LES EXOPOLYSACCHARIDES D’ORIGINE MICROBIENNE

LES EXOPOLYSACCHARIDES D’ORIGINE MICROBIENNE

Les propriétés fonctionnelles des polysaccharides

La fermeté, la consistance et la capacité de rétention d’eau sont des caractéristiques importantes dans beaucoup de produits laitiers comme le yaourt. La rhéologie ou le pouvoir gélifiant des EPS sont les caractères les plus recherché dans certaines fabrications, et qui influence la fermeté des produits laitiers, il a été constaté que la fermeté du produits est réduite par la production des EPS (Laws et Marshall 2001; Marshall et Rawson 1999). Même si la contribution des EPS à la viscosité des laits fermentés est une supposition généralement acceptée, il n’y a pas de corrélation claire entre la viscosité des laits fermentés et la concentration en EPS (Wacher-Rodarte et al. 1993). Il est évident qu’en obtenant une viscosité élevée, le poids moléculaire devrait être élevé et la chaîne devrait être relativement rigide (Jolly et al. 2002). Ceci a été démontré par Faber et al. (2001a), qui ont obtenu deux EPS différents avec les mêmes unités répétitives mais avec différents poids moléculaires. L’EPS qui avait un haut poids moléculaire était plus visqueux. Les polysaccharides produits par différentes LAB montrent des variations dans la composition, la charge, l’arrangement spatial, la rigidité et l’habilité à interagir avec des protéines ou avec d’autres constituants (Duboc et Mollet 2001, Jolly et al. 2001).

La rigidité et la ramification de la chaîne d’EPS influencent les propriétés rhéologiques du lait fermenté. Un EPS est considéré rigide si sa chaîne présente une mobilité réduite autour de certaines liaisons. Ainsi, les liens β (1-4) donnent une plus grande rigidité à la chaîne comparé aux liens β (1-2) et β (1-3); alors que les liens α donnent des chaînes plus flexibles que les liens β (Laws and Marshall 2001, Tuinier, et al. 1999b). Les polysaccharides rigides ont tendance à s’étendre en solution et occuper un volume plus grand que les polysaccharides flexibles qui sont capables de se compacter et ainsi occuper un petit volume dans la solution (Whistler and BeMiller 1997). Tuinier et al. (2001) ont aussi rapporté que les chaînes latérales ou ramifications de l’EPS empêchent l’orientation de sa chaîne principale augmentant ainsi sa rigidité. Une corrélation positive a été aussi mise en évidence, par les mêmes auteurs, entre la rigidité de la chaîne et la viscosité intrinsèque des EPS produits par Lactococcus subsp. cremoris B39 et Lactococcus subsp. cremoris B891.

Domaine agroalimentaire

Le curdlane est un 1,3-β-glucane d’une taille moléculaire d’environ 74 kDa produit par les bactéries du genre Agrobacterium et Rhizobium. Il est soluble dans de l’eau froide et forme un gel faible après chauffage au-dessus de 55°C. La fermeté du gel est augmentée avec un chauffage à plus haute température. Ces gels ont des propriétés se situant entre l’élasticité de la gélatine et la fragilité de l’agar et ils montrent une bonne capacité de rétention d’eau. À cause de ces propriétés, le curdlane est utilisé au Japon pour améliorer et modifier la texture des aliments comme le tofu, les pâtes de poisson et les gels de fèves (Sutherland 1998). Le pullulane est un α-D-glucane avec des liaisons α-1,6 linéaires, incluant des molécules de maltotriose et maltotétraose liées α-1,4, et ayant une très bonne solubilité dans l’eau ainsi qu’en présence d’ions. Ce polysaccharide, synthétisé par Aureobasidium pullulans, est utilisé au Japon comme film d’emballage alimentaire. Une solution du polymère peut être appliquée directement sur l’aliment et former une couche sans odeur et sans goût (Sutherland 1998). Le gellane est un polymère linéaire de 500 kDa, composé d’une unité répétitive de quatre monomères avec des groupements O-acétyle et glycéryl. Produit par Sphingomonas paucimobilis, il forme dans sa forme native des gels faibles, élastiques et thermoréversibles. Il peut former des gels avec une vaste gamme de propriétés par un contrôle du degré de l’acylation. Ce polymère est permis comme additif alimentaire aux États Unis et en Europe et commercialisé sous le nom de Kelogen® et Gelrite®. Le gel est caractérisé par une bonne saveur et est stable sur une vaste gamme de valeurs de pH. Ce polymère est aussi utilisé pour remplacer l’agar dans les milieux de culture microbiologiques et il est utilisé comme agent gélifiant dans des produits cosmétiques (Sutherland 1998).

