Les halophytes et la salinité 

Les halophytes et la salinité 

MATERIELS ET METHODES

I. Matériel végétal

Les graines expérimentées sont prélevées d’arbustes d’Atriplex (Atriplex halimus L. et Atriplex canescens (Pursh) Nutt. poussant dans des conditions naturelles. Les graines d’Atriplex. halimus L. sont originaires de la ville d’Oran (ravin blanc). Les graines d’Atriplex canescens (Pursh) Nutt. sont prélevées de l’atriplexaie de la région d’El Bayadh, située à 370 km au sud-est d’Oran et à 520 km au sud-ouest d’Alger. Les graines des deux espèces (fig. 14) ont été récoltées à la fin de la période de fructification, soit, en décembre 2006 pour Atriplex canescens (Pursh) Nutt. et décembre 2007 pour Atriplex halimus L.

Caractéristiques Climatiques des régions de provenance des graines.

La région de la population d’Atriplex halimus L. (Ville d’Oran) présente une période humide qui s’étale du mois de janvier au mois de décembre, interrompue par la période sèche allant de mai à octobre. Les pluies sont automno-hivernales avec une quantité moyenne au mois de février, les précipitations atteignent leur maximum au mois de décembre. Le quotient pluviométrique d’Emberger localise la région dans l’étage semi-aride moyen à hiver tempéré. Les précipitations moyennes sont de 400 mm /an.
La région de la population d’Atriplex canescens (Pursh) Nutt. (El Bayadh) bénéficie d’un climat de steppe. La carte climatique de Köppen-Geiger y classe le climat comme étant de type BSk1 . El Bayadh affiche une température annuelle moyenne de 14.2 °C. La moyenne des précipitations annuelles atteints 269 mm. 7 mm font du mois de Juillet le plus sec de l’année. En Avril, les précipitations sont les plus importantes de l’année avec une moyenne de 35 mm

Méthodes

Protocole expérimental

L’expérimentation est réalisée en juin 2009 au bâtiment Botanique de l’Université de Poitiers (France). Les graines des deux espèces sont lavées dans une solution d’hypochlorite de sodium à 1 % pendant 5 mn puis rincées plusieurs fois à l’eau distillée. Le semis est réalisé sur du terreau en alvéoles placées dans la serre.
L’arrosage des graines est effectué à l’eau de robinet et exécuté sous forme de fines gouttelettes afin d’éviter le déchaussement des graines. Des plantules âgées de deux semaines (fig.15) sont repiquées dans des pots de 15 mm de hauteur et 17 mm de diamètre rempli d’un mélange de terreau et de sable (sable de Fontainebleau) aux proportions de V/2V. L’arrosage est à 60 % de la capacité de rétention du substrat soit, 170 ml de solution nutritive (solution Peters professionnelle), à raison de trois fois par semaines jusqu’à l’application du stress salin (Na Cl) soit quatre mois après le semis. La photopériode est de 16 heures et l’humidité relative à 60 %. Enfin, la température oscillait entre 22 et 24° C. Trois traitements salins ont été retenus, 100, 300 et 600 mM.

de solution nutritive.

Le stress est appliqué d’une façon progressive en augmentant la concentration saline de 50 mM-1par jour. Ainsi, trois lots pour chaque espèce sont établis. Chaque lot est composé de deux sous lots : un sous lot regroupant des plantes témoins arrosées à la solution nutritive et un autre regroupant les plantes ayant subi le traitement au sel. Pour des raisons de commodité dans le prélèvement des échantillons, l’application du stress salin est décalée de dix jours entre les deux espèces.
Une fois la concentration saline atteinte, les plantes sont arrosées pendant 30 jours à raison de trois fois par semaines à la solution saline. A la fin du stress, les plantes (fig.16) sont récoltées. Les racines sont séparées des parties aériennes puis lavées à l’eau courante, emballées dans des sacs de congélation et stockées à -20 °C. Des rameaux (tiges et feuilles) sont découpées, enveloppées dans du papier aluminium et déposées dans un congélateur.

Dosage de malondialdéhyde (MDA)

La peroxydation lipidique (fig 17) est estimée par la détermination des teneurs en malondialdéhydes (HERNANDEZ et ALMANSA, 2002) (fig.18) au niveau des racines, des tiges et des feuilles. 50 mg de matière sèche d’échantillons de différents traitements salins sont broyés puis homogénéisés dans 2 ml d’acide trichloracétique (TCA) à 1 %. L’homogénat est centrifugé à 15000 g pendant 10 mn à 4° C. 0,5 ml du surnageant sont mélangés à 1,5 ml d’acide thiobarbiturique (TBA) préparé dans du TCA à 20 % et incubés à 90° C pendant 20 mn. Après l’arrêt de la réaction dans de la glace, les échantillons sont centrifugés à 10000 g X pendant 5 mn. L’absorbance du surnageant est lue à 532 nm. Après avoir soustrait l’absorbance non spécifique à 600 nm, la concentration du MDA est déterminée en utilisant le coefficient d’extinction 155 /Mm/cm.

