Les G-quadruplex d’acides nucléiques

Les G-quadruplex d’acides nucléiques

Généralités 

Définition
Les nucléotides sont les briques constitutives du génome. Fondations des acides nucléiques du vivant que sont l’Acide DésoxyriboNucléique (ADN) et de l’Acide RiboNucléique (ARN), ils sont constitués d’un sucre de type ribose ou 2- désoxyribose, d’un groupement phosphate et d’une base azotée. La structure des principales bases constitutives de l’ADN et de l’ARN ainsi qu’un enchaînement de plusieurs nucléotides formant un brin d’ADN sont présentés sur la Figure 1. La liaison entre nucléotides est une liaison phosphodiester, elle se fait entre le groupement hydroxyle en 3’ d’un nucléotide et le groupement hydroxyle en 5’ du suivant. Une séquence d’ADN se lit de l’extrémité 5’-OH libre vers l’extrémité 3’-OH libre. Les interactions entre les différents nucléotides permettent la structuration des brins. La structure la plus connue est celle de l’ADN double brin permise par les interactions de type liaisons hydrogènes entre les nucléotides deux à deux. Ces liaisons hydrogène se font par appariement sur la face appelée Watson-Crick (en violet sur la Figure 1) . Le Prix Nobel de médecine1 qui a été attribué en 1962 à ces auteurs, sur la base des travaux de Rosalind Franklin a marqué l’importance de cette structure. Ces appariements dits canoniques concernent les interactions entre les bases adénine (A) et thymine (T), cytosine (C) et guanine (G), deux à deux de type A=T et C≡G. L’appariement en double brin d’ADN n’est pas le seul existant cependant. Des appariements de plusieurs types sont connus également, entre des bases non canoniques par exemple ou suivant une face différente de la face WatsonCrick, qui permettent des structurations différentes indispensables au bon fonctionnement d’un organisme vivant. Ce sont ces dernières qui vont nous intéresser plus particulièrement.

En effet, les travaux présentés ci-après portent sur des structures d’acides nucléiques constitués d’assemblages à quatre brins d’ADN ou d’ARN que l’on appelle des G-quadruplex (G4s). On les appelle ainsi car ces assemblages supramoléculaires se forment grâce aux guanines qui interagissent via des liaisons hydrogènes par leur face Hoogsteen (en rose sur la Figure 2a) et non pas Watson-Crick (en violet sur la Figure 2a) pour former ce que l’on appelle un plateau (quartet en anglais) de quatre guanines. On parle aussi de tétrade de guanines. Ces plateaux peuvent se superposer par deux ou par trois par exemple grâce à des interactions de π-stacking entre les surfaces aromatiques des guanines et former un assemblage supramoléculaire (Figure 2b). Au centre de ces structures on retrouve des ions cationiques monovalents, potassium ou sodium, qui stabilisent encore davantage l’ensemble.

Topologie des G4s

Les G4s sont des structures qui présentent un certain polymorphisme illustré sur la Figure 3 . Cette variation de topologie implique plusieurs aspects. On peut citer notamment l’orientation relative des brins impliqués. Par exemple, si tous les brins sont orientés dans le même sens, on parlera d’un G4 parallèle. Si les brins sont orientés dans le même sens que deux à deux, on parlera de G4 antiparallèle. Enfin, si une structure dite 3+1 présente trois brins de même sens et un brin de sens opposé, on parlera de G4 hybride. Il existe des G4s inter et intramoléculaires. La position relative des bases au sein de l’assemblage par rapport aux sucres est également un facteur de polymorphisme. En effet selon que les bases sont placées en position syn ou en position anti, le G4 aura une géométrie différente. On peut également s’intéresser au nombre de nucléotides qui composent les boucles ou encore aux différentes boucles possibles entre les brins etc.  Ainsi des boucles externes (en forme d’hélice) relieront entre eux des brins parallèles tandis que des boucles latérales relieront des brins d’orientation antiparallèles. Les boucles diagonales relient deux brins d’orientation opposées mais diamétralement opposés l’un par rapport à l’autre. Il est intéressant de noter que la taille des boucles a une incidence sur la stabilité et la cinétique de formation des G4s.