Le xanthane est sans doute le vaisseau amiral parmi les EPS commercialisés et il est permis comme additif alimentaire aux États Unis et en Europe depuis longtemps. Il est synthétisé par Xanthomonas campestris et se compose d’une unité répétitive pentasaccharidique, une épine dorsale cellulosique avec une ramification tri-saccharidique contenant le mannose, l’acide gluconique, l’acétate et le pyruvate. Le degré de ramification et d’acylation peut différer selon la souche productrice et donner au produit des caractéristiques différentes. En général, le xanthane se dissout très bien dans l’eau et ses solutions sont pseudoplastiques. Il peut être utilisé dans une vaste gamme d’aliments, car il est compatible avec la plupart des autres ingrédients alimentaires, tel que les protéines, les lipides et les autres polysaccharides. De plus, il est stable dans des conditions acides, ce qui est important dans plusieurs produits comme les vinaigrettes ou le yoghourt. Le xanthane est souvent utilisé en combinaison avec d’autres polysaccharides, comme la gomme de caroube, à cause de l’effet synergique entre ces polymères. Un mélange de deux polymères forme un gel très stable, bien que chaque polymère seul ne gélifie pas. Finalement, la production d’EPS par des souches de bactéries lactiques utilisées par l’industrie laitière permet d’améliorer la texture et la viscosité des produits fermentés (Stephen et Chumis, 1995).

Héparinomimétiques et analogues de glycosaminoglycanes

L’utilisation des EPS comme principes actifs concerne principalement les polymères de faibles masses molaires qui possèdent des activités dans le domaine cardiovasculaire ou de la cancérologie par exemple. Des dizaines de nouvelles structures d’EPS sont découvertes et décrites chaque année, ce qui représente un potentiel croissant de molécules innovantes. Mais les monosaccharides les plus fréquemment rencontrés chez les EPS sont les mêmes que ceux des polysaccharides de cellules eucaryotes. La probabilité d’identifier des homologues structuraux est faible mais quelques exemples montrent qu’en combinant la chimie ou l’enzymologie avec la sélection de souches appropriées, il est possible de préparer des molécules semblables à l’héparine. La bactérie Streptococcus zooepidemicus produit un polymère d’acide hyaluronique dont l’unité répétitive est identique à celle de l’acide hyaluronique produite par les mammifères. L’unité répétitive de ce polysaccharide est constituée du disaccharide. Des mutants ne possédant pas de hyaluronidase ont été développés afin d’obtenir des chaînes de haut poids moléculaire.

Cet acide hyaluronique bactérien est actuellement utilisé en remplacement du produit naturel en chirurgie ophtalmique (Vandamme, 1994) et en cosmétique. Sa compatibilité avec le système immunitaire humain prouve la similitude entre le produit bactérien et celui issu des cellules eucaryotes (Sutherland, 1998). L’acide hyaluronique est également employé pour améliorer la biocompatibilité des prothèses. Les chaînes utilisées sont généralement de haute masse molaire pour ne pas être dégradées trop rapidement. D’autres applications potentielles concernant l’emploi d’acide hyaluronique bactérien sur des implants chirurgicaux pour éviter les phénomènes d’adhésions postopératoires, sont envisagées. Les polysaccharides capsulaires d’Escherichia coli sont généralement antigéniques et fréquemment associés aux infections urinaires. Mais l’EPS de la souche K5 d’E. coli possède une unité répétitive composée d’acide β-D-Glucuronique lié en 1→4 à de l’α- Nacétylglucosamine très peu immunogène chez l’homme. Ce polymère acide a la même structure qu’un précurseur de l’héparine, le N-acétylhéparosane et peut donc servir de substrat pour les enzymes impliquées dans la biosynthèse de l’héparine. Lors d’une approche combinant la chimie et l’enzymologie, des produits présentant une structure et des propriétés biologiques se situant entre l’héparane sulfate et l’héparine ont pu être synthétisés (Casu et al., 1994). La souche E. coli K4 produit un polymère possédant un squelette chondroïtine auquel des résidus β-D-fructofuranosyl sont liés au C3 de l’acide glucuronique. Cette ramification peut être enlevée par hydrolyse acide ménagée pour donner un composé reconnu par la hyaluronidase et la chondroïtinase.

