Soutenance mémoire
Données pharmacologiques
Effet hypotenseur
Valetas en 1939 a trouvé que l’injection chez le chien chloralosé de décocté de feuilles à 10 et 15 p. 100, à raison 2 ml/kg provoquait une hypotension fugace suivie d’une légère hypertension.
Activité cholagogue
Paris en 1942 a vérifié chez le chien l’action cholagogue et surtout diurétique par fistule du cholédoque et de l’urètre, et a émis l’hypothèse que l’action sur la sécrétion biliaire est en rapport avec la présence d’acide gallique à fort pouvoir cholagogue.
Activité diurétique
Balansard et coll. en 1952 ont montré chez le lapin que la diurèse provoquée par le décocté de feuille porte, non seulement sur l’élimination de l’eau mais aussi sur l’élimination des chlorures, de durée avec un certain retard. L´auteur conclut que la drogue est un diurétique tissulaire et hépato-rénal.
Activité antibactérienne
Laurens en 1983 a trouvé une action de l’extrait méthanolique des tiges feuillées sur Sarcina lutea, Streptococcus agalactiae, Staphphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Corynebacterium diphteriae, Escherichia coli, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae.
Activité antivirale
Ferrea et coll. en 1993 ont mis en évidence l’activité de l’extrait méthanolique in vitro sur les virus de Herpes simplex (HSV1 et HSV2). Cette activité est présente seulement après une semaine et non avec l’extrait fraîchement préparé. Les auteurs évoquent l’hypothèse de la présence de précurseurs inactifs qui se transforment en composés actifs seraient des tanins catéchiques condensés qui en milieu alcalin, subissent un réarrangement intramoléculaire et une autooxydation.
Caractères organoleptiques et macroscopiques
La détermination des caractères organoleptiques s’est effectuée par une observation de la couleur de drogue, de la sensation gustative et de l’odorat. Quant aux caractères macroscopiques, ils ont été définis par l’observation à l’oeil nu de la drogue.
Caractères microscopiques
Technique
Nous avons incorporé une petite quantité de la poudre de drogue dans deux gouttes du réactif universel (réactif du Gazet du Chatelier) déposé sur une lame porte-objet que nous avons recouvert d’une lamelle. Nous avons déposé l’ensemble sur la platine du microscope pour observation à l’objectif 40. Les différents éléments microscopiques ont été identifiés.
Introduire 5 ml d’infusé aqueux à 5% dans un tube à essai. Ajouter 1ml de solution de FeCl3 dilué à 1%. Il se développe une coloration verdâtre ou bleu noirâtre.
La présence de tanins catéchiques est caractérisée en ajoutant 1 ml de HCl concentré dans 5 ml d’infusé. Porter à l’ébullition pendant 10 mn, on obtient un précité rouge.
La différenciation des tanins (catéchique et gallique) est obtenue par la réaction de Stiasny : à 30 ml d’infusé à 5%, ajouter 15 ml de réactif de Stiasny (10 ml de formol à 40%+5 ml d’HCl concentré) et chauffer au bain-marie à 90°C (15 à 20mn).
L’obtention de précipité montre la présence de tanins catéchiques. Filtrer et saturer le filtrat d’acétate de sodium pulvérisé. Ajouter 1 ml de FeCl3 à 1%. Le développement d’une teinte bleu noir indique la présence de tanins galliques.
Flavonoïdes
Les flavonoïdes sont les pigments universels des végétaux responsables de la coloration des fruits, des fleurs et souvent des feuilles. A 5ml d’infusé, ajouter 5ml de H2SO4 puis 5ml de NH4OH. Si la coloration s’accentue par acidification puis vire au bleu violacé en milieu basique, on peut conclure la présence d’anthocyane.
Réactions de la cyanidine
Introduire dans un tube à essai 5ml d’alcool chlorhydrique puis quelques copeaux de Mg et 1 ml d’alcool isoamylique. L’apparition d’une coloration rose orangée (flavones), rose violacée (flavanones) ou rouge (flavonols , flavanonols) rassemblée dans la couche surnageante d’alcool isoamylique indique la présence d’un flavonoïde libre (génine).