Dispersion des G4s dans le génome

Des assemblages de guanine sont connus depuis les années 60 . On les a observés une première fois dans une solution tampon contenant un gel de guanosine 5’ monophosphate. Par la suite, il sera mis en évidence que des assemblages à 4 brins peuvent également se former dans un ADN monobrin contenant des régions à forte proportion de guanine10 en conditions physiologiques.Des séquences riches en guanines existent au sein du génome humain au niveau des chaînes lourdes des immunoglobulines  , de l’ADN ribosomal  ou encore des télomères . Bien qu’il s’agisse de structures dynamiques au sein du vivant, ces G4s peuvent s’avérer être également des structures extrêmement stables . Leur dynamisme in vivo est régulé par des protéines . Des études bio-informatiques montrent qu’il existe chez l’Homme plus de 350 000 séquences susceptibles de former des G4s in vivo  .On peut également remarquer la prévalence de G4s potentiels dans certaines zones bien précises du génome, au niveau des télomères bien sûr mais également au niveau des promoteurs de certains gènes, ce qui suggère que les G4s peuvent jouer un rôle à différentes étapes de la transcription de ces gènes .

Les séquences contenant des G4s sont également très largement conservées dans le vivant aussi bien chez les procaryotes que chez les eucaryotes, ce qui confirme leur importance pour certaines fonctions biologiques . Pour réaliser ces fonctions au niveau de l’ADN, les G4s doivent pouvoir se former. Cependant, pour que cela se produise, l’ADN doit se trouver sous la forme simple brin, ce qui ne se produit qu’à certaines occasions particulières (réplication, transcription). La plupart du temps, l’ADN est condensé pour pouvoir être contenu dans une cellule procaryote ou dans le noyau des cellules eucaryotes. Cette structure condensée porte un nom, Il s’agit de la chromatine. L’élément constitutif de la chromatine est appelé nucléosome, qui est lui-même formé par un assemblage de huit histones. Une histone est une protéine autour de laquelle s’enroule la molécule d’ADN, lui donnant ainsi un aspect dit en collier de perles. Il existe deux types de chromatine durant l’interphase cellulaire. On parle d’hétérochromatine lorsque celle-ci est extrêmement condensée et d’euchromatine lorsqu’elle l’est peu. L’hétérochromatine, en effet, contient peu de régions transcrites, majoritairement des séquences répétées ayant un rôle structural comme les centromères ou les télomères. L’euchromatine, en revanche, est relativement accessible à la machinerie cellulaire de transcription lors de l’interphase. Elle contient la majorité des gènes transcrits. Ce n’est que lorsque l’ADN est sous sa forme monocaténaire qu’il est susceptible de former ou non des G4s, ce qui renforce l’idée d’un rôle transcriptionnel de ces structures.

En résumé, les G4s sont des structures dynamiques qui se forment dans des régions du génome riches en guanine comme par exemple les régions des promoteurs ou les télomères. Du fait de leur localisation non aléatoire et de la forte conservation des séquences contenant des G4s, il est supposé une pression de conservations de ces assemblages aussi bien que des rôles majeurs dans plusieurs fonctions biologiques, notamment durant la transcription ou la division cellulaire .