Vaccins polysaccharidiques Quelques bactéries pathogènes présentent des polysaccharides à leur surface qui sont les principaux responsables de la réponse immunitaire lors d’une infection. L’analyse structurale de ces polysaccharides a montré que leur nombre était réduit. Il est possible d’évaluer ces polymères pour montrer qu’ils sont des vaccins potentiels (Sutherland, 1990). L’antigénicité de ces polysaccharides dépend de leurs compositions osidiques, de leurs masses molaires et de leurs conformations en solution. La réponse des anticorps est donc spécifique d’une structure osidique donnée pour une espèce bactérienne précise. La préparation de vaccins à partir d’exopolysaccharides pose quelques difficultés. En effet, les bactéries à Gram négatif présentent des lipopolysaccharides sur leurs parois externes. Leur présence, même en faible quantité, dans des solutions destinées à la vaccination peut provoquer des effets indésirables (pyrétogène). Par ailleurs les polysaccharides sont généralement peu immunogènes chez l’homme, probablement à cause d’homologies de structure avec les polysaccharides du soi. Des motifs riches en acide sialique sont à la fois présents dans les polysaccharides bactériens et dans certains glycolipides des animaux supérieurs. Les solutions envisagées constituent à modifier les polysaccharides bactériens en les couplant à des protéines de transport ou des toxines ou à réduire leur masse moléculaire. Les vaccins actuellement sur le marché concernent par exemple les sérogroupes A, C et Y de méningocoques ou les vaccins multivalents pour Streptococcus pneumoniae.