Effectuer la réaction de la cyanidine sans ajouter de Mg et chauffer quelques minutes au bain-marie. En présence de leucoanthocyane, il se développe une coloration rouge cerise ou violacée. Les catéchols donnent une teinte brun rouge.
Anthracéniques combinés
O-hétérosides
Prélever 5 ml d’hydrolysât et agiter avec 5 ml de CHCl3. Soutirer la phase organique et l’introduire dans un tube à essai, ajouter 1 ml de NH4OH dilué et Agiter. la présence d’anthraquinones est révélée par la coloration rouge plus ou moins intense. Lorsque la réaction est négative ou faiblement positive, nous pouvons rechercher les O-hétérosides à génines réduites.
Pour réaliser cette recherche nous avons prélevé 5 ml d’hydrolysât et ajouté 3 à 4 gouttes de FeCl3 à 10% puis chauffé pendant 5 mn au bain-marie. Refroidir, agiter avec 5 ml de CHCl3, soutirer la phase chloroformique.
Ajouter 1 ml de NH4OH dilué et agité. En présence de produits d’oxydation des anthranols et anthrones, la coloration rouge est plus intense que précédemment.
Hétérosides
Reprendre la phase aqueuse qui a été conservée par 10 ml d’eau et ajouter 1 ml de FeCl3 à 10%. Maintenir le tube à essai dans le bain-marie bouillant pendant 30 mn, refroidir et agiter avec 5 ml de CHCl3, soutirer la phase chloroformique dans un tube à essai. Ajouter 1 ml de NH4OH dilué et agiter. Une coloration rouge plus ou moins intense indique la présence de génines de C-hétérosides.
Réaction de Brissemoret et Combes : (différenciation des quinones). Introduire 1 g de poudre dans un erlenmeyer de 250ml, humecter avec H2SO4 dilué à 10%. Ajouter 20ml d’un mélange (à volume égal) d’éther et de chloroforme, mélanger et laisser en macération pendant 24 heures. Filtrer et laisser évaporer à l’air 5 ml du filtrat, reprendre le résidu par quelques gouttes d’alcool à 95%. Ajouter goutte à goutte une solution aqueuse d’acétate de nickel à 5%. Selon la nature de la quinone on obtient :
*Benzoquinones : coloration bleue et précipité
*Naphtoquinones : coloration violette et précipité
*Anthraquinones : coloration rouge sans précipité .
Recherche des stérols et triterpènes, des caroténoïdes
Solution à analyser : nous avons introduit dans un tube à essai 1 g de poudre et 20 ml d’éther. Boucher et agiter, laisser pendant 24 heures puis filtrer et compléter à 20 ml par l’éther.
Stérols et triterpènes
Caractérisation
Réaction de Lieberman-Buchard : Evaporer à sec dans une capsule 10 ml d’extrait, dissoudre le résidu dans 1 ml d’anhydride acétique + 1 ml de chloroforme. Recueillir dans 2 tubes à essai (l’un servira de référence). A l’aide d’une pipette, ajouter 1 à 2 ml de H2SO4 concentré au fond du tube (ne pas agiter). A la zone de contact des deux liquides il y a formation d’un anneau rouge brunâtre ou violet, la couche surnageante devenant verte ou violette révèle la présence de stérols et triterpènes.
Les caroténoïdes : Carr et Price
Evaporer 5 ml d’extrait étherique à sec dans une capsule, ajouter 2 à 3 gouttes de solution saturée de SbCl3 ou dans le CCl4. Il se développe une coloration bleue devenant rouge par la suite en cas de réaction positive.
Hétérosides cardiotoniques
Les hétérosides cardiotoniques forment un groupe homogène possédant un intérêt thérapeutique réel. Ils demeurent des médicaments majeurs de l’insuffisance cardiaque.
Solution à analyser : nous avons introduit 1 g de poudre dans un tube à essai, ajouté 10 ml d’éthanol à 60% et 5 ml d’une solution d’acétate neutre de plomb à 10% ; porté au bain-marie bouillant pendant 10 mn ; et filtré sur coton.