Extraction et dosage des protéine

 Extraction
L’extraction des protéines brutes se fait en broyant 0,5 g de matière végétale fraîche dans 20 ml de tampon phosphate (50 mM, pH = 7). Le broyage est facilité par l’addition d’une pincée de sable fin (sable de fontainebleau). Après une centrifugation de l’extrait obtenu à froid à 4° C, pendant 15 mn, à 10 000 g X, le surnageant est repris délicatement pour une deuxième centrifugation pendant 5 mn à 13 000 g X.
 Dosage des protéines brutes
Les protéines sont dosées par la méthode de BEARDEN (1978). Elle consiste à mettre dans la cuve du spectrophotomètre 100 l de Triton à 0,1 % au quel on ajoute entre 100 et 300 l d’extrait de l’échantillon, on homogénéise le mélange et on laisse reposer 10 mn. On ajoute à ce mélange entre 700 et 900 l d’eau ultra pure et 1 ml du réactif de BEARDEN. La lecture de la densité optique ( = 595 nm) se fait après 10 mn de réaction. Le blanc contient les mêmes produits à l’exception de l’extrait des protéines qui peut être remplacé soit par le tampon utilisé pour l’extraction soit par l’eau ultra pure.
 Dosage de l’activité peroxydase
L’activité peroxydase est dosée selon la méthode de LEE et KIM (1994) elle consiste à ajouter 1 ml de gaïacol au mélange composé de 1 ml d’extrait enzymatique et 1 ml du substrat formé par le tampon phosphate et l’eau oxygénée (22 l d’H2O2 à 30 %, 0,01 N pour 40 ml de tampon phosphate). L’activité enzymatique est suivie pendants 2 à 3 mn. Les densités optiques ( = 470 nm) sont lues toutes les 15 secondes

Extraction et dosage des sels minéraux

 Extraction
Pour l’extraction des ions inorganique (K+ , Na+ , Ca++ et Mg++), 200 mg des échantillons frais ont été séchés à 80° C pendant 48 h, réduits en poudre très fine et dissouts dans 20 ml d’H Cl à 5 %. Après centrifugation (15 mn à 9000 g X), le surnageant est récupéré puis filtrés au 0,22 µm.

 Dosage par spectrophotométrie de flamme
Ces éléments minéraux sont dosés à L’IC2MP ou Institut de Chimie des Milieux et Matériaux de Poitiers. La méthode utilisée est celle de LAMBERT, 1976. le surnagent obtenu est dilué au 1/25. Pour le dosage du Mg++ et du Ca++, il est impératif d’additionner au surnageant dilué obtenu 250 µl d’une solution de Lanthane à sont dosés par spectrophotométrie de flamme respectivement à 589 nm, 680, et 6 nm. L’étalonnage du spectrophotomètre (fig.19) est réalisé par des solutions de
concentrations croissantes allant de 1 à 5 mg.l-1 à partir d’une solution mère multiéléments de concentration égale à 10 mg.l-1 .

Des teneurs en ces éléments en mg
-1 de P.S sont calculées.
Cet appareil permet l’analyse de la quasi-totalité des éléments du tableau périodique à condition de posséder la lampe à cathode creuse correspondant à l’élément à analyser. La limite de détection se situe en général autour du mg.l-1 , mais elle dépend de l’élément à analyser. Il est possible d’utiliser deux types de flamme : acétylène ou protoxyde d’azote en fonction des éléments à doser.
 Dosage des sels minéraux par le Microscope électronique
(MET) couplé aux rayons X (microanalyse EDX). La microscopie électronique couplée à certains dispositifs (Fig.20), peut servir à quantifier les éléments minéraux.  microscopie électronique classique, c’est-à-dire qu’un flux d’électrons est envoyé sur l’échantillon.
équipé d’un spectromètre à dispersion d’énergie EDAX, d’un détecteur champ sombre annulaire grand angle HAADF, et d’une caméra CCD Gatan. Possibilité d’utiliser un porte-objet chauffant. Cet appareil permet de faire du TEM conventionnel (champ clair), de la Haute Résolution (HREM), de Diffraction, du STEM (HAADF et Bright field), du DARK FIELD (champ sombre) et de l’EDS.
La microscopie électronique à transmission est une technique particulièrement puissante pour la caractérisation physico-chimique des matériaux, elle permet d’obtenir des informations sur la structure, la composition chimique, la morphologie de l’échantillon jusqu’à l’échelle atomique. L’identification et le dosage chimiques des éléments présents sont réalisés à l’aide des techniques spectroscopiques telles que l’analyse par dispersion d’énergie.