Table des matières

INTRODUCTION
REFERENCES DE L’INTRODUCTION
CHAPITRE 1
I. Les G-quadruplex d’acides nucléiques
I. 1. Généralités
I. 1. i. Définition
I. 1. ii. Topologie des G4s
I. 1. iii. Dispersion des G4s dans le génome
I. 2. Rôles des G4s dans le vivant chez l’Homme et les pathogènes non viraux
I. 2. i. Chez l’Homme
I. 2. ii. Rôles des G4s chez les micro-organismes non viraux
I. 3. Intérêt thérapeutique des G4s
I. 3. i. Dans le traitement des cancers
I. 3. ii. Les G4s comme aptamères
I. 3. iii. Les G4 comme transporteurs
I. 3. iv. Les G4s comme cibles d’antibiotiques ou agents antimicrobiens
II. Rôles et intérêt thérapeutique des G4s chez les virus
II. 1. Rôles des G4s chez les virus
II. 1. i. Cycle viral
II. 1. ii. Les G4s et le phénomène de latence
II. 2. Intérêt thérapeutique des G4s
III. Ligands de structures G quadruplex
III. 1. BRACO-19
III. 2. Les dérivés du pérylène et du naphtalène
III. 3. Les dérivés bisquinolinium
III. 3. i. La pyridostatine
III. 3. ii. Les phenanthrolines
IV. Méthodes pour l’étude des interactions ligand /G4
IV. 1. Méthodes structurales
IV. 1. i. La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
IV. 1. ii. La diffraction aux rayons X (RX)
IV. 2. Méthodes indirectes
IV. 2. i. Le Dichroïsme Circulaire (CD)
IV. 2. ii. Förster Energy Transfert (FRET)
IV. 2. iii. Fluorescence Intercalator Displacement (FID)
IV. 2. iv. La chromatographie d’affinité
IV. 2. v. La spectroscopie UV-visible
IV. 3. Méthodes quantitatives
IV. 3. i. La Résonance Plasmonique de Surface (SPR)
IV. 3. ii. La Titration Calométrique Isotherme (ITC)
IV. 3. iii. La spectrométrie de masse
IV. 4. Méthode enzymatique : l’inhibition de la télomérase
V. Les porphyrines
V. 1. Les porphyrines chez l’Homme
V. 1. i. L’hémoglobine
V. 1. ii. Les protéines héminiques
V. 2. Les porphyrines en tant que molécules thérapeutiques
V. 2. i. Usages des porphyrines en tant que molécules anticancéreuses
V. 2. ii. Porphyrines antivirales
V. 3. Les porphyrines comme ligand de G4s
V. 4. Les travaux antérieurs du groupe
V. 4. i. Les porphyrines cationiques
V. 4. ii. Les résultats biologiques
RÉFÉRENCES DU CHAPITRE 1
CHAPITRE 2
I. Introduction
II. Principes généraux de synthèse des porphyrines
II. 1. Méthode dite « mixed aldehydes » et mécanisme
II. 2. Purification des porphyrines
III. Synthèse des porphyrines
III. 1. Stratégie de départ
III. 1. i. La porphyrine 5-(4-bromophenyl)-10,15,20-tris[4-(pyridin-2-yl)phenyl]porphyrin 4
III. 1. ii. Mise au point des conditions du couplage de Suzuki-Miyaura
III. 1. iii. Mise en place des conditions d’alkylation
III. 2. Stratégies potentielles
III. 2. i. Le couplage de Buchwald-Hartwig
III. 2. ii. La synthèse d’aldéhydes fonctionnalisés
III. 2. iii. Le retour au couplage de Suzuki-Miyaura mais en conditions aqueuses
III. 3. Stratégie finale
III. 3. i. Synthèse du précurseur fonctionnalisé par un bras COOH : Au(MA)3COOH
III. 3. ii. Synthèse du composé biotinylé : Au(MA)3biotine
IV. Etude de la relation structure/affinité pour les G4s à l’aide d’une série de porphyrines
IV. 1. Les porphyrines synthétisées
IV. 1. i. La porphyrine Au(MA)2Br2
IV. 1. ii. La porphyrine Au(MA)3Br
IV. 1. iii. La porphyrine Au(MA4)4
IV. 1. iv. La porphyrine Au(MA)3MA4
IV. 2. Méthylation des groupements pyridines
IV. 3. Métallation
V. Relation structure/affinité pour les G4s : tests de FRET melting
V. 1. Principe du FRET melting
V. 2. Résultats des tests de FRET melting
V. 2. i. FRET sur l’oligonucléotide F21T
V. 2. ii. Essais de compétitions entre l’ADN G-quadruplex F21T et l’ADN duplex
VI. Conclusion du chapitre
REFERENCES DU CHAPITRE 2
CHAPITRE 3
I. Les méthodes de calcul de l’énergie libre de liaison
I. 1. Les fonctions de score
I. 2. Les méthodes basées sur les calculs de dynamique moléculaire
II. Conception d’un cycle thermodynamique permettant de calculer l’énergie libre absolue de liaison
II. 1. Les contraintes de position
II. 2. Mise en place des états intermédiaires
II. 3. Les porphyrines d’or(III)
II. 3. i. Validation de la méthode
II. 3. ii. Résultats
III. La modélisation de nouvelles porphyrines vers la synthèse de meilleurs dérivés
III. 1. Modélisation de nouvelles porphyrines
III. 1. i. Les porphyrines fluorées
III. 1. ii. Des composés aux 2-pyridinium substitués
III. 2. Les essais de synthèses
III. 2. i. La porphyrine « Fenyl » 19
III. 2. ii. La porphyrine « Fyrrole »
III. 2. iii. La porphyrine « PGF »
III. 2. iv. La rétrosynthèse proposée de AuMA NpNO2
IV. Conclusion du chapitre
RÉFÉRENCES DU CHAPITRE 3
MATERIEL ET MÉTHODES
I. Matériels et produits
II. Expériences de FRET
III. Spectroscopie UV-Vis
IV. Synthèse des composés
V. Modélisation Moléculaire
REFERENCES DE LA PARTIE MATERIEL & METHODES
CONCLUSION

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