Saponosides (indice de mousse)
Les saponosides sont des hétérosides caractérisés par leurs propriétés tensioactives. Le pouvoir hémolytique des saponines est utilisé pour la lutte biologique contre certains animaux à sang froid.
Nous avons réalisé un décocté à 1% que nous avons filtré et ajusté à 100 ml après refroidissement.
Dans une série de 10 tubes à essai numérotés de 1 à 10. Répartir successivement 1 ;2 ;… 10 ml de décocté. Ajuster le volume de chaque tube à 10 ml avec de l’eau distillée.
Agiter chaque tube dans le sens de la longueur, pendant 15 secondes en raison de 2 agitations par seconde. Laisser reposer pendant 15 minutes et mesure la hauteur de mousse dans chaque tube.
Le N° de tube dont la hauteur de mousse est de 1 cm est utilisé pour déterminer l’indice de mousse.
Hétérosides cyanogénétiques
Les hétérosides cyanogénétiques donnent par hydrolyse de l’acide cyanhydrique toxique en fonction de la dose.
Pour leur caractérisation, nous avons introduit dans un tube à essai 1 g de poudre, ajouté 5 ml d’un mélange à volume égal d’eau et de toluène. Nous avons bien agité et nettoyé la partie supérieure du tube (sans tremper dans la solution).
La coloration rouge plus ou moins rapide du papier indique la présence d’hétérosides cyanogénétiques.
Chromatographie sur couche mince (CCM)
Principe : La chromatographie sur couche mince est une méthode de séparation des substances contenues dans un extrait. Les facteurs qui soutiennent cette séparation peuvent être des phénomènes d’adsorption, de partage ou d’échange d’ions ou encore une combinaison des différentes propriétés.
Technique
Solutions à analyser
Nous avons dissout 10mg des extraits éthanoliques dans un 1ml d’un mélange méthanol – eau dans la proportion (1-1). L’ensemble a été bien agité afin d’avoir un mélange homogène.
Dépôt
Sur une plaque de format 10×10 cm, nous avons déposé 10μl de solutions de chacune des deux plantes à l’aide d’une micropipette. Après les dépôts, nous avons séché la plaque à l’aide d’un séchoir avant de cet ensemble a ensuite été introduit dans une cuve de migration pour la séparation.
Migration
Nous avons placé la plaque dans une cuve de développement dans laquelle se trouve un système de solvants appropriés encore appelé phase mobile jusqu’à une hauteur de 0,50 cm environ sans atteindre 1cm. Ainsi, nous avons utilisé le système BAW (60-15-25) pour la migration.
C’est une technique de détermination du pourcentage (%) de corps étrangers. Pour ce faire, nous avons divisé le sac représentatif de chaque lot en trois parties égales (le 1/3 inférieur, le milieu, le 1/3 supérieur ) avec lesquelles nous avons constitué trois tas. Sur chaque tas nous avons prélevé au hasard cinq poignets de matières premières qui sont ensuite regroupés en trois nouveaux tas. Après avoir trié et pesé les corps étrangers de chaque nouveau tas de cinq poignets, de masse préalablement déterminée, nous avons calculé le pourcentage de corps étrangers en rapportant ces valeurs à cent.
Après avoir fait le contrôle macroscopique et la détermination du taux de corps étrangers, les matières premières ont été broyées à l’aide d’un broyeur de Keneya Yiriwa Ton, à Missira en poudre pour Cochlospermum tinctorium et Combretum micranthum et en poudre grossière Entada africana.
Dosages
Nous avons déterminé le pourcentage des cendres : totale, sulfurique, chlorhydrique, teneur en eau et le pourcentage de substances extractibles par l’eau et par éthanol sur les poudres de drogues. Les procédés utilisés sont décrits dans les réactions de caractérisations. Après les tests de contrôle de qualité de nos médicaments, nous avons entamé le conditionnement.
Dosage des cendres et de l’eau
Dosage des cendres totales
Les cendres proviennent des tissus de la plante ou des éléments étrangers (sable, terre…) qui adhèrent à la drogue végétale. Elles sont obtenues par calcination complète de la matière végétale dans l’air.
La teneur est obtenue par dosage pondéral des cendres obtenues par incinération de la drogue végétale dans un four à moufle à 800°C.