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE 1. ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
I.LES EXOPOLYSACCHARIDES D’ORIGINE MICROBIENNE
1.Définition
2.Les microorganismes producteurs des exopolysaccharides
3.Les exopolysaccharides des bactéries lactiques
4.Composition chimique et structure des exopolysaccharides des bactéries lactiques
5.Classification des exopolysaccharides
5.1.Les homopolysaccharides
5.2.Les hétéropolysaccharides
6.La biosynthèse des EPS
6.1.Les enzymes de biosynthèse
6.2.Voie de synthèse extracellulaire des exopolysaccharides
7.Applications industrielles des exopolysaccharides microbiens
7.1.Intérêt et utilisation des exopolysaccharides
7.1.1. Les propriétés fonctionnelles des polysaccharides
7.2.Applications industrielles
7.2.1. Domaine agroalimentaire
7.2.2. Domaine médical
7.2.3. Domaine thérapeutique et santé
II.LE DEXTRANE
1.La découverte du dextrane
2.Définition et structure du dextrane
3.Les bactéries productrices
3.1.Le genre Leuconostoc
3.1.1.Définition et caractères bactériologiques
3.1.2.Habitat des Leuconostocs
4.La biosynthèse du dextrane
5.Milieux de culture utilisés
6.Applications et utilisations du dextrane
6.1.En agroalimentaire
6.2.En biomédicale
III.METHODES D’ANALYSES DES EXOPOLYSACCHARIDES
1.Méthodes de détection et de screening des EPS
1.1.Examen visuel
1.2.Les colorations
2.Extraction et purification des EPS
3.Dosage colorimétrique des EPS purifiés
4.Etude de la viscosité
5.Méthodes de caractérisation et analyses des exopolysaccharides
5.1.Caractérisation des EPS à l’échelle chromatographique
5.2.Détermination structurale des exopolysaccharides
5.2.1.Analyse par infrarouge
5.2.2.Analyses par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
TAXONOMIE MOLECULAIRE ET IDENTIFICATION BACTERIENNE
1.Microbiologie « classique »
2.Apport de la biologie moléculaire
2.1.Identification bactérienne par l’amplification de l’ADNr 16S
2.1.1.Amplification par PCR (réaction de polymérisation en chaine)
2.1.2.Le choix de l’ADNr 16S
2.2.Séquençage de l’ADNr 16S
2.3.Analyse phylogénétique des séquences
2.4.Identification bactérienne avec des amorces spécifiques (amplification génique)
3.Taxonomie moléculaire et classification du genre Leuconostoc
3.1.Classification du genre Leuconostoc
3.2.Diagnostic moléculaire des Leuconostocs par amplification génique
3.3.L’analyse phylogénétique des différentes espèces de Leuconostoc
3.4.Gène d’intérêt de la glycosyltransférase (GTF) chez les Leuconostoc
CHAPITRE II. MATERIELS ET METHODES
I.Isolement des souches bactériennes productrices des Exopolysaccharides
1.Échantillonnage et conditions de croissance
1.1.Échantillonnage d’origine animalier et végétal
1.2.Isolement et purification des souches
2.Caractérisation phénotypique des isolats
2.1.Examen macroscopique
2.2.Examen microscopique
2.3.Test de la catalase
2.4.Croissance à différentes températures
2.5La tolérance à la salinité
3.Criblage des souches productrices d’exopolysaccharides
II.IDENTIFICATION MOLECULAIRE DES SOUCHES ISOLEES
1.Extraction de l’ADN génomique des souches bactériennes sélectionnées
1.1.Extraction d’ADN génomique par la méthode conventionnelle
1.2.Extraction d’ADN par la méthode de boiling
1.3.Dosage et évaluation de la pureté de l’ADN
1.4.Vérification qualitatif de l’ADN extrait
2.PCR spécifique au genre Leuconostoc sp
3.Amplification du gène d’ADNr 16S
4.Electrophorèse sur gel d’agarose
5.Séquençage des produits de la PCR
6.Traitement et analyse phylogénétique des séquences
6.1Nettoyage et assemblage des séquences
6.2.L’alignement et analyse bio-informatique des séquences d’ADN
6.3.Analyse phylogénétique
7.Recherche du gène Glucosyltransferase (GTF)
III.CARACTERISATION DES EXOPOLYSACCHARIDES PRODUITS
1.Production des EPS
2.Extraction des EPS
3.Lyophilisation des EPS
4.Dosages des sucres totaux
5.Détermination de la viscosité apparente
6.Caractérisation chimique et structurale des EPS
6.1.Analyse de la composition des EPS
6.1.1.Hydrolyse des EPS
6.1.2.Chromatographie sur couche mine
6.2.Analyse de la structure des EPS
6.2.1.Analyse des EPS par spectroscopie infrarouge (IR)
6.2.2.Analyse par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)
CHAPITRE III. RESULTATS ET DISCUSSION
I.ISOLEMENT DES SOUCHES BACTERIENNES PRODUCTRICES DES EPS
1.Caractérisation phénotypique des isolats
2.Criblage des souches potentiellement productrices des EPS
II.IDENTIFICATION MOLECULAIRE DES SOUCHES
1.PCR spécifique au genre Leuconostoc sp
2.Amplification de l’ADNr 16S
3.Traitement et analyse phylogénétique des séquences
3.1.Traitement et nettoyage des séquences
3.2.Analyse des séquences par le Blast
3.3.Elaboration des arbres phylogéniques
4.Recherche du gène impliqué dans la biosynthèse du dextrane
III.CARACTERISATION DES EXOPOLYSACCHARIDES PRODUITS
1.Production des EPS
2.Extraction et lyophilisation des exopolysaccharides
3.Dosage des sucres totaux
4.Détermination de la viscosité apparente
5.Caractérisation structurale des EPS
5.1.Chromatographie sur couche mince
5.2.Résultats des analyses par spectroscopie infrarouge des EPS
5.2.Résultats des analyses par spectroscopie infrarouge des EPS
5.3.Analyse des EPS par RMN
5.3.1.Résultats d’analyse par RMN H1
5.3.2.Résultats d’analyse des EPS par RMN C
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE

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