Table des matières

DEDICACES
REMERCIEMENTS
LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX
INTRODUCTION 
CHAPITRE I : DONNEES BIBLIOGRAPIQUES
I. Les halophytes et la salinité 
II. Les halophytes et l’environnement 
III. Les halophytes et le stress oxydatif 
IV. La peroxydation lipidique 
1. L’autooxydation des acides gras polyinsaturés (AGPI)
2. Autooxydation des AGPI par l’oxygène triplet (3O2)
 Initiation
 Propagation
 Terminaison
3. Autooxydation des AGPI par l’oxygène singulet (1 O2)
4. Conséquences des peroxydations lipidiques
5. Mécanismes des anti-lipoperoxydations
6. Mécanismes d’action des antioxydants préventifs
 Les chélateurs des métaux
 L’élimination des hydroperoxydes
 Les piégeurs d’oxygène
V. Les atriplex 
1. Anatomie des atriplex
2. Caractéristiques chimiques et biochimiques
3. Caractéristiques moléculaires
4. Atriplex halimus L.
 Atriplex halimus L. et le stress salin
 Atriplex halimus L., stress et environnement
 Atriplex halimus L, stress et ploïdie
 Atriplex halimus L. et santé
 Atriplex canescens (Pursh) Nutt.
VI. Répartition des atriplex 
1. Systématique des atriplex
 Atriplex halimus L.
 Atriplex canescens (Pursh) Nutt.
VII. Etat actuel des recherches 
CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES
I. Matériel végétal 
1. Caractéristiques Climatiques des régions de provenance des graines.
II. Méthodes 
1. Protocole expérimental
2. Dosage de malondialdéhyde (MDA)
3. Extraction et dosage des protéines
 Extraction
 Dosage des protéines brutes
 Dosage de l’activité peroxydase
4. Extraction et dosage des sels minéraux  Extraction
 Dosage par spectrophotométrie de flamme
 Dosage des sels minéraux par le Microscope électronique
(MET) couplé aux rayons X (microanalyse EDX).
 Principe de l’analyse EDX (rappel)
 Méthode
5. Etude anatomique
 Microscopie photonique
 Fixation des racines, tiges et feuilles dans la résine (LRW)
 Méthodes de fixation (PFA)
 Lavages
 Post fixation
 Déshydratation (passage dans des
 Imprégnation : Bains de résine
 Inclusion
 Confection des coupes
 Microscopie électronique (MEB)
 Fixation des échantillons
 Lavage
 Déshydratation
 Point critique (protocole SIMIS)
 Métallisation
CHAITRE III : REPONSES BIOCHIMIQUES, MINERALES ET ANATOMIQUES
I – Réponses biochimiques des plantes a la salinité 
1- Effet du stress salin sur le Malondialdéhyde (MDA)
2 – Effet du stress salin sur les protéines solubles
3 – Effet du sel sur l’activité peroxydase.
II – Réponses minérales des plantes à la salinité 
1. Analyse par spectrophotomètre de flamme
 Le calcium (Ca++)
 Le potassium (K+
 Le sodium (Na+
 Le Magnésium (Mg++)
2. Microanalyse (EDX : energy dispersive X-ray spectrometry) des sels minéraux
III. Réponses anatomiques des deux espèces 
1. Anatomie des organes des deux espèces
 Anatomie des racines
 Anatomie des tiges
 Anatomie des feuilles
2. Effet du stress salin sur les organes des deux espèces
 Effet du stress sur l’anatomie des racines
 Racines d’Atriplex halimus L.
 Racines d’Atriplex canescens (Pursh) Nutt.
 Effet du stress sur l’anatomie des Tiges
 Tiges d’Atriplex halimus L.
 Tiges d’Atriplex canesens (Pursh) Nutt.
 Effet du stress sur l’anatomie des feuilles
 Feuilles d’Atriplex halimus L.
 Feuilles d’Atriplex canescens (Pursh) Nutt. 843. Effet du stress salin sur la surface foliaire
 Surface foliaire d’Atriplex halimus L.
 Surface foliaire d’Atriplex canescens (Pursh) Nutt.
DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE 
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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