Nous avons opéré de la même manière pour la poudre de racines de Entada africana, de feuilles de Combretum micranthum mais pour la poudre de racines de Cochlospermum tinctorium, nous avons fait une digestion dans l’eau à 50°C pendant 15 mn. Pour chacune des plantes nous avons répété cette opération trois fois. Nous avons ensuite déterminé le pourcentage des substances extractibles par l’eau en calculant la moyenne de résultats des trois opérations.
Extraction par l’éthanol 80%
Nous avons fait une macération pendant 15 mn. Nous avons introduit 1g de poudre de racines dans un becher contenant 10 ml d’éthanol 80%. L’ensemble est laissé macérer pendant 15 mn. Après filtration, les extraits éthanoliques ont été évaporés à sec à la température ambiante du laboratoire. A partir de ces extraits secs, nous avons déterminé le pourcentage de substances extractibles par l’éthanol en procédant de la même manière que le procédé d’écrit dans la partie substance extractible par l’eau. Les extraits secs ont ensuite été récupérés avec un peu d’éthanol 80% et réutilisés pour la CCM.
Nous avons opéré de la même manière pour Entada africana et pour Cochlospermum tinctorium et Combretum micranthum.
Conditionnement
Confection des sachets et grands emballage
Les sachets ont été faits à partir de gaines (plastiques transparents, cylindriques), nous avons utilisé trois types de gaines :
– La gaine de 8 cm, destinée à faire les sachets de 10g de poudre des feuilles d’hépatisane et de poudre de racines de Cochlos. Elle est coupée de manière à avoir un sachet de 12 cm de longueur sur 8 cm de largeur.
– La gaine de 17 cm de largeur, destiné à faire des sachets (paquets) pouvant contenir 30 petits sachets de 10 g de Cochlos, de 14 petits sachets de 10 g d’hépatisane, de 7 sachets de 30 g de Samanéré. Cette gaine est découpée de manière à avoir des paquets mesurants 17 cm sur 12cm pour hépatisane, 17 cm sur 16 cm pour Samanéré, 17 cm sur 20 cm pour Cochlos .
– La gaine de 50 cm de largeur destinée à faire les emballages pouvant contenir 20 paquets de chacun des types de médicaments. Cette gaine a été découpée de manière à avoir des emballages de 50 cm sur 65 cm pour le conditionnement des paquets de Samanere et de Cochlos ; des emballages de 50 cm sur 55 cm pour le conditionnement des paquets d’hépatisane.
Après les découpage : les petits sachets, les paquets, les emballages ont été soudés à l’un des deux cotés ouverts par un thermosoudeur et l’autre coté non fermé a servi d’ouverture pour l’introduction des médicaments.
Nous avons commencé par remplir les petits sachets de poudre de drogues. Pour l’hepatisane et pour le Cochlos, nous avons introduit les poudres à l’aide d’une cuillère à café dans les petits sachets de 10g. A chaque deux cuillères, on pose le sachet sur une balance électrique de type MFD préalablement taré du poids du sachet vide et on ajuste à 10g. Pour les petits sachets de Samanere dont la drogue réduite en poudre grossière, nous avons introduit à l’aide de la main dans des petits sachets de 30g ensuite, posé sur la balance du sachet de Samanere et ajusté à 30g.
Après remplissage les petits sachets ont été fermés à l’aide d’une thermosoudeuse.
Les médicaments se présentaient comme suit :
Cochlos : paquet de 30 sachets de 10g
Samanéré : paquet de 7 sachets de 30g
Hépatisane : paquet de 14 sachets de 10g.
Les étiquettes comportaient les informations suivantes :
Composition du médicament, date de péremption, numéro du lot, indication, posologie, DMT/INRSP, mode d’emploi, mention gratuit Enfin, des emballages de 20 paquets ont été réalisés pour chaque médicament .
Gestion du stock des médicaments
Les médicaments sont stockés dans un magasin après le conditionnement. Nous avons démarré l’étude avec un stock suffisant de chaque type de médicament et le stock d’alerte à été fixé à cent (100) traitements afin d’éviter la rupture. Pour chaque type de médicaments, nous avons constitué une fiche de stock qui comporte quatre (4) colonnes : date, entrée, sortie et solde (voir annexe).
