervicites
b. Bartholinites, urétrites
2.4.1.2. Infections génitales hautes
a. Salpingites aigues
b. Salpingites chroniques
2.4.1.3. Complications
a. Stérilité
b. Grossesse extra utérine
c. Douleurs pelviennes chroniques
d. Péri hépatite : Syndrome de Fitz-Hugh-Curtis – 35e. Arthrite réactionnelle
f. Complications materno-fœtales
2.4.2. Chez l’homme
2.5. Traitement
2.5.1. Traitement curatif
2.5.1.1. Sensibilité de Chlamydia trachomatis aux antibiotiques
2.5.1.2. Principaux antibiotiques utilisés
a. Tétracyclines
b. Macrolides
c. Fluoroquinolones
2.5.1.3. Schémas thérapeutiques
a. Chez la femme
b. Traitement du ou des partenaire(s)
c. Traitement du nouveau-né
2.5.1.4. Surveillance du traitement
2.5.2. Traitement préventif
DEUXIEME PARTIE : Notre travail
1. Cadre d’étude
1.1. Le CHU A. Le Dantec
1.2. Le laboratoire de bactériologie virologie
1.2.1. Mission
1.2.2. Les infrastructures
1.2.3. Le personnel du laboratoire
2. Objectifs de l’étude
2.1. Objectif général
2.2. Objectifs spécifiques
3. Méthodologie
3.1. Type d’étude
3.2. Les critères d’inclusion
3.3. Les critères d’exclusion
3.4. Population d’étude
3.5. La collecte des données
3.6. Saisie et analyse des données
4. Résultats
4.1. Résultats descriptifs
4.1.1. Caractéristiques socio-démographiques
4.1.1.1. L’âge
4.1.1.2. La gestité
4.1.1.3. La parité
4.1.1.4. Le statut matrimonial
4.1.1.5. Le niveau d’instruction
4.1.1.6. La profession
4.1.1.7. Le type de protection utilisée pendant les règles 62
4.1.2. Les données cliniques
4.1.2.1. La provenance de la demande de prélèvement cervico-vaginal
4.1.2.2. Les motifs de la demande de recherche de Chlamydia trachomatis
4.1.2.3. Type de contraception utilisée
4.1.2.4. Symptomatologie clinique
a. Symptomatologie fonctionnelle
b. Signes cliniques
4.1.3. Données bactériologiques
4.1.3.1. Examen macroscopique des sécrétions vaginales
4.1.3.2. Résultats de la recherche de Chlamydia trachomatis
4.1.3.3. La recherche d’autres germes
4.2. Résultats analytiques
4.2.1. L’infection à Chlamydia trachomatis et l’âge de la patiente
4.2.2. L’infection à Chlamydia trachomatis et la gestité
4.2.3. L’infection à Chlamydia trachomatis et la parité
4.2.4. L’infection à Chlamydia trachomatis et le statut matrimonial
4.2.5. L’infection à Chlamydia trachomatis et le niveau d’instruction
4.2.6. L’infection à Chlamydia trachomatis et la profession
4.2.7. L’infection à Chlamydia trachomatis et
le type de protection utilisée pendant les règles
4.2.8. L’infection à Chlamydia trachomatis
et les motifs de la demande de prélèvement cervico-vaginal
4.2.9. L’infection à Chlamydia trachomatis et le type de contraception utilisée
4.2.10. L’infection à Chlamydia trachomatis et la grossesse
4.2.11. L’infection à Chlamydia trachomatis et la symptomatologie fonctionnelle
4.2.12. L’infection à Chlamydia trachomatis et l’aspect de l’exocol
4.2.13. Co-infection du Chlamydia trachomatis avec d’autres germes
TROISIEME PARTIE : Discussion
1. La fréquence
2. Les caractéristiques socio démographiques
-L’âge
-La gestité
-La parité
-Le statut matrimonial
-Le niveau d’instruction
-La profession
-Le type de protection utilisée pendant les règles
-La contraception
3. La symptomatologie clinique
4. L’infection à Chlamydia trachomatis et la grossesse
5. Co-infection Chlamydia trachomatis et autres germes
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
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