Pour contrôler les sorties, nous nous sommes servis du registre de consultation, dans lequel les quantités de médicaments délivrés aux patients sont marquées devant leur nom dans la colonne réservée au nombre de traitements. Chaque fin de journée, nous avons rempli la fiche de stock de chaque type de médicaments.
Dispensation des médicaments
Consentement éclairé
Quand les malades sont venus avec leur fiche de dépistage sur laquelle est marqué l’AgHBs positif ; nous leur avons conduit chez le médecin qui leur a livré à chacun une fiche d’analyse complémentaire relative au bilan hépatique.
Avant de faire ces analyses, nous leur avons fait savoir que nous sommes entrain de faire une étude, un essai clinique de trois médicaments, qui a pour but de chercher à mieux connaître l’efficacité de certains traitements traditionnels des hépatites. Toutes les informations sur ces médicaments ont été fournies auxmalades avant de demander leur consentement éclairé. Nous avons ensuite donné à chaque patient une fiche (voir annexe) sur laquelle toutes les informations relatives à cette étude sont mentionnées pour leur permettre d’en prendre connaissance avant de donner leur consentement.
C’est après qu’ils soient bien éclairés sur les conditions de l’étude que les patients ont volontairement accepté d’en faire partie ou pas.
A partir de cet instant les premières consultations ont été faites et le médecin a attribué à chaque malade un dossier auquel il a joint une copie du formulaire de consentement éclairé signé du malade qui atteste de l’adhésion du patient à l’étude.
Dispensation randomisée des médicaments aux patients inclus dans l’étude
Après les analyses complémentaires, le médecin a délivré à chaque patient un dossier qui est un type de questionnaire de 16 pages comportant l’identité, le numéro relatif à l’ordre d’arrivage et des questions relatives à la clinique et la paraclinique.
Au premier passage, nous avons procédé à un tirage au hasard à fin d’attribuer à chaque patient l’un des Schémas thérapeutiques qui étaient codés sous les dénominatifs de A, B et C. La lettre correspondant au médicament tiré pour chaque patient est portée sur son dossier. Pour chaque patient nous avons enregistré les informations suivantes : nom, prénom, nombre de passage, âge, profession, numéro du dossier, groupe thérapeutique, nombre de traitements, date, passage et l’adresse.
Chaque patient est soumis à son seul type de traitement pendant trois mois. Pendant le premier mois de traitement, les rendez vous ont été hebdomadaire, les deuxième et troisième mois ; chaque deux semaines. A chaque rendez-vous les malades sont passés d’abord chez le médecin pour y être consultés et ensuite ils ont reçu les médicaments nécessaires pour couvrir l’intervalle entre deux passages.
COMMENTAIRES ET DISCUSSIONS
C’est une étude qui vient en complément aux études précédentes qui ont été réalisées sur C.tinctorium et E.africana.
Les résultats sont composés de trois parties :
– les caractères botaniques et physico-chimiques.
– la production et contrôle de qualité des médicaments
– les essais cliniques.
Caractères botaniques, microscopiques et physico-chimiques
L’observation microscopique des poudres de racines a révelé la présence : de grains d’amidon, de groupes de fibre, de fragments d’épiderme, des cristaux d’oxalate de calcium dans les racines de C.tinctorium et de E.africana.
Des groupes de fibre associés au tissu parenchymateux n’ont été présents que dans la racine de C.tinctorium.
Les cellules sclérifiées, les fragments de tissus avec cellules palissadiques dans la racine de E.africana, confirme le résultat trouvé par (Sangaré, 1999).
L’étude phytochimique a consisté en la caractérisation des groupes chimiques suivis des extractions et la CCM.
Les réactions de caractérisation des racines de nos drogues ont permis d’identifier dans les racines de E. africana et C. tinctorium, par coloration ou par précipitation plusieurs groupes chimiques notamment : les flavonoïdes à genines flavaniques, C-héterroside, les tanins, les mucilages, les stérols et triterpènes. Ces résultats confirment ceux reportés par (Kerharo et Adams, 1974 ; Maïga, 1992 ; Placide, 1999).
Les saponosides, les oses et holosides ne sont présents que dans la racine de E.africana. Les caroténoïdes n’ont été retrouvées que dans les racines de C. tinctorium. L’absence des alcaloïdes, des caroténoïdes, des composés réducteurs, des coumarines dans la racine de E.africana sont contraires aux résultats reportés par Kerharo et Adams, 1974 et Maïga, 1992.
L’observation à l’UV et la révélation du chromatogramme obtenu avec les extraits éthanoliques de racines de C. tinctorium et E. africana avec le réactif de Godin ont permis de confirmer la présence de plusieurs composés. Selon Ybert, les tanins permettent de lutter contre les infections et les flavonoïdes ont des propriétés anti-inflammatoires (Ybert et al, 2000). Les flavonoïdes possèdent aussi des propriétés antivirales et antihépatotoxiques (Bhattacharya et Firozi, 1988).
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Table des matières
1 INTRODUCTION
2 MOTIVATIONS
OBJECTIFS
PREMIERE PARTIE
GENERALITES
1 Rappel sur les hépatites
1.1 Epidémiologie
1.2 Physiopathologie
1.2.1 Les virus
1.2.2 Pathologie hépatique
1.2.2.1 Hépatites virales aiguës
1.2.2.2 Hépatites virales chroniques
1.3 Traitements des hépatites virales
1.3.1 Traitement préventif
1.3.2 Traitements curatifs
1.3.2.1 Molécules synthétiques
1.3.2.2 Quelques molécules d’origine végétales
1.3.2.3 Quelques plantes africaines utilisées dans le traitement des hépatites
DEUXIEME PARTIE
TRAVAUX ANTERIEURS
2. Monographie de Cochlospermum tinctorium, Entada africana et Combretum micranthum
2. 1 Cochlospermum tinctorium A. Rich
2. 2 Entada africana (Guill et Perr)
2. 3 Combretum micranthum G. Don
TROISIEME PARTIE
TRAVAUX PERSONNELS
1.METHODOLOGIE
1.1Caractères botaniques
1.1.1 Matériel végétal
1.1.2 Caractères organoleptiques et macroscopiques
1.1.3 Caractères microscopiques
1.2 Réactions générales de caractérisation
1.2.1 Substances polyphénoliques
1.2.2 Dérivés anthracéniques
1.2.3 Recherche des stérols et triterpènes, des caroténoïdes
1.2.4. Hétérosides cardiotoniques
1.2.5 Saponosides (indice de mousse)
1.2.6 Autres caractérisations
1.3 Chromatographie sur couche mince
1.4 Préparation des médicaments à base de C. tinctorium, E. africana, C. micranthum
1.4.1 Contrôle de qualité des matières premières
1.4.2 Conditionnement
1.5 Gestion du stock des médicaments
1.6 Dispensation des médicaments
1.6.1 Consentement éclairé
1.6.2 Schéma thérapeutique
1.6.3 Dispensation randomisée des médicaments aux patients inclus dans l’étude
1.7 Suivi des paramètres biologiques
1.7.1 Population d’étude
1.7.2 Dosages des transaminases et de bilirubine totale Transaminases
1.7.3 Analyse des données
2. Résultats
2.1 Résultats des Caractères botaniques
2.1.1Caractères macroscopiques et organoleptiques
2.2 Résultats des réactions de caractérisations
2.2.1 Réactions en tubes
2.2.2 Chromatographie Sur couche mince
2.3 Résultats de contrôle de qualité des matières premières
2.3.1 Contrôle macroscopique
2.3.2 Dosage
2.3.3 Contrôle microbiologique
2.4 Stock des médicaments
2.5 Présentation des médicaments
2.6 Résultats des paramètres biologiques
2.6.1 Répartition des patients selon le sexe et le type de traitement
2.6.2 Analyse des paramètres biologiques
2.6.3. Analyse des traitements effectués par les patients
2.6.4 Suivi des paramètres biologiques en fonction du temps de traitement
3 COMMENTAIRES ET
DISCUSSIONS
CONCLUSION
RECOMMANDATION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
RESUME
SERMENT DE GALIEN
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